JP2008136389A

JP2008136389A - アップルモザイクウイルスの検出方法、検出用プライマーセット及び検出用キット

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Publication number: JP2008136389A
Application number: JP2006324371A
Authority: JP
Inventors: Yukio Okada; 行夫岡田; Yutaka Itoga; 裕糸賀
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 2006-11-30
Filing date: 2006-11-30
Publication date: 2008-06-19
Also published as: EP2090653A4; NZ578031A; CN101563452A; WO2008066002A1; EP2090653B1; CN101563452B; EP2090653A1; ATE522606T1; US20100143909A1

Abstract

【課題】アップルモザイクウイルスを検出する抗体の性能（力価及び特異性）、検体数及び評価を行う場所を選ばず、栽培時・収穫時・保管時等のあらゆる季節において、アップルモザイクウイルスを特異的かつ高感度に検出する方法を提供する。
【解決手段】検体からアップルモザイクウイルスのＲＮＡを抽出する抽出ステップと、特定な塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、このＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＬＡＭＰ法によってｃＤＮＡの増幅反応を行う増幅ステップと、特定な塩基配列を含有するｃＤＮＡの増幅が増幅ステップで認められた場合にアップルモザイクウイルスが存在すると判断する判断ステップと、を含む検出方法。
【選択図】なし

Description

アップルモザイクウイルスの検出方法、検出用プライマーセット及び検出用キットに関する。

アップルモザイクウイルスは、ブロモウイルス属に属する植物病原性ウイルスであり、ホップ（ＨｕｍｕｌｕｓｌｕｐｕｌｕｓＬ．）及びリンゴ（ＭａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａＭａｌｕｓ）に広く感染する。アップルモザイクウイルスがホップ及びリンゴに一度感染すると、主に機械的接触によって伝播し、感染被害が拡大する。

ドイツ、アメリカ、イギリス及びチェコ等のホップの主要生産国並びに日本では、アップルモザイクウイルスによる感染被害を防ぐため、茎頂培養によって生産したウイルスフリー苗を用いてホップの栽培が行われている。

ホップを栽培している農場では、アップルモザイクウイルスの感染調査が定期的に行われ、アップルモザイクウイルスの二次感染を防いでいる。アップルモザイクウイルスの感染調査は、ホップに感染しているアップルモザイクウイルスをＥＬＩＳＡ法で検出するのが一般的である。

ＥＬＩＳＡ法によるアップルモザイクウイルスの検出方法は、アップルモザイクウイルスを特異的に認識する一次抗体が固相されたマイクロプレート中で、検体に含まれるアップルモザイクウイルス粒子と一次抗体とを反応させるステップと、一次抗体に結合しなかった検体中の成分を洗浄するステップと、一次抗体と結合したアップルモザイクウイルス粒子と、酵素標識され、かつ、アップルモザイクウイルスを特異的に認識する二次抗体とを反応させるステップと、アップルモザイクウイルス粒子に結合しなかった二次抗体を洗浄するステップと、ニ次抗体に標識されている酵素と化学発色基質又は化学発光基質とを酵素反応させるステップと、酵素反応によって得られた発色又は発光の強さからアップルモザイクウイルス粒子の量を見積もるステップと、から構成される。

Ｐｅｔｈｙｂｒｉｄｇｅら、２００４年、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｒｅｓｅａｒｃｈ、５５巻、ｐ．７６５−７７０

しかしながら、ＥＬＩＳＡ法で使用するアップルモザイクウイルスを認識する抗体の力価や特異性が不十分な場合には、検体中に存在するアップルモザイクウイルス以外の成分の影響を受けるため、アップルモザイクウイルスの存在を示すシグナルをバックグラウンドのシグナルとして評価したり、非特異的な結合をアップルモザイクウイルスの存在を示すシグナルとして評価したりすることが生じる。

また、ＥＬＩＳＡ法によるアップルモザイクウイルスの検出方法は、上記の通り複数のステップから構成されており、各ステップは実験室で反応時間及び洗浄回数等を決めて同じ条件で作業する必要があるが、検体数が増加した場合には、各ステップでの作業は煩雑となり、正確な評価に支障をきたす傾向がある。

さらに、ＥＬＩＳＡ法は、ウイルス粒子そのものをターゲットとして検出する方法であるため、ウイルスゲノム又は宿主ゲノムに組み込まれたプロウイルスを検出することはできず、例えば、高温のためにアップルモザイクウイルス粒子の含有量が著しく低下することが知られている夏季には、アップルモザイクウイルスに感染されているホップであっても擬陽性又は未検出と判断される場合がある。

そこで本発明の目的は、上記の問題点に鑑み、アップルモザイクウイルスを検出する抗体の性能（力価及び特異性）、検体数及び評価を行う場所を選ばず、栽培時・収穫時・保管時等のあらゆる季節において、アップルモザイクウイルスを特異的かつ高感度に検出する方法を提供することにある。本発明の目的はまた、この方法に使用するアップルモザイクウイルスの検出用プライマーセット及び検出用キットを提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明は、アップルモザイクウイルスの検出方法であって、検体からアップルモザイクウイルスのＲＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、このＲＮＡを鋳型にＲｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ−ＬＡＭＰ）法によってｃＤＮＡの増幅反応を行う増幅ステップと、配列表の配列番号８で示される塩基配列を含有するｃＤＮＡの増幅が増幅ステップで認められた場合にアップルモザイクウイルスが存在すると判断する判断ステップと、を含む検出方法を提供する。

本発明者らは、等温の遺伝子増幅反応であるＲｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（以下、ＲＴ−ＬＡＭＰ法）を利用し、アップルモザイクウイルスのコートタンパク質遺伝子の特定の領域を増幅することにより、アップルモザイクウイルスの検出を簡易かつ高感度に行い得ることを見出した。ここで、「ＲＴ−ＬＡＭＰ法」とは、逆転写反応とＬＡＭＰ法による等温遺伝子増幅反応が組み合わされ、ＲＮＡを鋳型にこれに相補的なｃＤＮＡを増幅する方法である。原理の詳細部分については、国際公開第００／２８０８２号パンフレットに記載されている。

上記検出方法に従って、アップルモザイクウイルスの感染の有無を調べたいホップの組織からＲＮＡを抽出し、その抽出液に配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを加えてＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応を行えば、アップルモザイクウイルスのゲノムＲＮＡの一部配列のｃＤＮＡを簡易かつ高感度に検出することが可能となり、アップルモザイクウイルスの感染の有無を判断できる。

また、配列表の配列番号８で示される塩基配列に相補的なアップルモザイクウイルスのゲノムＲＮＡの塩基配列及び配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドがそれぞれアニールするアップルモザイクウイルスのゲノムＲＮＡの塩基配列は、アップルモザイクウイルスのコートタンパク質遺伝子の一部配列であり、これらの塩基配列を含有するアップルモザイクウイルスのゲノムＲＮＡの領域は、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によってｃＤＮＡを増幅するための標的領域として適している。このため、増幅されたｃＤＮＡの有無を確認することによって、アップルモザイクウイルスの有無を特異的に検出できる。

上記プライマーセットは、配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットであることがより好ましい。

配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドに、配列表の配列番号５及び６で示される塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチドをＬｏｏｐＰｒｉｍｅｒとして加えてｃＤＮＡの増幅反応を行えば、ＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となるため、増幅時間を短縮でき、より効率的なアップルモザイクウイルスの検出が可能となる。

また本発明は、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチド又は配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のオリゴヌクレオチド、を含むアップルモザイクウイルスの検出用プライマーセットを提供する。

アップルモザイクウイルスの感染の有無を調べたいホップの組織からＲＮＡを抽出し、その抽出液に上記プライマーセットを加えてＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応を行えば、アップルモザイクウイルスのゲノムＲＮＡの一部配列のｃＤＮＡを簡易かつ高感度に検出することが可能となり、アップルモザイクウイルスの感染の有無を判断できる。

また本発明は、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチド又は配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のオリゴヌクレオチド、からなるアップルモザイクウイルスの検出用プライマーセット、逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含むアップルモザイクウイルスの検出用キットを提供する。

上記検出用キットがあれば、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるアップルモザイクウイルスの検出に必要な試薬を同時に入手することが可能であり、例えば、野外でアップルモザイクウイルスの検出を行なう場合であっても、試薬の濃度調製等の煩雑な作業が不要となり、簡易にアップルモザイクウイルスの検出を行なうことができる。

本発明によれば、検体数及び評価を行う場所を選ばず、栽培時・収穫時・保管時等のあらゆる季節において、アップルモザイクウイルスを特異的かつ高感度に検出することができる。また、本発明のアップルモザイクウイルスの検出用プライマーセット及び検出用キットは、ＲＴ−ＬＡＭＰ法に好適に使用でき、アップルモザイクウイルスの簡易かつ高感度な検出を可能にする。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。

本発明のアップルモザイクウイルスの検出方法は、検体からアップルモザイクウイルスのＲＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、このＲＮＡを鋳型にＲｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ−ＬＡＭＰ）法によってｃＤＮＡの増幅反応を行う増幅ステップと、配列表の配列番号８で示される塩基配列を含有するｃＤＮＡの増幅が増幅ステップで認められた場合にアップルモザイクウイルスが存在すると判断する判断ステップとを含むことを特徴としている。

「アップルモザイクウイルス」とは、ＡｐｐｌｅＭｏｓａｉｃＩｌａｒｖｉｒｕｓのことであって、ブロモウイルス（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓ）属に属するＲＮＡウイルスである。アップルモザイクウイルスの宿主の主要なものは、ホップ（ＨｕｍｕｌｕｓｌｕｐｕｌｕｓＬ．）及びリンゴ（ＭａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａＭａｌｕｓ）であり、アップルモザイクウイルスの感染を受けたホップは、毬花の収量が減少し、ビール醸造に必要な苦味物質であるα酸の含量の低下をも引き起こすことが知られている。

上記検出方法で使用する「検体」としては、例えば、植物の葉、茎、根及び果実等を例示できるが、サンプリングが容易なことより葉及び果実が好ましく、葉がより好ましい。検体をサンプリングする時期としては、例えば、栽培時、収穫時及び保管時等を例示できる。

上記抽出ステップでは、細胞壁で囲まれた植物細胞中に存在しているアップルモザイクウイルスのＲＮＡを抽出するが、例えば、蒸留水又は弱アルカリ性付近のｐＨを有する緩衝液中で検体を物理的にホモジナイズすることによりアップルモザイクウイルスのＲＮＡを抽出できる。

使用する緩衝液のｐＨは、例えば、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．５付近が好ましく、使用する緩衝液としては、例えば、トリス／塩酸緩衝液、トリス／酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。また、検体からアップルモザイクウイルスのＲＮＡをより効率的に抽出するには、植物からＲＮＡを抽出する方法やゲノムＤＮＡを抽出する方法が適しており、これらの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）等の遺伝子工学プロトコールに記載されている。ＲＮＡを抽出する方法では、グアニジンチオシアネートを、ゲノムＤＮＡを抽出する方法では、Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ（以下、ＣＴＡＢ）を含有した抽出バッファーを使用するのがより好ましい。

ホモジナイズは、検体の細胞壁を壊し、植物細胞中に存在するアップルモザイクウイルスのＲＮＡを抽出できればよく、例えば、ポリトロンホモジナイザー、テフロンホモジナイザー、乳鉢等を用いて行うことができる。また、検体を凍結した状態でホモジナイズすれば、より効率的に検体の細胞壁を壊し、細胞中に存在するアップルモザイクウイルスのＲＮＡを容易に抽出できる。また、上記したグアニジンチオシアネートを含有するＲＮＡ抽出バッファーやＣＴＡＢを含有するゲノムＤＮＡ抽出バッファーを使用する場合には、ボルテックスミキサー等で撹拌を繰り返すだけでも、細胞中に存在するアップルモザイクウイルスのゲノムＲＮＡを抽出することが可能である。

抽出ステップで抽出されたアップルモザイクウイルスのゲノムＲＮＡは、アルコール沈殿を行うことによって沈殿として回収し、ＲＴ−ＬＡＭＰ法に適した緩衝液に置換してもよいが、蒸留水又は弱アルカリ性付近のｐＨを有する緩衝液中でアップルモザイクウイルスのＲＮＡを抽出した場合には、そのまま以下の増幅ステップで使用することも可能である。

増幅ステップでは、配列表の配列番号２及び４で示される塩基配列からなる二種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、抽出ステップで抽出されたアップルモザイクウイルスのＲＮＡを鋳型に逆転写反応が行われ、引き続き、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、逆転写反応で得られたｃＤＮＡを鋳型にＬｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（以下、ＬＡＭＰ法）による等温遺伝子増幅反応が繰り返し行われる。

増幅ステップで行われるｃＤＮＡの増幅方法は、ＲＴ−ＬＡＭＰ法と呼ばれ、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写反応とＬＡＭＰ法による等温遺伝子増幅反応とを同時に等温で行うことによって、アップルモザイクウイルスのゲノムＲＮＡの標的領域の一部配列のｃＤＮＡを増幅できる。

図１は、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットとアップルモザイクウイルスのゲノムＲＮＡの標的領域との位置関係を示した図である。

配列表の配列番号７は、アップルモザイクウイルスのゲノムＲＮＡの標的領域のｃＤＮＡの塩基配列を示している。

配列表の配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＡｐＭＶ−ＦＩＰプライマー）はＦＩＰプライマーであり、Ｆ２ｃ領域と相補的な配列であるＦ２領域を３’末端側に持ち、５’末端側にＦ１ｃ領域と同じ配列を持つようにすれば設計できる。

配列表の２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＡｐＭＶ−ＢＩＰプライマー）はＢＩＰプライマーであり、Ｂ２ｃ領域と相補的な配列であるＢ２領域を３’末端側に持ち、５’末端側にＢ１ｃ領域と同じ配列を持つようにすれば設計できる。

配列表の配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＡｐＭＶ−Ｆ３プライマー）は、Ｆ３プライマーであり、Ｆ３ｃ領域と相補的な配列であるＦ３領域を持つようにすれば設計できる。

配列表の配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＡｐＭＶ−Ｂ３プライマー）は、Ｂ３プライマーであり、Ｂ３ｃ領域と相補的な配列であるＢ３領域を持つようにすれば設計できる。

ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応は、抽出ステップで抽出されたアップルモザイクウイルスのＲＮＡと、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、逆転写酵素と、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素と、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ）と、緩衝液と、を含む反応液を、等温で一定時間静置すればよい。

温度は、５０℃以上７５℃以下が好ましく、６０℃以上６５℃以下がより好ましく、６５℃がさらに好ましい。静置時間は、１５分以上であればｃＤＮＡの増幅を検出できるが、１５分以上１時間以内が好ましく、２０分以上４０分以内がより好ましい。

逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液としては、例えば、ＬｏｏｐａｍｐＲＮＡ増幅試薬キット（栄研化学社製）に含まれる各試薬を使用できる。

また、増幅ステップでは、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットの代わりに、配列表の配列番号５及び６で示される塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマーを加えた配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のプライマーセットを使用することが好ましい。

配列表の配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＡｐＭＶ−ＬｏｏｐＦプライマー）及び配列表の配列番号６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＡｐＭＶ−ＬｏｏｐＢプライマー）は、増幅反応の起点となるダンベル構造の５’末端側のループの１本鎖部分に相補的な配列を持つＬｏｏｐプライマーである。ＡｐＭＶ−ＬｏｏｐＦは、図１中のＦ１領域とＦ２領域の間の配列に相補的な配列を持つようにすれば設計でき、ＡｐＭＶ−ＬｏｏｐＢは、図１中のＢ１領域とＢ２領域の間の配列に相補的な配列を持つようにすれば設計できる。ＡｐＭＶ−ＬｏｏｐＦ及びＡｐＭＶ−ＬｏｏｐＢを用いることにより、ＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となり、増幅効率が上がり、増幅に要する時間を１／３〜１／２に短縮することが可能となる。

判断ステップでは、配列表の配列番号８で示される塩基配列を繰り返し含有するｃＤＮＡの増幅が上記増幅ステップで認められた場合に、アップルモザイクウイルスが存在すると判断できる。

配列表の配列番号８で示される塩基配列は、アップルモザイクウイルスのゲノムＲＮＡの標的領域の一部配列のｃＤＮＡであって、上記プライマーセットを用いたＲＴ−ＬＡＭＰ法で繰り返し増幅されるコア配列である。このコア配列に相補的なアップルモザイクウイルスのゲノムＲＮＡの塩基配列及び配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドがそれぞれアニールするアップルモザイクウイルスのゲノムＲＮＡの塩基配列は、アップルモザイクウイルスのコートタンパク質遺伝子の一部配列であり、これらの塩基配列を含有するアップルモザイクウイルスのゲノムＲＮＡの領域は、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によってｃＤＮＡを増幅するための標的領域として適している。このため、増幅されたｃＤＮＡの有無を確認することによって、アップルモザイクウイルスの有無を特異的に検出することを可能にしている。

アップルモザイクウイルスの有無の判断は、例えば、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応を行った後の反応液を肉眼で観察し、反応液の白濁が確認された場合にアップルモザイクウイルスが存在したと判断できる。また、この反応液に蛍光インターカレーターを加え、ＵＶ照射下でｃＤＮＡの増幅を示す発光が確認された場合にアップルモザイクウイルスが存在したと判断できる。

より詳細にアップルモザイクウイルスの有無を判断するには、例えば、増幅されたｃＤＮＡを配列表の配列番号８で示される塩基配列中に存在する制限酵素ＡｌｕＩ又はＴａｑＩで消化して電気泳動を行い、１３４ｂｐと７５ｂｐの２つのＤＮＡ断片又は２０９ｂｐのＤＮＡ断片が確認された場合にアップルモザイクウイルスが存在したと判断できる。

本発明のアップルモザイクウイルスの検出用プライマーセットは、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むこと又は配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴としている。

上記のプライマーセットは、配列表の配列番号１〜６のそれぞれの塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ合成機で合成できる。

また、本発明のアップルモザイクウイルスの検出方法を使用するために必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。具体的には、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチド又は配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写酵素、鎖置換活性を有する鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩又はマンガン塩等）、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類をキットとして提供できる。

キットには、本発明のプライマーによってＲＴ−ＬＡＭＰ反応が正常に進行することを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明のプライマーにより増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。

以下、実施例を挙げて本発明について更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるアップルモザイクウイルスの検出
（アップルモザイクウイルスの検出に用いるホップ組織サンプルの調製）
アップルモザイクウイルスに感染したホップの脇芽由来のホップ試験管苗から根を除いたものをアップルモザイクウイルス検出用検体とし、ウイルスフリーのホップ試験管苗から根を除いたものをコントロール検体とし、それぞれの検体からホップ組織サンプルを調製した。

アップルモザイクウイルス検出用検体及びコントロール検体は、それぞれ液体窒素で凍結し、組織がパウダー状になるまで乳鉢で粉砕し、そこに検体重量に対し５倍量の蒸留水を加えて縣濁した。こうして得られたアップルモザイクウイルス検出用検体及びコントロール検体の縣濁液は、それぞれホップ組織サンプルとして以下の実験に用いた。

（ＲＮＡ試料の調製）
各ホップ組織サンプル（各４０μＬ）に、それぞれ１６０μＬの２×ＣＴＡＢ溶液（２％セチルトリメチルアンモニウムブロミド、２０ｍＭＥＤＴＡ、１．４ＭＮａＣｌ、５％ β−メルカプトエタノール、０.１Ｍトリス、ｐＨ９.５）を加え、６５℃で２０分間保温した。その後、１５，０００回転で１０分間遠心分離して残渣を沈殿として取り除き、その上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。そこに２００μＬのイソプロパノールを加えて混和し、１５，０００回転で１０分間遠心分離することによってＲＮＡを沈殿として回収し、７０％エタノールで洗浄後に風乾し、４０μＬの滅菌水で溶解してＲＮＡ試料とした。

こうして得られたアップルモザイクウイルス検出用検体のＲＮＡ試料及びコントロール検体のＲＮＡ試料は、それぞれ滅菌水で１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍及び１０^７倍に段階希釈し、そのうちの２μＬをＲＮＡ希釈試料としてＲＴ−ＬＡＭＰに供試した。ＲＮＡ希釈試料は、ホップ組織サンプルの２×１０^４分の１、２×１０^５分の１、２×１０^６分の１、２×１０^７分の１及び２×１０^８分の１にそれぞれ相当する。

（ＲＴ−ＬＡＭＰ法に使用するプライマー）
プライマーには、ＦＩＰプライマーとしてＡｐＭＶ−ＦＩＰプライマー（配列番号１）、ＢＩＰプライマーとしてＡｐＭＶ−ＢＩＰプライマー（配列番号２）、Ｆ３プライマーとしてＡｐＭＶ−Ｆ３プライマー（配列番号３）、Ｂ３プライマーとしてＡｐＭＶ−Ｂ３プライマー（配列番号４）、ＬｏｏｐプライマーとしてＡｐＭＶ−ＬｏｏｐＦ（配列番号５）及びＡｐＭＶ−ＬｏｏｐＢ（配列番号６）を用いた。これらの６種類のプライマーを使用してＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅を行うことで、アップルモザイクウイルスのコートタンパク質遺伝子のｃＤＮＡの一部配列である配列表の配列番号８で示される塩基配列を繰り返して含有するｃＤＮＡを増幅できる。

（ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅）
ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅は、ＬｏｏｐａｍｐＲＮＡ増幅試薬キット（栄研化学社製）を用いて行った。具体的には、製造元のプロトコールに従って、反応液に段階希釈した上記ＲＮＡ希釈試料（２μｌ）をそれぞれ加え、そこに上記の６種類のプライマー、逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を加え、６５℃で、５０分間静置した。

（増幅したｃＤＮＡの検出）
ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅が認められる場合には、遊離したピロリン酸がマグネシウムイオンと反応してピロリン酸マグネシウムを形成するため、反応液が白濁した場合にｃＤＮＡの増幅が認められたと判定できる。上記のＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅で増幅されるｃＤＮＡは、アップルモザイクウイルスのコートタンパク質遺伝子のｃＤＮＡの一部配列に相当する配列表の配列番号８で示される塩基配列であるため、反応液が白濁した場合にアップルモザイクウイルスが存在すると判断した。

表１は、アップルモザイクウイルス検出用検体のＲＮＡ希釈試料及びコントロール検体のＲＮＡ希釈試料を用いて、ＲＴ−ＬＡＭＰ法でアップルモザイクウイルスの検出を行なった結果である。

その結果、コントロール検体のＲＮＡ希釈試料では、いずれもアップルモザイクウイルスは検出されなかったが、アップルモザイクウイルス検出用検体のＲＮＡ希釈試料では、ホップ組織サンプルを２×１０^７培希釈してもアップルモザイクウイルスを検出することができた。以上より、ＲＴ−ＬＡＭＰ法による検出では、アップルモザイクウイルスが感染したアップルモザイクウイルス検出用検体でのみアップルモザイクウイルスが検出されることが判明し、後述するＥＬＩＳＡ法による検出よりも検出感度がはるかに高いことが示唆された。

しかしながら、ＲＴ−ＬＡＭＰ法で、非特異的にｃＤＮＡが増幅された場合であっても反応液の白濁は認められるため、以下の実験により確認試験を行った。具体的には、アップルモザイクウイルス検出用検体のＲＮＡ希釈試料を用いたＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応で、ｃＤＮＡの増幅が認められた各反応液の１μＬを制限酵素ＡｌｕI又はＴａｑＩで消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、それぞれ１３４ｂｐと７５ｂｐの２本のＤＮＡ断片又は２０９ｂｐのＤＮＡ断片が検出されるか否かを確認した。ＡｌｕI及びＴａｑＩは配列表の配列番号８に示される塩基配列中に存在するため、制限酵素ＡｌｕI又はＴａｑＩで消化することにより、ＲＴ−ＬＡＭＰ法で増幅されたｃＤＮＡをそれぞれ１３４ｂｐと７５ｂｐの２本のＤＮＡ断片又は２０９ｂｐのＤＮＡ断片として検出することが可能となる。電気泳動後のゲルは、エチジウムブロマイド溶液に１０分間浸漬することにより分画されたＤＮＡ断片を染色し、紫外線を照射することによりＤＮＡバンドを可視化できる。

図２は、アップルモザイクウイルス検出用検体のＲＮＡ希釈試料を用いてＲＴ−ＬＡＭＰ法で増幅されたｃＤＮＡを制限酵素ＡｌｕI又はＴａｑＩで消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動したときのバンドパターンを示すゲル写真である。

その結果、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応で白濁が認められ、表１でアップルモザイクウイルスが検出された各反応液中のｃＤＮＡは、いずれも制限酵素ＡｌｕI又はＴａｑＩで消化することによりそれぞれ１３４ｂｐと７５ｂｐの２本のＤＮＡ断片又は２０９ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。ＴａｑＩで消化したｃＤＮＡを電気泳動したレーンのゲル中には、２０９ｂｐのメジャーバンドの他に、１５５ｂｐ、９８ｂｐ、５３ｂｐのマイナーバンドが確認されるが、ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応では、標的領域の一部配列のｃＤＮＡがつながった状態で増幅されるため、２０９ｂｐのメジャーバンドの他に、１５５ｂｐ、９８ｂｐ、５３ｂｐのマイナーバンドが確認されることは正しい結果であるといえる。

以上より、上記の実施例１において、ＲＴ−ＬＡＭＰ法でｃＤＮＡの増幅を示す白濁が認められた場合には、非特異的なｃＤＮＡの増幅が起こったのではなく、アップルモザイクウイルスのコートタンパク質遺伝子の一部が特異的に増幅したものであることが立証され、アップルモザイクウイルスの検出は、アップルモザイクウイルスの存在に依存した結果であることが明らかとなった。

したがって、実施例１に示されたＲＴ−ＬＡＭＰ法によるアップルモザイクウイルスの検出方法は、後述するＥＬＩＳＡ法によるアップルモザイクウイルスの検出と比べて非常に高感度な方法であり、反応液の白濁を視覚的に判断するだけで容易にアップルモザイクウイルスの有無を判定できる方法であることが示唆された。

（比較例１）ＥＬＩＳＡ法によるアップルモザイクウイルスの検出
（アップルモザイクウイルスの検出用のＥＬＩＳＡ用プレートの作成）
アップルモザイクウイルスを特異的に認識する抗アップルモザイクウイルス抗体（アグリア社、米国）を、０．０５ＭＳＣＢバッファー（１．５９ｇ／ＬＮａ_２ＣＯ_３、２．９３ｇ／ＬＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６穴マイクロプレートに０．２ｍＬずつ注入し、３７℃で４時間静置した。その後、０．０２ＭＰＢＳ−Ｔ（８．０ｇ／ＬＮａＣｌ、０．２ｇ／ＬＫＨ_２ＰＯ_４、２．９ｇ／ＬＮａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．２ｇ／ＬＫＣｌ、０．５ｍＬ／Ｌｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）を用いて５分間隔で５回洗浄し、こうして得られた抗体固相プレートをアップルモザイクウイルスの検出用のＥＬＩＳＡ用プレートとして以下の試験に用いた。

（ＥＬＩＳＡ法による検出）
実施例１に記載したアップルモザイクウイルス検出用検体及びコントロール検体の縣濁液から調製した各ホップ組織サンプル（各４０μＬ）に、１６０μＬの蒸留水を加え、さらに２００μＬのＰＢＳ−Ｔ／ＰＶＰ溶液（１６．０ｇ／ＬＮａＣｌ、０．４ｇ／ＬＫＨ_２ＰＯ_４、５．８ｇ／ＬＮａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．４ｇ／ＬＫＣｌ、１．０ｍＬ／Ｌｔｗｅｅｎ−２０、４０ｇ／Ｌポリビニルピロリドン、ｐＨ７．４）を加えて混合し、１５，０００回転で１０分間遠心分離し、２００μＬの上清を回収しタンパク質試料とした。

こうして得られたアップルモザイクウイルス検出用検体のＲＮＡ試料及びコントロール検体のタンパク質試料は、残りの上清を用いて、それぞれＰＢＳ−Ｔ／ＰＶＰ溶液で１０倍、１０^２倍、１０^３倍に段階希釈し、それぞれ２００μＬをタンパク質希釈試料としてＥＬＩＳＡに供試した。希釈をしていないタンパク質試料は、ホップ組織サンプルの２分の１に相当し、１０倍、１０^２倍及び１０^３倍に段階希釈したタンパク質希釈試料は、ホップ組織サンプルの２０分の１、２×１０^２分の１、２×１０^３分の１にそれぞれ相当する。

次にタンパク質試料及び各タンパク質希釈試料（各２００μＬ）のそれぞれを上記のＥＬＩＳＡ用プレートに添加し、一晩静置した。０．０２ＭＰＢＳ−Ｔを用いて５分間隔で５回洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識した抗アップルモザイクウイルス抗体（アグリア社、米国）を０．０２ＭＰＢＳ−Ｔで１０００倍希釈したものを２００μＬずつ加え、３７℃で３時間静置した。その後、ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルを０．０２ＭＰＢＳ−Ｔを用いて５分間隔で５回洗浄し、２００μＬの基質溶液（１０％Ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１ｇ／Ｌｐ−ニトロフェニル燐酸二ナトリウム）を加え、室温にて一定時間反応させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。

表２は、アップルモザイクウイルス検出用検体のタンパク質試料及び各タンパク質希釈試料並びにコントロール検体のタンパク質試料及び各タンパク質希釈試料を用いて、ＥＬＩＳＡ法でアップルモザイクウイルスの検出を行なった結果である。

その結果、コントロール検体のＲＮＡ希釈試料では、いずれもアップルモザイクウイルスは検出されなかったが、アップルモザイクウイルス検出用検体のタンパク質試料及び各タンパク質希釈試料では、ホップ組織サンプルを２０倍希釈までであればアップルモザイクウイルスを検出することができた。以上より、ＥＬＩＳＡ法による検出では、アップルモザイクウイルスが感染したアップルモザイクウイルス検出用検体でのみアップルモザイクウイルスが検出され、ＥＬＩＳＡの系は正常にアップルモザイクウイルスを検出していることが確認できたが、上記のＲＴ−ＬＡＭＰ法による検出と比較して、検出感度が少なくとも１０^６倍（１００万倍）低いことが明らかとなった。

配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットとアップルモザイクウイルスのゲノムＲＮＡの標的領域との位置関係を示した図である。アップルモザイクウイルス検出用検体のＲＮＡ希釈試料を用いてＲＴ−ＬＡＭＰ法で増幅されたｃＤＮＡを制限酵素ＡｌｕI又はＴａｑＩで消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動したときのバンドパターンを示すゲル写真である。

Claims

アップルモザイクウイルスの検出方法であって、
検体からアップルモザイクウイルスのＲＮＡを抽出する抽出ステップと、
配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、前記ＲＮＡを鋳型にＲｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ−ＬＡＭＰ）法によってｃＤＮＡの増幅反応を行う増幅ステップと、
配列表の配列番号８で示される塩基配列を含有するｃＤＮＡの増幅が前記増幅ステップで認められた場合にアップルモザイクウイルスが存在すると判断する判断ステップと、
を含む、検出方法。
前記プライマーセットは、配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットである、請求項１記載の検出方法。
配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含む、アップルモザイクウイルスの検出用プライマーセット。
配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のオリゴヌクレオチドを含む、アップルモザイクウイルスの検出用プライマーセット。
請求項３又は４記載のプライマーセット、逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、アップルモザイクウイルスの検出用キット。