CN113718061A - 一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重rt-pcr的引物组，试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT‑PCR的引物组，试剂盒和方法。所述引物组序列如SEQ ID NO:1和2，SEQ ID NO:3和4所示。运用该引物组可以同时检测两种病毒，缩短时间，加快检测。同时检测的准确度高，灵敏度高，达到1×10^‑5ng/μL。

Description

一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT-PCR 的引物组，试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及检测领域，尤其涉及一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT-PCR的引物组，试剂盒和方法。

背景技术

罗非鱼是很多发展中国家的主要食用蛋白质来源，也是许多渔民和养殖者的重要经济来源。罗非鱼养殖已成为保障全球粮食安全和满足人类营养需求的重要产业。

2009年以来，以色列、厄瓜多尔、埃及、泰国、哥伦比亚等国相继暴发养殖和野生罗非鱼大量死亡事件。直到2014年，才发现其致病病原是新型RNA病毒——罗湖病毒。罗湖病毒是2012年由美国科学家首次发现的危害罗非鱼的一种病毒，它是一种新型的RNA病毒，由10个独特的基因片段组成，直径55-75nm，目前仍未确定其分类地位，极有可能是正粘病毒科的一种新型病毒，与熟知的流感病毒同属一科。罗湖病毒在24-33℃均可以生长，最适温度25℃，所以每年的5-10月份均可能导致发病。感染罗湖病毒的病鱼常见症状为：体色发黑，体表有溃烂，眼睛有明显的病变，发病前期晶状体浑浊，后期晶状体破裂发炎，眼睛内容物浓缩，失去正常视觉功能。2018年Saengchan Senapin等，从无明显临床症状、无死亡的成年罗非鱼和鱼苗中检测出罗湖病毒，提示罗湖病毒可能像ISAV一样存在着变异株。

至今尚不清楚TiLV(罗湖病毒)的最初来源，野生或养殖的受TiLV感染的鱼群是目前已知的唯一传染源。有证据表明，病鱼的眼睛、大脑和肝脏常常含有高浓度的病毒，其肌肉组织也可能存在病毒。因此，发病死亡的罗非鱼可能是重要的病毒污染源。罗湖病毒是否会通过非罗非鱼物种和其它有机体(如食鱼鸟类和哺乳动物)携带，通过冷冻罗非鱼产品进行传播，目前尚不确定，但粮农组织指出，罗湖病毒有可能比目前已知的分布范围更广，给全球罗非鱼养殖造成严重威胁。

虽然该病原体不会引起公共卫生问题，但可以导致受感染种群大量死亡，感染的鱼因抵抗力变差感染其他病原菌，倘若人生食也有被其他病菌感染的风险。

目前，还未将TiLV列入检疫名录，也无相应的检测方法。因此，了解TiLV的流行病学和诊断技术，对预防和控制这种外来病具有重要意义。

国外已经在病毒的细胞培养、组织病理学、RT-PCR，nested RT-PCR,semi-nestedRT-PCR,SYBR quantitative RT-PCR、原位杂交等检测技术方面进行了研究，并建立了相应的检测方法。因为分子生物学方法具有快速、灵敏、简便的特点，大多数国家都采用其对TiLV进行监测和诊断，在检测和诊断时，也大多采用片段3基因，片段3编码假设蛋白。

现有检测TiLV的分子生物学方法，大多是针对假设蛋白基因片段，如JaphetteEsther Kembou Tsofack等根据基因片段3(Genebank序列号KJ605629)建立了巢氏RT-PCR方法；Dong等建立的半巢氏RT-PCR方法也是根据片段3建立的；泰国PitchapornWaiyamitra等研究人员也是根据片段3保守序列设计引物探针建立了RT-qPCR检测方法；PTattiyapong等建立的SYBR green RT-qPCR方法，也是根据片段3设计的引物探针，GenBank序列号为KX631923；国内刘助红等同样是根据基因片段3(Genebank序列号KJ605629)建立的RT-LAMP方法。“一种罗湖病毒的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及方法”“一种罗湖病毒Taq-man探针荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法”根据编码RNA聚合酶的片段1设计引物序列。

VNNV和TiLV是罗非鱼易感的两种病毒，现有技术并没有同时检测两种病毒的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时检测罗湖病毒(TiLV)和病毒性神经坏死病毒(VNNV)的双重RT-PCR(dRT-PCR)的引物及其试剂盒。可以同时检测两种病毒，缩短时间，加快检测。

为实现上述目的，本发明提供一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT-PCR的引物组，其特征在于，所述引物组序列如SEQ ID NO:1和2，SEQ ID NO:3和4所示。

本发明还提供一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT-PCR的试剂盒，其特征在于，含有所述的引物组。

进一步，还包括含有SEQ ID NO:5和6所示的DNA作为阳性对照。

本发明还提供一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT-PCR方法，其特征在于，含有如下步骤，将待测样本的DNA作为模板，进行双重RT-PCR，根据结果来判断即可。

进一步，所述双重RT-PCR的反应体系以25μL为例，含有12.5μL的2×One-StepReaction Solution B；1μL的One-Step Enzyme Mix；0.5μL 20μM所述引物组中的每条引物；1μL待检核酸，余量为水。

进一步，所述RT-PCR的反应条件为，反转录，50℃，30min；预变性，94℃，2min；变性，94℃，30sec；退火，56±2℃，30sec；延伸，72℃，1min；30个循环；最终延伸，72℃，5min。

进一步，根据结果来判断为根据电泳结果来看，TiLV质粒阳性对照在255bp处出现特异性条带，VNNV质粒阳性对照在120bp处出现特异性条带，阴性对照没有条带，则结果成立，继续判断，

若样本仅在255bp处出现特异性条带，则样品判定为TiLV dRT-PCR阳性；

若样品仅在120bp处出现特异性条带，则样品判定为VNNV dRT-PCR阳性；

若样品在255bp、120bp处均出现特异性条带，则样品判定为TiLV、VNNV dRT-PCR阳性；若样品没有特异性条带，则样品为TiLV、VNNV dRT-PCR阴性。

检测罗湖病毒(TiLV)和病毒性神经坏死病毒(VNNV)的双重RT-PCR(dRT-PCR)引物包括：

VNNV F 5’-AACGATCACACCTTCGACGC-3’(20μM) SEQ ID NO:1；

VNNV R 5’-CTTTCCCGACGAGGTCCAG-3’(20μM) SEQ ID NO:2；

TiLV F 5’-AACCCCACTTACACAACGAGG-3’(20μM) SEQ ID NO:3；

TiLV R 5’-TGACTCTGATACGAGGAGCCTATG-3’(20μM) SEQ ID NO:4；

VNNV扩增片段长度120bp,TiLV扩增片段长度255bp。所述双重RT-PCR(dRT-PCR)对罗湖病毒(TiLV)的扩增区域是片段1的特异性片段，对VNNV的扩增区域是RNA2的特异性片段。

TiLV扩增片段为：

aaccccacttacacaacgaggaatgaggacttcctccccacatgcctgggagggaagactgtaattagctttcaatctctactgacttgggattgccacccattttggtaccaagtgcaccctgatggcccagacactatagatcagaaagtcctgtctgtccttgcctcaaagactcgcagaaggagaacccgactggaggctctctcagacttggaccccctggtccctcataggctcctcgtatcagagtca。 SEQ ID NO:5。

VNNV扩增片段为：

aacgatcacaccttcgacgcgcttcaagcaactcgtggtgcagtcgttgccaaatggtgggaaagcagaacagtccgacctcagtacacccgcacgctcctctggacctcgtcgggaaag。 SEQ ID NO:6。

本发明还提供了罗湖病毒(TiLV)和病毒性神经坏死病毒(VNNV)的两种标准质粒；

罗湖病毒(TiLV)标准质粒和慢病毒序列：

agatctgtgttgtcaaaggtctcggcagtatacactgctactgctagtgcagaacaacgggctatgatggctgcgcaggttgtagagtcaagaagacatgttcttaatggcgactgtactaagtacaatgaggcaatcgacgcagacacactactaaaagtgtgggatgcaataggcatggggtcgattggagtcatgctcgcttacatggtgcgcaggaaatgcgttctcattaaagacactctagtagagtgtccaggaggtatgttgatgggaatgttcaacgcaactgccaccttggcactacaagggacgactgacagattcctgtctttcagcgacgactttataacatcgtttaactcgcctgctgaattacgcgagatagaggacctgcttttcgcaagctgtcataacttgtcgctaaagaagagttacatttcagttgcctcactggaaataaactcgtgtaccctcactagggacggtgacctagccacagggttaggttgcactgctggtgtccccttcagggggccacttgtgactctgaaacagactgcagctatgttatctggcgctgttgactcaggagttatgccattccactcagcagaacgtctgttccagataaagcagcaggaatgtgcctataggtataacaaccccacttacacaacgaggaatgaggacttcctccccacatgcctgggagggaagactgtaattagctttcaatctctactgacttgggattgccacccattttggtaccaagtgcaccctgatggcccagacactatagatcagaaagtcctgtctgtccttgcctcaaagactcgcagaaggagaacccgactggaggctctctcagacttggaccccctggtccctcataggctcctcgtatcagagtcagacgttagcaagattagagcagctaggcaggctcacttgaagtctttaggtttggaac。SEQ ID NO:7。

病毒性神经坏死病毒(VNNV)标准质粒和慢病毒序列：

Acgggcggtggttacgttgctggcttcctgcctgatccaactgacaacgatcacaccttcgacgcgcttcaagcaactcgtggtgcagtcgttgccaaatggtgggaaagcagaacagtccgacctcagtacacccgcacgctcctctggacctcgtcgggaaaggagcagcgtctcacgtcacctggtcggctgatactcctgtgtgtcggcaacaacactgatgtggtcaacgtgtcggtgctgtgtcgctggagtgttcgattgagcgttccatctcttgagacacctgaagagactaccgctcccatcatgacacaaggttccctgtacaacgattccctttccaagaatgacttcaagtccatcctcctaggatccacaccactggacattgtccctgatggagcagtcttcctgctggaccgtccgctgtccattgactacagcctcgtaactggagatgttgacagtggtgtttactggcacatcaagaagtttgctggaaatgctggcacacctgc。SEQ ID NO:8。

运用本发明提供的引物对罗湖病毒(TiLV)和病毒性神经坏死病毒(VNNV)进行检测，检测的准确度高，灵敏度高，达到1×10^-5ng/μL。

附图说明

图1是TiLV 30个毒株的31个片段1的全基因序列信息部分对比情况图。

图2是TiLV 30个毒株的31个片段1的全基因序列信息部分对比情况图。

图3是TiLV 30个毒株的31个片段1的全基因序列信息部分对比情况图。

图4是VNNV 4个毒株的衣壳蛋白部分基因序列信息部分对比情况图。

图5是VNNV 4个毒株的衣壳蛋白部分基因序列信息部分对比情况图。

图6是VNNV 4个毒株的衣壳蛋白部分基因序列信息部分对比情况图。

图7是RT-dPCR两组引物对最佳浓度的探究试验结果图。

图8是RT-dPCR最佳退火温度的探究试验结果图。

图9是RT-dPCR灵敏度结果图。

图10是RT-dPCR TiLV、VNNV相互干扰试验结果图。

图11是RT-dPCR特异性试验结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例用到的TiLV质粒、VNNV质粒，是由厦门普诺普和生物技术有限公司合成的。实施例用到的TiLV慢病毒、VNNV慢病毒是由厦门安提海拉生物科技有限公司合成的，模拟真病毒。实施例用到的NNV真病毒，是由本实验室日常检测检出的样品核酸。其他病毒核酸由深圳海关技术中心提供。

以下实施例用到的TiLV核酸，VNNV核酸浓度：TiLV质粒，5μg/mL；VNNV质粒，5μg/mL；VNNV慢病毒,20μg/mL；TiLV慢病毒，25μg/mL。

其他核酸浓度：真鲷虹彩病毒(RSIV)核酸20μg/mL、锦鲤疱疹病毒(KHV)20μg/mL、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)20μg/mL、金鱼造血器官坏死病毒(CyHV)30μg/mL、流行性溃疡综合征(EUS)22μg/mL、鲤春病毒血症(SVC)20μg/mL、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)23μg/mL、传染性鲑鱼贫血病(ISA)15μg/mL、鲑鱼甲病毒(SAV)20μg/mL、病毒性出血性败血症(VHSV)20μg/mL。

以下实验的PCR条件为：

检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT-PCR的反应体系以25μL为例，含有12.5μL的2×One-Step Reaction Solution B；1μL的One-Step Enzyme Mix；0.5μL 20μM引物组中的每条引物；0.5μL待检核酸，余量为水。

反应条件为，反转录，50℃，30min。预变性，94℃，2min。变性，94℃，30sec；退火，56±2℃，30sec；延伸，72℃，1min；30个循环。最终延伸，72℃，5min。

结果来判断为：根据电泳结果来看，TiLV质粒阳性对照在255bp处出现特异性条带，VNNV质粒阳性对照在120bp处出现特异性条带，阴性对照没有条带，则结果成立，继续判断，

若样本仅在255bp处出现特异性条带，则样品判定为TiLV dRT-PCR阳性；

若样品仅在120bp处出现特异性条带，则样品判定为VNNV dRT-PCR阳性；

若样品在255bp、120bp处均出现特异性条带，则样品判定为TiLV、VNNV dRT-PCR阳性；

若样品没有特异性条带，则样品为TiLV、VNNV dRT-PCR阴性。

以下实验中，当没有交代成分和用量的时候，参见上述反应条件。

实施例1：引物的筛选实验

本发明(TiLV和VNNV dRT-PCR)引物序列在设计过程中，参考了全部TiLV 30个毒株31个片段1的全基因序列信息，包括：毒株TH-2013(片段1的GenBank登录号：MN687685)、TH-2014(片段1的GenBank登录号：MN687695)、TH-2015(片段1的GenBank登录号：MN687705)、TH-2016-CN(片段1的GenBank登录号：MN687725)、TH-2016-CU(片段1的GenBank登录号：MN687715)、TH-2017(片段1的GenBank登录号：MN687735)、TH-2018-K(片段1的GenBank登录号：MN687755)、TH-2018-N(片段1的GenBank登录号：MN687745)、TH-2019(片段1的GenBank登录号：MN687765)、BD-2017(片段1的GenBank登录号：MN939372)、BD-2017-181(片段1的GenBank登录号：MT466437)、BD-2019-E3(片段1的GenBank登录号：MT466457)、BD-2019-E1(片段1的GenBank登录号：MT466447)、WVL18053-01A(片段1的GenBank登录号：MH319378)、WVL19031-01A(片段1的GenBank登录号：MN193513)、WVL19054(片段1的GenBank登录号：MN193523)、CL(片段1的GenBank登录号：KY615742)、F3-4(片段1的GenBank登录号：MK425010)、TV1(片段1的GenBank登录号：KX631921)、TV2(片段1的GenBank登录号：KX631931)、TV3(片段1的GenBank登录号：KX631932)、TV4(片段1的GenBank登录号：KX631933)、TV5(片段1的GenBank登录号：KX631934)、TV6(片段1的GenBank登录号：KX631935)、TV7(片段1的GenBank登录号：KX631936)、Til-4-2011(片段1的GenBank登录号：KU751814、NC_029926、KU751814)、NBC02(片段1的GenBank登录号：MN602587)、NBC03(片段1的GenBank登录号：MN602588)、NBC04(片段1的GenBank登录号：MN602590)、NBC06(片段1的GenBank登录号：MN602589)；参考了NCBI中罗非鱼VNNV衣壳蛋白的所有基因序列，共4个，包括：Oreochromis mossambicus莫桑比克罗非鱼GenBank登录号：GQ857479、Oreochromisniloticus尼罗罗非鱼GenBank登录号：MN701084、Oreochromis niloticus尼罗罗非鱼GenBank登录号：MN698297、Oreochromis niloticus尼罗罗非鱼GenBank登录号：MN698298。

把上述TiLV30个毒株的31个片段1的全基因序列信息进行比对，找出保守序列，确保扩增的特异性，这需要进行大量的分析工作：31个基因同时使用软件分析时，经常出现卡顿情况，好多分析软件无法同时完成这么多序列的对比。因此先选择其中12个基因进行对比分析，找出具有大部分保守序列的区域，设计引物，使引物序列处于保守区即没有基因不同的区域。然后将引物序列在其余19个基因序列中进行查找分析，若能够在其余19个基因序列中查找到所设计的引物探针序列，则说明该引物探针序列在TiLV的保守区。分析时，碱基对应，标明其相似之处；若有错配或者突变，再研究其他序列的此处碱基信息，如果某处碱基31个基因序列中仅有3-4个基因序列不同，可忽略；如果超过5个，则是非保守区。选择的序列，要至少有1段超过100个碱基的保守片段，如果仅有几个突变碱基，而且找不到更好的片段，引物设计时可选择简并碱基。若突变碱基出现在5’端，可选择占多数的碱基，而不需要兼并碱基。

见TiLV对比序列图1-图3所示30个毒株的31个片段1的全基因序列信息部分对比情况图。其中TiLV对比序列图1，可以看出比对序列左侧增加了10个字母和“.”用来对准基因序列。TiLV对比序列图图2可以看出第1199-1219个碱基为TiLV F的序列，其中只有TV6在1216处碱基不是G，而是A，可考虑使用碱基G，而不用使用兼并碱基。

TiLV R的颠倒互补序列为5’-CATAGGCTCCTCGTATCAGAGTCA-3’(SEQ ID NO:9),TiLV对比序列图3可以看出第1430-1453个碱基为TiLV R序列的颠倒互补序列。图中1438处碱基除了F3-4毒株外，其余毒株碱基均为C；1441处碱基除了TV6毒株外，其余毒株碱基均为C；1444处碱基除了F3-4毒株外，其余毒株碱基均为A；1450处碱基除了TV7毒株外，其余毒株碱基均为G。这4处碱基突变毒株基因均只有1个，可以忽略，不选择兼并碱基，直接选择大多数基因共有的碱基。

将TiLV F、TiLV R引物序列在其余19个基因序列中进行查找分析，均可找出对应序列，说明该引物理论上能够扩增出所有TiLV毒株基因。

关于VNNV引物：见VNNV对比序列图4-图6所示4个毒株的衣壳蛋白部分基因序列信息对比情况图。NCBI网站只能搜索到4个罗非鱼VNNV衣壳蛋白的部分基因序列。

VNNV对比序列图4，对比该4个罗非鱼VNNV衣壳蛋白的部分基因序列，发现Oreochromis mossambicus莫桑比克罗非鱼GenBank登录号：GQ857479和其他三个基因序列相似性仅有69.82％，说明NCBI找到的莫桑比克罗非鱼VNNV衣壳蛋白部分序列和其他三个基因序列不在同一位置，故而只分析尼罗罗非鱼的VNNV衣壳蛋白部分序列，其GenBank登录号分别为：MN701084、MN698297、MN698298。

VNNV对比序列图5，比对尼罗罗非鱼的VNNV衣壳蛋白部分序列，其GenBank登录号分别为：MN701084、MN698297、MN698298。可以看出比对序列左侧增加了47个字母和“.”用来对准基因序列。

VNNV对比序列图6，VNNV F位于93-112碱基处；VNNV R的颠倒互补序列为5’-CTGGACCTCGTCGGGAAAG-3’，位于194-212碱基处。该段基因序列高度同源。

将获得的引物序列TiLV F、TiLV R、VNNV F、VNNV R通过软件进行发夹结构和引物二聚体，然后合成引物，进入试验阶段。

实施例2：引物浓度实验

将TiLV F、TiLV R、VNNV F、VNNV R初始引物(SEQ ID NO:1和2,SEQ ID NO:3和4)浓度配成50μM，并进行2倍梯度稀释，使用浓度依次为50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μM。进行TiLV、VNNV引物对不同浓度的方阵组合试验。结果见图7，其中通道2～6，TiLV F、TiLVR使用浓度为25μM(终浓度均为0.5μM)；7～11，TiLV F、TiLV R使用浓度为12.5μM(终浓度均为0.25μM)，12～16，TiLV F、TiLV R使用浓度为6.25μM(终浓度均为0.125μM)；17～21，TiLVF、TiLV R使用浓度为3.125μM(终浓度均为0.0625μM)；22～26，TiLV F、TiLV R使用浓度为1.5625μM(终浓度均为0.03125μM)。通道2、7、12、17、22VNNV F、VNNV R使用浓度为50μM(终浓度均为1μM)；通道3、8、13、18、23NNV F、NNV R使用浓度为25μM(终浓度均为0.5μM)；通道4、9、14、19、24VNNV F、VNNV R使用浓度为12.5μM(终浓度均为0.25μM)；通道5、10、15、20、25VNNV F、VNNV R使用浓度为6.25μM(终浓度均为0.125μM)；通道6、11、16、21、26VNNV F、VNNV R使用浓度为3.125μM(终浓度均为0.0625μM)。每个反应管加入TiLV质粒0.5μL，VNNV质粒0.5μL。反应条件：反转录，50℃，30min。预变性，94℃，2min。变性，94℃，30sec；退火，56±2℃，30sec；延伸，72℃，1min；30个循环。最终延伸，72℃，5min。试验显示，TiLV、VNNV其中一种引物对的浓度基本不影响另外一种引物对的扩增效果，引物的使用浓度在6.25～25μM之间均可取得较好的两条目的条带。在后续试验中一般选择TiLV F、TiLV R、VNNV F、VNNVR引物使用浓度为20μM，终浓度为0.4μM。

实施例3扩增退火温度实验

按照优选的反应体系配制试剂，平均分装到7个PCR反应管中。每个反应管加入TiLV质粒0.5μL，VNNV质粒0.5μL。退火温度依次设定为54、56、58、60、62、64、66℃。反应条件：反转录，50℃，30min。预变性，94℃，2min。变性，94℃，30sec；退火温度分别为，54、56、58、60、62、64、66℃，30sec；延伸，72℃，1min；30个循环。最终延伸，72℃，5min。结果见图8。从图8可以看出，退火温度54～66℃均扩增出255bp、120bp两条特异性条带，均可达到良好的扩增效果。一般的选择常用退火温度55℃。

实施例4灵敏度实验

将原始浓度为5μg/mL的TiLV质粒、VNNV质粒进行10倍梯度稀释，分别为5×10^-1～5×10^-7μg/mL。除了模板外，其他按照优选的反应体系配制试剂，平均分装到7个PCR反应管中。第1号到第7号的PCR反应管分别加入5×10^-1～5×10^-7ng/μL梯度稀释的TiLV质粒、VNNV质粒各0.5μL。第1号到第7号的PCR反应管对应的TiLV质粒、NNV质粒终浓度均分别为1×10^-2～1×10^-8ng/μL。按照优选的反应条件进行反转录和扩增。反应条件：反转录，50℃，30min。预变性，94℃，2min。变性，94℃，30sec；退火，56±2℃，30sec；延伸，72℃，1min；30个循环。最终延伸，72℃，5min。结果见图9的RT-dPCR灵敏度结果图。其中A为RT-dPCR灵敏度的凝胶电泳图，B为RT-dPCR灵敏度的信号图。A中泳道1为Size Marker C109200；泳道2～8依次为TiLV质粒、NNV质粒终浓度均分别为1×10^-8～1×10^-2ng/μL(对应的使用浓度分别为5×10^-7～5×10^-1ng/μL)。可以看出泳道5～8均可得到较好的特异性条带和特异性信号峰，泳道3和4虽然电泳图能够隐约看到扩增条带，但信号峰太弱，因此判定检测罗湖病毒(TiLV)和病毒性神经坏死病毒(VNNV)的dRT-PCR的灵敏度均为1×10^-5ng/μL。

实施例5模板干扰实验

按照优选的反应体系(模板除外)配制试剂，平均分装到8个PCR反应管中。第1管加0.5μL VNNV慢病毒核酸和0.5μLddH₂O、第2管加0.5μL VNNV质粒和0.5μLddH₂O、第3管加0.5μL VNNV病毒核酸和0.5μLddH₂O、第4管加0.5μL VNNV慢病毒+0.5μL TiLV慢病毒、第5管加0.5μL VNNV质粒+0.5μL TiLV质粒、第6管加0.5μL TiLV慢病毒和0.5μLddH₂O、第7管加1μLddH₂O。选择优选的反应条件进行TiLV、NNV相互干扰试验。反应条件：反转录，50℃，30min。预变性，94℃，2min。变性，94℃，30sec；退火，56±2℃，30sec；延伸，72℃，1min；30个循环。最终延伸，72℃，5min。结果见图10。其中1:VNNV慢病毒2:VNNV质粒3:VNNV病毒4:VNNV慢病毒+TiLV慢病毒；5:VNNV质粒+TiLV质粒6:TiLV慢病毒7:TiLV质粒8:阴性对照9:SizeMarker C109200。试验结果表明，TiLV或NNV模板不影响另外一条特异性条带的特异性，没有相互干扰现象。

实施例6特异性实验

按照优选的反应体系(模板除外)配制试剂，平均分装到12个PCR反应管中。分别加入TiLV质粒0.5μL+VNNV质粒0.5μL、真鲷虹彩病毒(RSIV)1μL、锦鲤疱疹病毒(KHV)1μL、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)1μL、金鱼造血器官坏死病毒(CyHV)1μL、流行性溃疡综合征(EUS)1μL、鲤春病毒血症(SVC)1μL、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)1μL、传染性鲑鱼贫血病(ISA)1μL、鲑鱼甲病毒(SAV)1μL、病毒性出血性败血症(VHSV)1μL。反应条件：反转录，50℃，30min。预变性，94℃，2min。变性，94℃，30sec；退火，56±2℃，30sec；延伸，72℃，1min；30个循环。最终延伸，72℃，5min。结果见图5。泳道依次为1:Size Marker C109200 2:VNNV质粒+TiLV质粒3:真鲷虹彩病毒(RSIV)4:锦鲤疱疹病毒(KHV)5:流行性造血器官坏死病毒(EHNV)6:金鱼造血器官坏死病毒(CyHV)7:流行性溃疡综合征(EUS)8:鲤春病毒血症(SVC)9:传染性造血器官坏死病毒(IHNV)10:传染性鲑鱼贫血病(ISA)11:鲑鱼甲病毒(SAV)12:病毒性出血性败血症(VHSV)13:阴性对照。图11结果显示，真鲷虹彩病毒等10种鱼类常见病毒均未出现特异性条带，本dRT-PCR方法特异性好。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门海关技术中心

<120> 一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT-PCR的引物组，试剂盒和

方法

<130> HGJSG-21002-CNI

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aacgatcaca ccttcgacgc 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctttcccgac gaggtccag 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaccccactt acacaacgag g 21

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgactctgat acgaggagcc tatg 24

<210> 5

<211> 255

<212> DNA

<213> 罗湖病毒（TiLV）

<400> 5

aaccccactt acacaacgag gaatgaggac ttcctcccca catgcctggg agggaagact 60

gtaattagct ttcaatctct actgacttgg gattgccacc cattttggta ccaagtgcac 120

cctgatggcc cagacactat agatcagaaa gtcctgtctg tccttgcctc aaagactcgc 180

agaaggagaa cccgactgga ggctctctca gacttggacc ccctggtccc tcataggctc 240

ctcgtatcag agtca 255

<210> 6

<211> 120

<212> DNA

<213> 病毒性神经坏死病毒（VNNV）

<400> 6

aacgatcaca ccttcgacgc gcttcaagca actcgtggtg cagtcgttgc caaatggtgg 60

gaaagcagaa cagtccgacc tcagtacacc cgcacgctcc tctggacctc gtcgggaaag 120

<210> 7

<211> 976

<212> DNA

<213> 罗湖病毒（TiLV）

<400> 7

agatctgtgt tgtcaaaggt ctcggcagta tacactgcta ctgctagtgc agaacaacgg 60

gctatgatgg ctgcgcaggt tgtagagtca agaagacatg ttcttaatgg cgactgtact 120

aagtacaatg aggcaatcga cgcagacaca ctactaaaag tgtgggatgc aataggcatg 180

gggtcgattg gagtcatgct cgcttacatg gtgcgcagga aatgcgttct cattaaagac 240

actctagtag agtgtccagg aggtatgttg atgggaatgt tcaacgcaac tgccaccttg 300

gcactacaag ggacgactga cagattcctg tctttcagcg acgactttat aacatcgttt 360

aactcgcctg ctgaattacg cgagatagag gacctgcttt tcgcaagctg tcataacttg 420

tcgctaaaga agagttacat ttcagttgcc tcactggaaa taaactcgtg taccctcact 480

agggacggtg acctagccac agggttaggt tgcactgctg gtgtcccctt cagggggcca 540

cttgtgactc tgaaacagac tgcagctatg ttatctggcg ctgttgactc aggagttatg 600

ccattccact cagcagaacg tctgttccag ataaagcagc aggaatgtgc ctataggtat 660

aacaacccca cttacacaac gaggaatgag gacttcctcc ccacatgcct gggagggaag 720

actgtaatta gctttcaatc tctactgact tgggattgcc acccattttg gtaccaagtg 780

caccctgatg gcccagacac tatagatcag aaagtcctgt ctgtccttgc ctcaaagact 840

cgcagaagga gaacccgact ggaggctctc tcagacttgg accccctggt ccctcatagg 900

ctcctcgtat cagagtcaga cgttagcaag attagagcag ctaggcaggc tcacttgaag 960

tctttaggtt tggaac 976

<210> 8

<211> 524

<212> DNA

<213> 病毒性神经坏死病毒（VNNV）

<400> 8

acgggcggtg gttacgttgc tggcttcctg cctgatccaa ctgacaacga tcacaccttc 60

gacgcgcttc aagcaactcg tggtgcagtc gttgccaaat ggtgggaaag cagaacagtc 120

cgacctcagt acacccgcac gctcctctgg acctcgtcgg gaaaggagca gcgtctcacg 180

tcacctggtc ggctgatact cctgtgtgtc ggcaacaaca ctgatgtggt caacgtgtcg 240

gtgctgtgtc gctggagtgt tcgattgagc gttccatctc ttgagacacc tgaagagact 300

accgctccca tcatgacaca aggttccctg tacaacgatt ccctttccaa gaatgacttc 360

aagtccatcc tcctaggatc cacaccactg gacattgtcc ctgatggagc agtcttcctg 420

ctggaccgtc cgctgtccat tgactacagc ctcgtaactg gagatgttga cagtggtgtt 480

tactggcaca tcaagaagtt tgctggaaat gctggcacac ctgc 524

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cataggctcc tcgtatcaga gtca 24

Claims (7)

1.一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT-PCR的引物组，其特征在于，所述引物组序列如SEQ ID NO:1和2，SEQ ID NO:3和4所示。

2.一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT-PCR的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括含有SEQ ID NO:5和6所示的DNA作为阳性对照。

4.一种同时检测罗湖病毒和病毒性神经坏死病毒的双重RT-PCR方法，其特征在于，含有如下步骤，将待测样本的DNA作为模板，进行双重RT-PCR，根据结果来判断即可。

5.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述双重RT-PCR的反应体系以25μL为例，含有12.5μL的2×One-Step Reaction Solution B；1μL的One-Step Enzyme Mix；0.5μL 20μM权利要求1的引物组中的每条引物；1μL待检核酸，余量为水。

6.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述RT-PCR的反应条件为，反转录，50℃，30min；预变性，94℃，2min；变性，94℃，30sec；退火，56±2℃，30sec；延伸，72℃，1min；30个循环；最终延伸，72℃，5min。

7.如权利要求4所述方法，其特征在于，根据结果来判断为根据电泳结果来看，TiLV质粒阳性对照在255bp处出现特异性条带，VNNV质粒阳性对照在120bp处出现特异性条带，阴性对照没有条带，则结果成立，继续判断，

若样本仅在255bp处出现特异性条带，则样品判定为TiLV dRT-PCR阳性；

若样品仅在120bp处出现特异性条带，则样品判定为VNNV dRT-PCR阳性；

若样品在255bp、120bp处均出现特异性条带，则样品判定为TiLV、VNNV dRT-PCR阳性；

若样品没有特异性条带，则样品为TiLV、VNNV dRT-PCR阴性。

Images