CN107641664A - 检测鱼神经坏死病毒的引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测鱼神经坏死病毒的引物组及其应用，属于生物检测技术领域。本发明提供了根据鱼神经坏死病毒Coat蛋白基因序列高度保守区域设计的引物组，该引物组具有特异性强、灵敏度高等特点，在此基础上，将上述引物组制备成检测鱼神经坏死病毒的试剂盒，并使用LAMP法检测鱼神经坏死病毒具有操作简单、反应迅速、反应结果可视化的特点。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测鱼神经坏死病毒的引物组及其应用。
背景技术
鱼类病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis，VNN)，是世界范围的一种鱼类流行性传染病，对仔鱼和幼鱼危害极大，严重者在一周内死亡率可达100％。由于其极高的传染性和危害性，被国际兽医组织(OIE)列为重要的鱼类病害(OIE，2001)。目前，该病在除非洲以外的国家和地区迅速蔓延，受感染的鱼类已达40余种，给各国海水养殖业造成了巨大的危害。导致该传染病的致病原为神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)，它属于诺达病毒科(Nodaviridae)中的β-诺达病毒属，是一种小RNA病毒。
随着分子生物学的发展，通常采用PCR方法检测神经坏死病毒，虽然灵敏度高，但对仪器的要求严格，易出现假阳性。
环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isotherm amplification，LAMP)是由Notomi于2000年开发的一种新型的恒温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)和两对特殊的引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下，保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。LAMP在检测细菌、真菌等病原微生物，其具有很好的灵敏度和特异性。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供通过LAMP(环介导恒温扩增)检测鱼神经坏死病毒的引物组，及含有该引物组的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
即，本发明提供了以下的(1)～(7)。
(1)根据SEQ ID No:1所示核酸序列的1～235位碱基序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计的寡聚核酸引物组。
(2)如(1)所述寡聚核酸引物组，其中，包含选自以下(a)～(c)的寡聚核酸组：
(a)选自SEQ ID No:2～SEQ ID No:7表示的碱基序列组或与其互补的碱基序列组；
(b)可与(a)所述的碱基序列在严格条件下杂交的寡聚核酸组；
(c)包含(a)或(b)所述寡聚核酸中1个或几个的碱基被置换、缺失或插入的碱基序列组，具有引物功能的寡聚核酸组。
(3)如(1)所述寡聚核酸引物组，其中，包含选自以下(a)～(c)的寡聚核酸组：
(a)选自SEQ ID No:2～SEQ ID No:5表示的碱基序列组或与其互补的碱基序列组；
(b)可与(a)所述的碱基序列在严格条件下杂交的寡聚核酸组；
(c)包含(a)或(b)所述寡聚核酸中1个或几个的碱基被置换、缺失或插入的碱基序列组，具有引物功能的寡聚核酸组。
(4)上述(2)或(3)中的引物组在鱼神经坏死病毒检测中的应用。
(5)检测鱼神经坏死病毒的DNA试剂盒，含有上述(2)或(3)中至少一组引物组，还含有反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
(6)检测鱼神经坏死病毒的RNA试剂盒，含有上述(2)或(3)中至少一组引物组，还含有反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
其中，所述检测鱼神经坏死病毒的DNA试剂盒和检测鱼神经坏死病毒的RNA试剂盒中的阳性对照为含有神经坏死病毒coat基因序列的质粒(阳性质粒)；
所述检测鱼神经坏死病毒的DNA试剂盒和检测鱼神经坏死病毒的RNA试剂盒中的反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100和0.8M甜菜碱。
(7)检测鱼类神经坏死病毒的方法，在(5)或(6)试剂盒的基础上，使用LAMP法检测，反应温度为：63℃～65℃，反应时间为60min。
本发明还提供了以下的(8)～(14)。
(8)根据SEQ ID No:1所示核酸序列的307～499位碱基序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计的寡聚核酸引物组。
(9)如(7)所述寡聚核酸引物组，其中，包含选自以下(a)～(c)的寡聚核酸组：
(a)选自SEQ ID No:8～SEQ ID No:13表示的碱基序列组或与其互补的碱基序列组；
(b)可与(a)所述的碱基序列在严格条件下杂交的寡聚核酸组；
(c)包含(a)或(b)所述寡聚核酸中1个或几个的碱基被置换、缺失或插入的碱基序列组，具有引物功能的寡聚核酸组。
(10)如(8)所述寡聚核酸引物组，其中，包含选自以下(a)～(c)的寡聚核酸组：
(a)选自SEQ ID No:8～SEQ ID No:11表示的碱基序列组或与其互补的碱基序列组；
(b)可与(a)所述的碱基序列在严格条件下杂交的寡聚核酸组；
(c)包含(a)或(b)所述寡聚核酸中1个或几个的碱基被置换、缺失或插入的碱基序列组，具有引物功能的寡聚核酸组。
(11)上述(9)或(10)中的引物组在鱼神经坏死病毒检测中的应用。
(12)检测鱼神经坏死病毒的DNA试剂盒，含有上述(9)或(10)中至少一组引物组，还含有反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
(13)检测鱼神经坏死病毒的RNA试剂盒，含有上述(9)或(10)中至少一组引物组，还含有反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
其中，所述检测鱼神经坏死病毒的DNA试剂盒和检测鱼神经坏死病毒的RNA试剂盒中的阳性对照为含有神经坏死病毒coat基因序列的质粒(阳性质粒)；
所述检测鱼神经坏死病毒的DNA试剂盒和检测鱼神经坏死病毒的RNA试剂盒中的反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100和0.8M甜菜碱。
(14)检测鱼类神经坏死病毒的方法，在(12)或(13)试剂盒的基础上，使用LAMP法检测，反应温度为：63℃～65℃，反应时间为60min。
本发明还提供了以下的(15)～(21)。
(15)根据SEQ ID No:1所示核酸序列的574～812位碱基序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计的寡聚核酸引物组。
(16)如(15)所述寡聚核酸引物组，其中，包含选自以下(a)～(c)的寡聚核酸组：
(a)选自SEQ ID No:14～SEQ ID No:19表示的碱基序列组或与其互补的碱基序列组；
(b)可与(a)所述的碱基序列在严格条件下杂交的寡聚核酸组；
(c)包含(a)或(b)所述寡聚核酸中1个或几个的碱基被置换、缺失或插入的碱基序列组，具有引物功能的寡聚核酸组。
(17)如(15)所述寡聚核酸引物组，其中，包含选自以下(a)～(c)的寡聚核酸组：
(a)选自SEQ ID No:14～SEQ ID No:17表示的碱基序列组或与其互补的碱基序列组；
(b)可与(a)所述的碱基序列在严格条件下杂交的寡聚核酸组；
(c)包含(a)或(b)所述寡聚核酸中1个或几个的碱基被置换、缺失或插入的碱基序列组，具有引物功能的寡聚核酸组。
(18)上述(16)或(17)中的引物组在鱼神经坏死病毒检测中的应用。
(19)检测鱼神经坏死病毒的DNA试剂盒，含有上述(16)或(17)中至少一组引物组，还含有反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
(20)检测鱼神经坏死病毒的RNA试剂盒，含有上述(16)或(17)中至少一组引物组，还含有反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
其中，所述检测鱼神经坏死病毒的DNA试剂盒和检测鱼神经坏死病毒的RNA试剂盒中的阳性对照为含有神经坏死病毒coat基因序列的质粒(阳性质粒)；
所述检测鱼神经坏死病毒的DNA试剂盒和检测鱼神经坏死病毒的RNA试剂盒中的反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100和0.8M甜菜碱。
(21)检测鱼类神经坏死病毒的方法，在(19)或(20)试剂盒的基础上，使用LAMP法检测，反应温度为：63℃～65℃，反应时间为60min。
本发明还提供了以下的(22)～(28)。
(22)根据SEQ ID No:1所示核酸序列的1079～1286位碱基序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计的寡聚核酸引物组。
(23)如(22)所述寡聚核酸引物组，其中，包含选自以下(a)～(c)的寡聚核酸组：
(a)选自SEQ ID No:20～SEQ ID No:24表示的碱基序列组或与其互补的碱基序列组；
(b)可与(a)所述的碱基序列在严格条件下杂交的寡聚核酸组；
(c)包含(a)或(b)所述寡聚核酸中1个或几个的碱基被置换、缺失或插入的碱基序列组，具有引物功能的寡聚核酸组。
(24)如(22)所述寡聚核酸引物组，其中，包含选自以下(a)～(c)的寡聚核酸组：
(a)选自SEQ ID No:20～SEQ ID No:23表示的碱基序列组或与其互补的碱基序列组；
(b)可与(a)所述的碱基序列在严格条件下杂交的寡聚核酸组；
(c)包含(a)或(b)所述寡聚核酸中1个或几个的碱基被置换、缺失或插入的碱基序列组，具有引物功能的寡聚核酸组。
(25)上述(23)或(24)中的引物组在鱼神经坏死病毒检测中的应用。
(26)检测鱼神经坏死病毒的DNA试剂盒，含有上述(23)或(24)中至少一组引物组，还含有反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
(27)检测鱼神经坏死病毒的RNA试剂盒，含有上述(23)或(24)中至少一组引物组，还含有反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
其中，所述检测鱼神经坏死病毒的DNA试剂盒和检测鱼神经坏死病毒的RNA试剂盒中的阳性对照为含有神经坏死病毒coat基因序列的质粒(阳性质粒)；
所述检测鱼神经坏死病毒的DNA试剂盒和检测鱼神经坏死病毒的RNA试剂盒中的反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100和0.8M甜菜碱。
(28)检测鱼类神经坏死病毒的方法，在(26)或(27)试剂盒的基础上，使用LAMP法检测，反应温度为：63℃～65℃，反应时间为60min。
本发明的有益效果
本发明应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermamplification，LAMP)，根据神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)的Coat蛋白基因序列的高度保守区采用PrimerExploer V4软件设计4套LAMP特异性引物组合，分别记为NNV-1、NNV-2、NNV-3和NNV-4，每套引物分别包含两条内引物(FIP和BIP)、两条外引物(F3和B3)和环引物(LF和/或LB)。通过筛选，最终确定将NNV-2和NNV-4用于检测鱼神经坏死病毒，并对其特异性和灵敏度进行验证，结果显示，NNV-2和NNV-4对水、鱼核酸、虾核酸以及IHHNV病毒、沙门氏菌、柠檬酸杆菌和绿脓杆菌等均无非特异性扩增，不含环引物的NNV-2最低检测含量为43.6fg，不含环引物的NNV-4最低检测含量为436ag。
本发明应用LAMP法可以从分子水平上直接、快速、准确的检测鱼类神经坏死病毒，并具有如下优点：1、操作简单：在恒温热水浴即可完成操作，不需要对模板进行热变性处理，节省了因温度循环而消耗的时间，对仪器依赖性小；2、反应迅速：不添加环引物30～40min即可完成反应，添加环引物20min内即可完成反应；3、特异性强：本发明的引物对水、鱼核酸、虾核酸以及IHHNV病毒、沙门氏菌、柠檬酸杆菌和绿脓杆菌等均无非特异性扩增；4、鉴定方便：反应中从dNTPs中解离出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合，产生副产物焦磷酸镁沉淀，用肉眼即可观察到反应结果，借助浊度仪可获得精确的结果；此外，在反应体系中添加钙黄绿素，有核酸扩增的反应产物在紫外光下可观察到黄绿色荧光；5、灵敏度高：本发明不含环引物的NNV-2最低检测含量为4.36fg，不含环引物的NNV-4最低检测含量为436ag。
附图说明
图1含环引物NNV-1核酸扩增结果(1是神经坏死病毒的总RNA，2是神经坏死病毒的cDNA，3是coat基因序列的阳性质粒，4是水)；
图2含环引物NNV-2核酸扩增结果(1是神经坏死病毒的总RNA，2是神经坏死病毒的cDNA，3是coat基因序列的阳性质粒，4是水)；
图3含环引物NNV-3核酸扩增结果(1是神经坏死病毒的总RNA，2是神经坏死病毒的cDNA，3是coat基因序列的阳性质粒，4是水)；
图4含环引物NNV-4核酸扩增结果(1是神经坏死病毒的总RNA，2是神经坏死病毒的cDNA，3是coat基因序列的阳性质粒，4是水)；
图5不含环引物NNV-1核酸扩增结果(1是神经坏死病毒的总RNA，2是神经坏死病毒的cDNA，3是coat基因序列的阳性质粒，4是水)；
图6不含环引物NNV-2核酸扩增结果(1是神经坏死病毒的总RNA，2是神经坏死病毒的cDNA，3是coat基因序列的阳性质粒，4是水)；
图7不含环引物NNV-3核酸扩增结果(1是神经坏死病毒的总RNA，2是神经坏死病毒的cDNA，3是coat基因序列的阳性质粒，4是水)；
图8不含环引物NNV-4核酸扩增结果(1是神经坏死病毒的总RNA，2是神经坏死病毒的cDNA，3是coat基因序列的阳性质粒，4是水)；
图9不含环引物NNV-2的特异性试验结果；
图10自然光和紫外光下不含环引物NNV-2的特异性试验结果(1是NNV阳性核酸，2是水，3是鱼核酸，4是虾核酸，5是IHHNV病毒，6是沙门氏菌，7是柠檬酸杆菌，8是绿脓杆菌)；
图11不含环引物NNV-4的特异性试验结果；
图12自然光和紫外光下不含环引物NNV-4的特异性试验结果(1是NNV阳性核酸，2是水，3是鱼核酸，4是虾核酸，5是IHHNV病毒，6是沙门氏菌，7是柠檬酸杆菌，8是绿脓杆菌)；
图13不含环引物NNV-2的灵敏性试验结果；
图14自然光和紫外光下不含环引物NNV-2的灵敏性试验结果(1是43.6pg，2是4.36pg，3是436fg，4是43.6fg，5是4.36fg，6是436ag，7是43.6ag，8是水)；
图15不含环引物NNV-4的灵敏性试验结果；
图16自然光和紫外光下不含环引物NNV-4的灵敏性试验结果(1是43.6pg，2是4.36pg，3是436fg，4是43.6fg，5是4.36fg，6是436ag，7是43.6ag，8是4.36ag，9是水)；
具体实施方式
本发明中的试样可以采用分离自感染实验等中所用的细胞和其培养液或者来自活体的标本和培养细胞等含病毒的样本，也可以来自于被怀疑感染神经坏死病毒生物的活体样本，这些试样可以进行分离、抽提、浓缩、纯化等预处理。
LAMP法即环介导等温核酸扩增技术，该方法是通过使自身的3’末端退火到作为模版的核苷酸上而作为互补链合成的起点的同时，组合退火到这时形成的环上的引物，可以实现恒温下的互补链合成反应的核酸扩增法。此外，LAMP法是至少使用识别6个区域的4个引物的特异性高的核酸扩增法。
内部引物是指识别目标碱基序列上的“某个特定的核苷酸序列区域”，且在3’末端具有供作合成起点的碱基序列，同时在5’末端具有对于将该引物作为起点的核酸合成反应生成物的任意区域互补的碱基序列的寡聚核酸，本发明中FIP和BIP为内部引物。
外部引物是指识别目标碱基序列上的“存在于比内部引物识别的区域更接近3’末端侧的某个特定的核苷酸序列区域”，且具有供作合成起点的碱基序列的寡聚核酸，本发明中的F3和B3为外部引物。
此外，B表示与目标碱基序列的反义链互补地结合且提供合成起点的引物。用作引物的寡聚核酸长度在10碱基以上，较好的是15个碱基以上。
LAMP法中，除内部引物和外部引物外，还可以使用其他的引物，即环引物。环引物是指基于LAMP法扩增生成物的同一链上产生的互补序列相互退火形成环的情况下，在其3’末端包含与该环内的序列互补的碱基序列的2种引物(构成双链的各链各1种)。若使用该引物，则核酸合成的起点增加，可以实现反应时间的缩短和检测灵敏度的上升。
寡聚核酸可以通过公知的方法制造，例如可以进行化学合成。或者，也可以将天然的核酸用限制性酶等剪切，改变或连结成所需碱基序列的结构。具体来说，可以使用寡聚核酸合成装置等进行合成。此外，可以使用具有1个～几个的碱基被置换、缺失、插入或添加的碱基序列的寡聚核酸合成法等公知的制法。例如：可以单独或适当组合使用位点特异性突变导入法、基因同源重组法、引物延长法或PCR法合成所述的寡聚核酸。
本发明中的“严格地杂交条件”，可以选择通常公知的条件。作为严格条件，可以例举例如以下的条件：在含有50％甲酰胺、5×SSC(150nM NaCl，15nM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/mL的DNA溶液中，在42℃杂交一晚后，在室温下于2×SSC·0.1％SDS中清洗一次，再在约65℃下用0.1×SSC·0.1％SDS中清洗两次。
由鱼类神经坏死病毒引起的病毒性神经坏死症是一类世界范围内流行的海水鱼类病毒病，病毒的外壳蛋白和病毒的抗原决定簇、侵染、流行和进化等密切相关，神经坏死病毒为RNA病毒，LAMP法中模板为RNA的情况下，通过在模板为DNA时的反应液中添加逆转录酶，可以同样地进行核酸扩增反应(RT-LAMP法)。
LAMP反应后的核酸扩增产物的检测可以使用公知的技术，例如，可以将反应产物直接进行琼脂糖凝胶电泳而容易的进行检测，通过琼脂糖凝胶电泳，LAMP扩增产物因碱基的长度不同而呈现阶梯状。此外，LAMP法中，由于核酸的合成，底物被大量消耗，作为副产物的焦磷酸离子与共存的镁离子反应而生成焦磷酸镁，反应液白浊至肉眼也可确认的程度。因此，可以进行光学观察或使用浊度仪进行检测。本发明在反应体系中加入钙黄绿素，有核酸扩增的反应产物在黑暗条件下可观察到黄绿色荧光；从而使反应结果更加直观。
使用本发明的引物进行核酸扩增检测时所需的各种试剂可以事先组合而试剂盒化，具体来说，作为本发明的引物或环引物所需的各种寡聚核酸、作为核酸合成底物的4种dNTP、进行核酸合成的DNA聚合酶、具有反转录活性的酶、提供适合于酶反应的条件的缓冲液和盐类、阳性对照核酸、使酶和模板稳定化的保护试剂以及根据需要采用的反应生成物的检测所需的试剂以试剂盒的形式提供。
实施例1
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明针对神经坏死病毒的coat基因序列设计引物，用于检测鱼类神经坏死病毒，所述神经坏死病毒为RGNNV血清型。
1、引物的设计与合成
根据多条鱼类神经坏死病毒coat基因序列，序列号分别为MF510920、EF558369.1，KM588181.1，KT071606.1，JF412257.1，JF412260.1，通过https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/网站比对，获得高度保守序列如SEQ ID No:1所示，
SEQ ID No:1
将上述保守序列采用PrimerExplorer V4软件设计LAMP引物，选取内引物FIP/BIP的Tm值在65度左右，外引物F3/B3的温度为60度左右，FIP/BIP的5′端dataG值小于等于-4kcal/mol，F3/B3的3′端dataG值小于等于-4kcal/mol，GC含量在40％-60％之间，引物扩增片段在200bp左右的引物作为初筛引物，并分别记为NNV-1、NNV-2、NNV-3和NNV-4，每套引物分别包含两条内引物(FIP和BIP)、两条外引物(F3和B3)和一条或两条环引物(LF和/或LB)。其核苷酸序列分别如下：
NNV-1
F3：5’-AGGCCTCGACTGTAACTGG-3’(SEQ ID No:2)；
B3：5’-GTGTTTGCGGGGCACATT-3’(SEQ ID No:3)；
FIP：5’-TCTGTTCCTGTCCCGGCTGGGACCAATGACGTCCATCTCTC-3’(SEQ ID No:4)；
BIP：5’-CAACCATCGTCCCCGACCTCGTGTTTCAACAGCGTATCGC-3’(SEQ ID No:5)；
LF：5’-CCTGGGAGATTCTCGACATACC-3’(SEQ ID No:6)；
LB：5’-ACTGGGACACGCTGCTAGA-3’(SEQ ID No:7)；
NNV-2
F3：5’-CAACTCGTGGTGCAGTCG-3’(SEQ ID No:8)；
B3：5’-AATCGAACACTCCAGCGAC-3’(SEQ ID No:9)；
FIP：5’-ACGAGGTCCAGAGGAGCGTGTGCCAAATGGTGGGAAAG C-3’(SEQ ID No:10)；
BIP：5’-AGCGTCTCACGTCACCTGGTTGACCACATCAGTGTTGTTGC-3’(SEQ ID No:11)；
LF：5’-GGTGTACTGGGGTCGGACT-3’(SEQ ID No:12)；
LB：5’-GGCTGATACTCCTGTGTGTCG-3’(SEQ ID No:13)；
NNV-3
F3：5’-CCCTTTCCACAACTGACTTCA-3’(SEQ ID No:14)；
B3：5’-GCCATCTGTGAACGTCTTGTT-3’(SEQ ID No:15)；
FIP：5’-GACGGTCCAGCTGGAAAACTGCCCTCCTAGGATCCACACCA-3’(SEQ ID No:16)；
BIP：5’-TGACCGTGCTGTTTATTGGCACACAGATGCCCCAGCGAAAC-3’(SEQ ID No:17)；
LF：5’-TCCATCAGGGGCAATGTCC-3’(SEQ ID No:18)；
LB：5’-GCTGGAAATGCTGGCACAC-3’(SEQ ID No:19)；
NNV-4
F3：5’-ATTGTTGGTACCCTTGACGG-3’(SEQ ID No:20)；
B3：5’-GCCGAGTTGAGAAGCGATC-3’(SEQ ID No:21)；
FIP：5’-CTGGTACCACTGGCACCCAATTACGCTTGAAGGCCTATACACG-3’(SEQ ID No:22)；
BIP：5’-CGAGGAAGTCCCTCTTTGGGCTGCGGCCATTTAACCACATG-3’(SEQ ID No:23)；
LB：5’-CGTTAGCTCCGCGCAGT-3’(SEQ ID No:24)。
将上述引物序列交由上海生工生物工程有限公司合成。
2、引物的筛选
2.1添加环引物
将NNV-1、NNV-2、NNV-3和NNV-4引物组合分别以神经坏死病毒的总RNA、经逆转录制成的cDNA、含有神经坏死病毒coat基因序列的质粒(NNV阳性质粒，载体：PUC-19，酶切位点：Xba1和Sma1)和水为模板，在63℃～65℃下进行RT-LAMP反应60分钟，其中，引物的用量分别为FIP、BIP 40pmol，F3、B3 5pmol，环引物20pmol；NNV-4引物组合中只添加1条环引物，以神经坏死病毒的总RNA为模板的反应体系中添加逆转录酶1μL，反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
其中所述2×反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100和0.8M甜菜碱。
试验结果如图1～4所示：
图1为含环引物NNV-1核酸扩增结果，结果显示第一套LAMP引物能够在20分钟左右将三种核酸全部扩增出来，但是水也在三十多分钟后出现扩增，所以含有环引物的NNV-1不能使用。
图2为含环引物NNV-2核酸扩增结果，结果显示第二套LAMP引物能够在20分钟左右将三种核酸全部扩增出来，但是水也在四十多分钟后出现扩增，所以含有环引物的NNV-2需要进一步考察反应时间。
图3含环引物NNV-3核酸扩增结果，结果显示第三套LAMP引物能够在20分钟左右将三种核酸全部扩增出来，但是水也在二十多分钟后也出现扩增，所以含有环引物的NNV-3不能使用。
图4为含环引物NNV-4核酸扩增结果，结果显示第四套LAMP引物能够在30分钟左右将三种核酸全部扩增出来，水虽然也会在五十五分钟后出现扩增，只要将方法的反应时间定为50分钟，即不会出现特异扩增，所以含有一条环引物的NNV-4可以使用，需要进一步考察特异性，灵敏度，稳定性等方面。
2.2不添加环引物
将NNV-1、NNV-2、NNV-3和NNV-4引物组合分别以神经坏死病毒的总RNA、经逆转录制成的cDNA、含有神经坏死病毒coat基因序列的质粒(阳性质粒)和水为模板，在63℃～65℃下进行RT-LAMP反应60分钟，其中，反应体系中不添加环引物，以神经坏死病毒的总RNA为模板的反应体系中添加逆转录酶1μL，反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
试验结果如图5～8所示：
图5为不含环引物NNV-1核酸扩增结果，结果显示第一套LAMP引物能够在40分钟左右将三种核酸全部扩增出来，水在也在六十分钟左右有些微扩增，不加环引物的NNV-1反应时间控制在55分钟之内，可以使用，并要进一步考察其特异性，灵敏度，显色，临床样本等。
图6为不含环引物NNV-2核酸扩增结果，结果显示第二套LAMP引物能够在35分钟左右将三种核酸全部扩增出来，水在六十分钟内没有扩增，效果良好，暂以使用，需要进一步考察其特异性，灵敏度，显色，临床样本等。
图7为不含环引物NNV-3核酸扩增结果，结果显示第三套LAMP引物能够在40分钟前将三种核酸全部扩增出来，但是水在也在四十多分钟有扩增，所以不加环引物的NNV-3不能使用，舍弃。
图8为不含环引物NNV-4核酸扩增结果，结果显示第四套LAMP引物能够在45分钟左右将三种核酸全部扩增出来，水在六十分钟内没有扩增，效果良好，暂以使用，需要进一步考察其特异性，灵敏度，显色，临床样本等。
综上所述：经过添加环引物和不加环引物的两轮LAMP实验，初步得出NNV-1(不含环引物)，反应时间控制在50分钟内可使用；
NNV-2(不含环引物)和NNV-4(不含环引物)扩增情况良好，60分钟内，水未出现扩增，可用作进一步实验。
3、钙黄绿素的添加试验
在反应体系中添加钙黄绿素，钙黄绿素中的Mn2+可以被溶液中的Mg2+替换，从而产生黄绿色荧光，使试验结果可视化，但是，钙黄绿素通常会对LAMP反应的进行产生影响，本发明对钙黄绿素的添加与否进行的研究，结果发现，添加钙黄绿素，NNV-2和NNV-4引物组都能进行正常的扩增，但是钙黄绿素的添加会推迟引物组NNV-2和NNV-4的起峰时间，对引物的特异性没有影响。
4、特异性试验
4.1 NNV-2特异性试验
采用不含环引物的NNV-2引物，分别以含有神经坏死病毒coat基因序列的质粒(阳性质粒或NNV阳性核酸)、水、鱼核酸、虾核酸、IHHNV病毒、沙门氏菌、柠檬酸杆菌和绿脓杆菌为模板，在63℃～65℃下进行RT-LAMP反应60分钟，其中，引物的用量分别为FIP、BIP40pmol，F3、B3 5pmol；所述鱼核酸为斜带石斑鱼的总RNA，虾核酸为南美白对虾的总RNA，反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
不含环引物NNV-2的特异性试验结果如图9所示：只有NNV阳性核酸出现扩增，水、鱼核酸、虾核酸、IHHNV病毒、沙门氏菌、柠檬酸杆菌和绿脓杆菌均未出现扩增，可见，NNV-2引物具的特异性良好。
4.2 NNV-4特异性试验
采用不含环引物的NNV-4引物，分别以含有神经坏死病毒coat基因序列的质粒(阳性质粒或NNV阳性核酸)、水、鱼核酸、虾核酸、IHHNV病毒、沙门氏菌、柠檬酸杆菌和绿脓杆菌为模板，在63℃～65℃下进行RT-LAMP反应60分钟。反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
不含环引物NNV-4的特异性试验结果如图10所示：只有NNV阳性核酸出现扩增，水、鱼核酸、虾核酸、IHHNV病毒、沙门氏菌、柠檬酸杆菌和绿脓杆菌均未出现扩增，可见，NNV-4引物具的特异性良好。
5、灵敏性试验
5.1 NNV-2灵敏性试验
采用不含环引物的NNV-2引物，分别以不同含量的NNV阳性质粒为模板，水作为阴性对照，在63℃～65℃下进行LAMP反应60分钟，模板的含量分别为：43.6pg、4.36pg、436fg、43.6fg、4.36fg、436ag、43.6ag；反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
不含环引物NNV-2的灵敏性试验结果如图11所示：阳性质粒含量在43.6pg～4.36fg均能检测到扩增，阴性对照未见扩增，可见NNV-2引物的最低检测限为4.36fg。
5.2 NNV-4灵敏性试验
采用不含环引物的NNV-4引物，分别以不同含量的NNV阳性质粒为模板，水作为阴性对照，在63℃～65℃下进行RT-LAMP反应60分钟，模板的含量分别为：43.6pg、4.36pg、436fg、43.6fg、4.36fg、436ag、43.6ag、4.36ag；反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
不含环引物NNV-4的灵敏性试验结果如图12所示：阳性质粒含量在43.6pg～436ag均能检测到扩增，阴性对照未见扩增，可见NNV-4引物的最低检测限为436ag。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心）
<120> 检测鱼神经坏死病毒的引物组及其应用
<130> 2017
<141> 2017-10-27
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1286
<212> DNA
<213> 神经坏死病毒Coat蛋白基因序列()
<400> 1
aggcctcgac tgtaactgga tttggacgtg ggaccaatga cgtccatctc tcaggtatgt 60
cgagaatctc ccaggccgtc ctcccagccg ggacaggaac tgacggatac gtcgttgttg 120
acgcaacgat cgttcccgac ctcctgccac gactgggaca cgctgctaga atcttccagc 180
gatacgctgt tgaaacactg gagtttgaaa ttcagccaat gtgccccgca aacacgggcg 240
gtggttacgt tgctggcttc ctgcctgatc caactgacaa cgaccacacc ttcgacgcgc 300
ttcaagcaac tcgtggtgca gtcgttgcca aatggtggga aagcagaaca gtccgacctc 360
agtacacccg tacgctcctc tggacctcgt cgggaaagga gcagcgtctc acgtcacctg 420
gtcggctgat actcctatgt gtcggcaaca acactgatgt ggtcaacgtg tcggtgctgt 480
gtcgctggag tgttcgattg agcgttccat ctcttgagac acctgaagag accaccgctc 540
ccatcatgac acaaggttcc ctgtacaacg attccctttc cacaactgac ttcaagtcca 600
tcctcctagg atccacaccg ctggatattg cccctgatgg agcagtcttc cagctggacc 660
gtccgctgtc cattgactac agccttggaa ctggagatgt tgaccgtgct gtttactggc 720
acctcaagaa gtttgctgga aatgctggca cacctgcagg ctggtttcgc tggggcatct 780
gggacaactt caataagacg ttcacagatg gcgttgccta ctactctgat gagcagcccc 840
gtcaaatcct gctgcctgtt ggcactgtct gcaccagggt tgactcggaa aactaaccgg 900
gtcatccggt tccctagtgc gtatcgttga tgaccaattt gaacaattga ttaaagcact 960
aacaaatata aataaagaaa tacaaacaaa caaaactgaa attggaaaga atagaagcga 1020
aattgaatca ctcgctagca aattaaacga caaagcaccc aaggagggtg cgattgctat 1080
tgttggtacc cttgacggcg taccggctac gcttgaaggc ctctatacgg ctggaagcgc 1140
gccgcgtgct taattgggtg ccagtggtac cagtcgtatc caacgccgag gaaatccctc 1200
tttgggctgt tgggttaccg ctagctccgc gcagtgagca ccaccgccat gtggttaaat 1260
ggccgctgat cgcttctcaa ctcggc 1286
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
aggcctcgac tgtaactgg 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gtgtttgcgg ggcacatt 18
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
tctgttcctg tcccggctgg gaccaatgac gtccatctct c 41
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
caaccatcgt ccccgacctc gtgtttcaac agcgtatcgc 40
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
cctgggagat tctcgacata cc 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
actgggacac gctgctaga 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
caactcgtgg tgcagtcg 18
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
aatcgaacac tccagcgac 19
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
acgaggtcca gaggagcgtg tgccaaatgg tgggaaagc 39
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
agcgtctcac gtcacctggt tgaccacatc agtgttgttg c 41
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
ggtgtactgg ggtcggact 19
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
ggctgatact cctgtgtgtc g 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
ccctttccac aactgacttc a 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
gccatctgtg aacgtcttgt t 21
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
gacggtccag ctggaaaact gccctcctag gatccacacc a 41
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
tgaccgtgct gtttattggc acacagatgc cccagcgaaa c 41
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
tccatcaggg gcaatgtcc 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
gctggaaatg ctggcacac 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
attgttggta cccttgacgg 20
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
gccgagttga gaagcgatc 19
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
ctggtaccac tggcacccaa ttacgcttga aggcctatac acg 43
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
cgaggaagtc cctctttggg ctgcggccat ttaaccacat g 41
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
cgttagctcc gcgcagt 17
Claims (10)
1.寡聚核酸引物，其特征在于：根据SEQ ID No:1所示核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。
2.根据权利要求1所述的寡聚核酸引物，其特征在于：包含选自以下(a)～(c)的寡聚核酸：
(a)选自SEQ ID No:2～SEQ ID No:24表示的碱基序列或与其互补的碱基序列；
(b)可与(a)所述的碱基序列在严格条件下杂交的寡聚核酸；
(c)包含(a)或(b)所述寡聚核酸中1个或几个的碱基被置换、缺失或插入的碱基序列，具有引物功能的寡聚核酸。
3.引物组，其特征在于：包含选自以下(a)～(c)的引物组：
(a)选自SEQ ID No:2～SEQ ID No:7或SEQ ID No:8～SEQ ID No:13或SEQ ID No:14～SEQ ID No:19或SEQ ID No:20～SEQ ID No:24表示的碱基序列组或与其互补的碱基序列组；
(b)可与(a)所述的碱基序列组在严格条件下杂交的寡聚核酸组；
(c)包含(a)或(b)所述寡聚核酸组中1个或几个的碱基被置换、缺失或插入的碱基序列组，具有引物功能的寡聚核酸组。
4.根据权利要求3所述引物组，其特征在于：包含选自以下(a)～(c)的引物组：
(a)选自SEQ ID No:2～SEQ ID No:5或SEQ ID No:8～SEQ ID No:11或SEQ ID No:14～SEQ ID No:17或SEQ ID No:20～SEQ ID No:23表示的碱基序列组或与其互补的碱基序列组；
(b)可与(a)所述的碱基序列组在严格条件下杂交的寡聚核酸组；
(c)包含(a)或(b)所述寡聚核酸组中1个或几个的碱基被置换、缺失或插入的碱基序列组，具有引物功能的寡聚核酸组。
5.权利要求3或4所述引物组在鱼神经坏死病毒检测中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：用于制备检测鱼神经坏死病毒的试剂盒或检测试剂。
7.一种含有权利要求3或4所述引物组的鱼神经坏死病毒检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为DNA试剂盒或RNA试剂盒。
8.一种鱼神经坏死病毒的DNA检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求3或4所述的至少一组引物组，还包含反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
9.一种鱼神经坏死病毒的RNA检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求3或4所述的至少一组引物组，还包含反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
10.使用权利要求8或9所述试剂盒检测鱼类神经坏死病毒的方法，其特征在于：使用LAMP法检测，反应温度为：63℃～65℃，反应时间为60min。
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