CN111793702A

CN111793702A - 一种用于检测嗜水气单胞菌的rpa引物组、探针和试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN111793702A
Application number: CN202010548159.2A
Authority: CN
Inventors: 尹纪元; 渠洋; 王庆; 李莹莹; 王英英; 任燕; 石存斌
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2020-06-16
Filing date: 2020-06-16
Publication date: 2020-10-20

Abstract

本发明公开了一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA引物、探针和试剂盒及其应用。本发明通过嗜水气单胞菌特定的保守区域设计筛选得到引物和探针的最佳组合，其检测特异性好，灵敏度高，检测效果稳定；而且与五种其他病毒相互交叉检测，无干扰信号产生，表现出良好的特异性。基于本发明所建立的RPA引物、探针，设计得到检测试剂及检测试剂盒，对于嗜水气单胞菌检测灵敏度为500pg/μL，检测灵敏度比PCR方法高10倍，检测时间仅需20min，大大缩短了检测时间。

Description

一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA引物组、探针和试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA引物、探针和试剂盒及其应用。

背景技术

嗜水气单胞菌是气单胞菌的一种，该菌普遍存在于水体环境中，是鱼类气单胞菌感染最主要的病原之一，也是鱼类细菌性败血病的主要原因之一。嗜水气单胞菌，在感染鱼类的同时，还能感染人类等哺乳动物以及两栖类、爬行类动物，导致痢疾、坏死性筋膜炎、败血症等疾病，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌。

嗜水气单胞菌存在多种毒力因子，包括黏附因子、内毒素和外毒素。嗜水气单胞菌的脂多糖(LPS)等内毒素可引起宿主的异常免疫反应，造成系统性炎症，即败血症或内毒素休克。此外，嗜水气单胞菌还可以产生大量细胞溶解性毒素和细胞毒性肠毒素等外毒素，如α-溶血素、β-溶血素、Ⅱ型分泌性成孔毒素Act、气单胞菌热不稳定细胞毒性肠毒素Alt和热稳定细胞毒性肠毒素Ast等。

由于嗜水气单胞菌广泛存在于水环境中，我国主要淡水养殖水产品，如草鱼、鲫鱼、鲢鱼、鲤鱼、罗非鱼、虹鳟、对虾、蛙类、龟鳖类等种均有感染报道。由于人类等哺乳动物也是嗜水气单胞菌易感染宿主，因此，如果食用了携带有嗜水气单胞菌的水产品将会给人类健康带来巨大的风险。

目前，嗜水气单胞菌的主要检测方法有：细菌的分离鉴定、间接免疫荧光检测、间接ELISA检测和PCR检测方法。但是目前常见的嗜水气单胞菌检测方法的检测时间较长，且均需要恒温培养箱、荧光显微镜、酶标仪、PCR仪等大型仪器设备完成检测，因此，很难实现对水产品的快速现场检测的实际需求。

因此，基于现有技术中对于水产品快速检测嗜水气单胞菌的成本及技术缺陷，亟需一种能实现快速、高效、准确的检测试剂及检测试剂盒，以满足实际生产需求。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA引物组；

本发明的另一目的在于提供一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA探针；

本发明的另一目的在于提供一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA检测试剂盒；

本发明的另一目的在于提供上述RPA检测试剂盒在嗜水气单胞菌检测中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA引物组，该RPA引物组的序列包括上游引物F和下游引物R；

其中，上述上游引物F选自：

1F：5’-ATCAATCCTGTTACCGGAGAAATACCAA-3’(SEQ ID NO:1)；

2F：5’-GAAATACCAACCTTGTCAGCTCTGGATA-3’(SEQ ID NO:2)；

4F：5’-CAATCACAGCCAATATGTCGGTGAAGAC-3’(SEQ ID NO:3)；

5F：5’-CTACAAGGCTGACATCTCCTATCCCTATGA-3’(SEQ ID NO:4)；

6F：5’-AATACCTGGTGTTACCCGATCAATCCTGTT-3’(SEQ ID NO:5)；

7F：5’-CAAACATGGTGATGTGACCCAGTCTGAT-3’；(SEQ ID NO:6)

8F：5’-CTGTTACCGGAGAAATACCAACCTTGTC-3’(SEQ ID NO:7)；

9F：5’-CAAACATGGTGATGTGACCCAGTCTGAT-3’(SEQ ID NO:8)中的至少一个；

上述下游引物R选自：

1R：5’-AGATAGCTGGTTGGCTTGATAAAATTCG-3’(SEQ ID NO:9)；

2R：5’-GTCACGTCCATGTCTTCACCGACATATTG-3’(SEQ ID NO:10)；

3R：5’-GTCACGTCCATGTCTTCACCGACATATT-3’(SEQ ID NO:11)；

4R：5’-GTTGTACGCAAAATTGCTGACCTTGATG-3’(SEQ ID NO:12)；

5R：5’-TATAGCGCTTGTCCCACTGGTAACGAAT-3’(SEQ ID NO:13)；

6R：5’-TTGATAAAATTCGCGCTGTCGTGTACCAGT-3’(SEQ ID NO:14)；

7R：5’-CTTGAACTTGTTCTTGGTGGTCACCTTCTC-3’(SEQ ID NO:15)；

8R：5’-AGGCATAACCGAGATAATGCGCCAGATAG-3’(SEQ ID NO:16)；

9R：5’-CTTGAACTTGTTCTTGGTGGTCACCTTCTC-3’(SEQ ID NO:17)中的至少一个。

上述引物均以嗜水气单胞菌溶血素基因(Hemolysin Hly)为靶基因，根据序列比对结果和参照文献，基于嗜水气单胞菌的保守序列设计多对RPA特异性引物，目的片段大小为100-200bp。

其中，上述嗜水气单胞菌的保守序列为：

5’-acaagtatcgccctattactcgagaggaagcccagagcgttaaaagcaatattgtcaatatgatggggcagtggcaaataagcggtctggccaacggctgggtaataatggggccgggttataatggtgaaataaaaccgggctcggcgtccaatacctggtgttacccgatcaatcctgttaccggagaaataccaaccttgtcagctctggatattccagacggtgacgaagtggacgtgcagtggcgactggtacacgacagcgcgaattttatcaagccaaccagctatctggcgcattatctcggttatgcctgggtgggtggcaatcacagccaatatgtcggtgaagacatggacgtgacccgtgatggcgatggctgggtgatccgtggcaacaatgacggcggttgcgaggggtatcgttgtggcgagaagacggccatcaaggtcagcaattttgcgtacaacctggaccctgacagcttcaaacgtggtgatgtgacccagtctgatcgccagctggtcaagacggtggtgggctgggcgatcaacgacagcgacaccccgcaatccggctatgatgtcaaggtgaccaccaagaacaagttcaagtggccactggtaggggaaaccgaactctccatcgagattgcggccaaccagtcctgggcctcccagaacgggggatctaccaccacctccctgtcgcaatccgtgcggccgacggtgccggcccgctccaagatcccggtgaagatcgagctctacaaggctgacatctcctatccctatgaattcaaagccgatgtcagctatgacctgaccctgagcggcttcctgcgctggggcggcaatgcctggtatacccatccggacaaccgcccgaactggaaccacaccttcgtcatcgggccgtacaaggacaaggcgagcagcattcgttaccagtgggacaagcgctatatcccgggtgaagtgaagtggtgggactggaactggaccatacagcagaacggcctgtctaccatgcagaac-3’(SEQ ID NO:18)。

进一步地，上述RPA引物组的序列为：

上游引物1F：5’-ATCAATCCTGTTACCGGAGAAATACCAA-3’(SEQ ID NO:1)；

下游引物2R：5’-GTCACGTCCATGTCTTCACCGACATATTG-3’(SEQ ID NO:10)。

RPA(重组酶聚合酶扩增)技术，利用大肠杆菌重组酶的DNA聚合活性，体系中加入单链DNA结合蛋白(SSB)，通过设计特异性引物，实现靶标DNA序列在恒温条件下快速复制。RPA技术应用于现场检测方面具有很大的优势。RPA体系中含有大肠杆菌重组酶和单链结合蛋白(SSB)两种关键蛋白，可替代PCR中的热变性步骤，实现DNA片段的恒温扩增，因此反应对硬件设备的要求很低，不需要模板的热变性；RPA反应具有高效性，一般反应温度在37℃左右，10min之内获得可检出水平的扩增产物。

本发明的第二个方面，提供：

一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA探针，上述RPA探针序列为：5'-CAGTGGCGACTGGTACACGACAGCGCGAAT(荧光基团)T(THF)A(猝灭基团)CAAGCCAACCAGCTATC(修饰基团)-3'(SEQ ID NO:19)。

本发明中探针设计要求包括：

探针序列长度为46-52个碱基；

将靠近的2个T碱基分别以荧光基团和猝灭基团代替，其中荧光基团和猝灭基团替换目的基因中相应碱基T，而不是插入；

荧光基团和猝灭基团之间隔2-4个碱基，选择其中一个碱基用THF代替，THF之前不能少于30个碱基(既5’端至THF之间的序列碱基数大于或等于30)；THF之后不少于15个碱基(既3’端至THF之间的序列碱基数大于或等于15)；

3'端标记一个修饰基团；

探针序列和引物识别位点不能重叠，避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。

进一步地，上述荧光基团包括FAM；优选地，上述荧光基团为FAM-dT；

上述猝灭基团包括BHQ；优选地，上述猝灭基团为BHQ-dT；

上述THF代表四氢呋喃分子；

上述修饰基团包括C3-sapcer。

进一步地，上述探针序列为：

Hly-FAM：5'-CAGTGGCGACTGGTACACGACAGCGCGAAT(FAM-dT)T(THF)A(BHQ1-dT)CAAGCCAACCAGCTATC(C3-sapcer)-3'(SEQ ID NO:19)。

本发明的第三个方面，提供：

一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA检测试剂盒，该RPA检测试剂盒包括上述的引物组、上述的探针、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、重组酶。

进一步地，上述RPA检测试剂盒还包括嗜水气单胞菌阳性对照。

本发明的第四个方面，提供：

上述的RPA检测试剂盒在嗜水气单胞菌检测中的应用。

进一步地，上述嗜水气单胞菌检测对象为水产品。

进一步地，上述嗜水气单胞菌的检测步骤包括：

采集样品，提取核苷酸；

将提取的核苷酸与上述的引物组、再水化缓冲液、重组酶混合；

加入醋酸镁溶液，进行RPA扩增；

对RPA扩增产物进行荧光检测；

若检测到荧光，则样品中含有嗜水气单胞菌，若未检测到荧光，则不含有嗜水气单胞菌。

上述再水化缓冲液、醋酸镁溶液、重组酶均购自杭州众测生物科技有限公司。

再水化缓冲液为杭州众测生物科技有限公司的产品Abuffer；

醋酸镁溶液为杭州众测生物科技有限公司的产品B buffer。

重组酶以重组酶干粉管的形式。当然根据实际需要，可以选择本领域任何可替代形式。

进一步地，上述RPA扩增体系为：

进一步地，上述RPA扩增的条件为：37-39℃扩增18-22分钟。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供的引物和探针，均通过嗜水气单胞菌特定的保守区域设计筛选得到，并通过对不同引物探针组合进行比较，确定最佳组合。其检测特异性好，灵敏度高，检测效果稳定；而且与五种其他病毒相互交叉检测，无干扰信号产生，表现出良好的特异性。

2.基于本发明所建立的RPA引物、探针，设计得到检测试剂及检测试剂盒，根据实施例的记载，本发明对于嗜水气单胞菌检测灵敏度为500pg/μL，其检测灵敏度比PCR方法高10倍。不需要大型仪器设备，检测时间仅需20min，大大缩短了检测时间。

附图说明

图1为部分引物组合的荧光信号曲线图，其中，1F2R代表上游引物F1和下游引物R2的组合，2F2R代表上游引物F2和下游引物R2的组合，1F3R代表上游引物F1和下游引物R3的组合，1F9R代表上游引物F1和下游引物R9的组合，9F8R代表上游引物F9和下游引物R8的组合；

图2为本发明的引物、探针对嗜水气单胞菌检测的灵敏性结果；其中a为RPA方法对不同浓度的核酸的检出情况(104、103、102、101、100、10-1、10-2分别代表5×10⁴pg/μL、5×10³pg/μL、5×10²pg/μL、5×10¹pg/μL、5×10⁰pg/μL、5×10^-1pg/μL、5×10^-2pg/μL的模板浓度)；b为PCR方法对不同浓度的核酸的检出情况(M：marker200，N：阴性对照，1-7：分别代表5×10⁴pg/μL、5×10³pg/μL、5×10²pg/μL、5×10¹pg/μL、5×10⁰pg/μL、5×10^-1pg/μL、5×10^- ²pg/μL的模板浓度)；

图3为本发明的引物、探针对嗜水气单胞菌检测的特异性结果(A1：沙门氏菌，A2：大肠杆菌，A3：铜绿假单胞菌，A4：金黄色葡萄球菌，A5：志贺氏菌，A6：霍乱弧菌，A7：迟缓爱德华氏菌，A8：NJ-35嗜水气单胞菌，B1：实验室分离的维氏气单胞菌A；B2：实验室分离的维氏气单胞菌B；B3：ATCC7966嗜水气单胞菌；B4：WL-2舒伯特气单胞菌)；

图4为本发明的引物、探针对嗜水气单胞菌检可重复性结果。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

再水化缓冲液、醋酸镁溶液、重组酶均购自杭州众测生物科技有限公司。

再水化缓冲液为杭州众测生物科技有限公司的产品——A buffer；

醋酸镁溶液为杭州众测生物科技有限公司的产品——B buffer；

重组酶为杭州众测生物科技有限公司的产品——干粉管。

细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

实施例1实验菌株的培养及基因组DNA提取

用本实验室由广东、广西、江西、湖北等地采集、分离并保存菌株进行实验：嗜水气单胞菌、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、迟缓爱德华氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺氏菌。

将各菌株接种到5ml的LB肉汤中，恒温培养箱37℃震荡培养18h，取菌液进行斜面划线接种至LB固体培养基，37℃恒温培养18h，出现单菌落。

取各菌株纯培养菌液，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，-20℃保存备用，同时使用超微量分光光度计测定浓度。

实施例2RPA引物与探针设计及筛选

从NCBI基因库中下载嗜水气单胞菌编码溶血素基因的DNA序列，用DNAman软件进行序列比对，找出相对保守的序列。

确定的保守序列如下：

以嗜水气单胞菌溶血素基因(Hemolysin Hly)为靶基因，根据序列比对结果和参照文献基于嗜水气单胞菌的保守序列设计多对RPA特异性引物，目的片段大小为100-200bp。送往生工生物工程(上海)股份有限公司合成后进行筛选。

RPA引物设计要求：

(1)从比对的病毒保守序列单链选择30-35个碱基作为上、下游引物；

(2)控制两个引物之间的碱基长度在100-300bp之间；

(3)5’端的dNTP避免鸟嘌呤；

(4)控制GC含量在30％到70％之间；

(5)引物与引物之间不超过三个以上连续互补配对碱基；

(6)使用PRIMER 5.0软件进行分析，分析上游引物和下游引物，避免上游引物和下游引物形成发卡结构或其他二级结构。

探针的设计要求：

(1)选择长度为49bp的与病毒链互补的DNA链，在核酸链之中设计一个四氢呋喃残基；

(2)在四氢呋喃两侧间隔一个碱基修饰上荧光基团和淬灭剂基团，荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ；

(3)探针的3’端修饰C3-Spacer；

(4)5’端至THF之间的序列碱基数大于或等于30，3’端至THF之间的序列碱基数大于或等于15。

获得的多对引物序列如下：

其中，上游引物F包括：

1F：5’-ATCAATCCTGTTACCGGAGAAATACCAA-3’(SEQ ID NO:1)；

2F：5’-GAAATACCAACCTTGTCAGCTCTGGATA-3’(SEQ ID NO:2)；

4F：5’-CAATCACAGCCAATATGTCGGTGAAGAC-3’(SEQ ID NO:3)；

5F：5’-CTACAAGGCTGACATCTCCTATCCCTATGA-3’(SEQ ID NO:4)；

6F：5’-AATACCTGGTGTTACCCGATCAATCCTGTT-3’(SEQ ID NO:5)；

7F：5’-CAAACATGGTGATGTGACCCAGTCTGAT-3’；(SEQ ID NO:6)

8F：5’-CTGTTACCGGAGAAATACCAACCTTGTC-3’(SEQ ID NO:7)；

9F：5’-CAAACATGGTGATGTGACCCAGTCTGAT-3’(SEQ ID NO:8)；

下游引物R包括：

1R：5’-AGATAGCTGGTTGGCTTGATAAAATTCG-3’(SEQ ID NO:9)；

2R：5’-GTCACGTCCATGTCTTCACCGACATATTG-3’(SEQ ID NO:10)；

3R：5’-GTCACGTCCATGTCTTCACCGACATATT-3’(SEQ ID NO:11)；

4R：5’-GTTGTACGCAAAATTGCTGACCTTGATG-3’(SEQ ID NO:12)；

5R：5’-TATAGCGCTTGTCCCACTGGTAACGAAT-3’(SEQ ID NO:13)；

6R：5’-TTGATAAAATTCGCGCTGTCGTGTACCAGT-3’(SEQ ID NO:14)；

7R：5’-CTTGAACTTGTTCTTGGTGGTCACCTTCTC-3’(SEQ ID NO:15)；

8R：5’-AGGCATAACCGAGATAATGCGCCAGATAG-3’(SEQ ID NO:16)；

9R：5’-CTTGAACTTGTTCTTGGTGGTCACCTTCTC-3’(SEQ ID NO:17)。

获得的探针序列如下：

Hly-FAM：5'-CAGTGGCGACTGGTACACGACAGCGCGAAT(FAM-dT)T(THF)A(BHQ-dT)CAAGCCAACCAGCTATC(C3-sapcer)-3'(SEQ ID NO:19)。

对筛选出的引物进行优选处理。

在重组酶干粉管中，依次加入以下体积的组分(表1)：

表1重组酶干粉管中的各组分体积

Abuffer	40.9μl
		10μmol/L上游引物F	2μl
10μmol/L下游引物R	2μl
		探针	0.6μl
DNA模板(样品)	2μl
		B buffer	2.5μl

其中，上游引物F和下游引物R取自上述获得的多对引物序列，分别取任一条上游引物F和任一条下游引物R进行配对测试，该配对包括以上上游引物F和下游引物R的所有配对组合。

进行RPA扩增，对RPA扩增产物进行荧光检测。扩增反应条件为39℃、20分钟。

观察各引物组合荧光信号曲线强弱。最终确定和该探针最合适的引物组合为F1R2(图1为部分引物组合的荧光信号强度示意图，F1R2显示强荧光信号)。

实施例3效果验证

随机选取嗜水气单胞菌的标准菌株，采用实施例1-2中的方法提取DNA并用F1R2引物组合进行RPA扩增，观察荧光信号结果。

结果：观察到荧光信号，说明本发明中的F1R2引物组合具有检测效果。

实施例4用于嗜水气单胞菌检测的试剂盒的制备

本发明中的用于嗜水气单胞菌检测的RPA试剂盒包括引物F1R2、检测试剂。

检测试剂包括购自杭州众测的重组酶干粉管、Abuffer、B buffer。

所述试剂盒的使用方法：

(1)在干粉管中加入Abuffer 41.5μL。

(2)加入RPA扩增的上游引物、下游引物、样品DNA各2μL。

(3)在干粉管的盖子上加入B buffer 2.5μL，温度为39℃，预热3min，震荡并短暂离心。

(4)将离心后的溶液体系置于恒温荧光检测仪(GEN3-02-P1)中，39℃下继续反应30min。

(5)记录荧光数据并分析结果。

本发明中的用于嗜水气单胞菌检测的RPA反应的体系如下表所示：

表2本发明中的RPA反应体系

实施例5灵敏度试验

灵敏度试验包括如下步骤：

(1)用细菌基因组DNA提取试剂盒提取嗜水气单胞菌基因组；

(2)将嗜水气单胞菌基因组按10倍梯度从5×10⁴pg/μL、5×10³pg/μL、5×10²pg/μL、5×10¹pg/μL、5×10⁰pg/μL、5×10^-1pg/μL、5×10^-2pg/μL进行梯度稀释；

(3)按照上述的本发明试剂盒的使用方法，加入步骤(2)中的不同浓度模板，震荡离心；

(4)预热3min后短暂震荡离心，将离心后的溶液体系加入恒温荧光检测仪中，设置温度为39℃，反应时长为30min；

(5)用步骤(2)中的不同浓度模板进行PCR检测。

PCR上游引物：5’-ATTGGATCCCTGCCTATCGCTTCAGTTCA-3’(SEQ ID NO:20)；

PCR下游引物：5’-GCTAAGCTTGCATCCGTGCCGTATTCC-3’(SEQ ID NO:21)。

(6)比较本发明试剂盒与PCR检测结果。

实施例6灵敏度试验

特异性试验包括如下步骤：

(1)取浓度均为5×10³pg/μL的嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、迟缓爱德华氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺氏菌，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取核酸。

(2)按照上述的本发明试剂盒的使用方法，进行PRA扩增，加样试剂和体积如表1所示，加入上述不同模板，震荡离心。

(3)预热3min后短暂震荡离心，将离心后的溶液体系加入恒温荧光检测仪中，设置温度为39℃，反应时长为30min。

(4)记录荧光数据并分析结果。

结果

检测结果如图2-3所示。

图2为灵敏度检测结果：用7个浓度梯度的嗜水气单胞菌提取基因组进行灵敏度验证，随着被检测菌量的降低，荧光信号在同一时间点(如15min时)不断减弱，可得到其检测下限为5×100pg/μL。本研究建立的RPA方法比PCR检测灵敏性高10倍。表明该引物和探针具有很好的检测灵敏性，PCR检测且至少需要35个循环数，大约2h；而RPA检测方法能够在30min内判定检测结果。

图3为特异性检测结果(A1：沙门氏菌，A2：大肠杆菌，A3：铜绿假单胞菌，A4：金黄色葡萄球菌，A5：志贺氏菌，A6：霍乱弧菌，A7：迟缓爱德华氏菌，A8：NJ-35嗜水气单胞菌，B1：维氏气单胞菌A；B2：维氏气单胞菌B；B3：ATCC7966--嗜水气单胞菌；B4：WL-2--舒伯特气单胞菌)。通过采用筛选的引物和探针组合，对嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、迟缓爱德华氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺氏菌等核酸模板进行荧光RPA检测，并设置了阴性对照。仅嗜水气单胞菌有荧光扩增曲线，呈阳性。而其他病原菌和阴性对照都没有荧光曲线，呈阴性。表明所建立的荧光RPA法能对嗜水气单胞菌进行特异性检测，与铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、迟缓爱德华氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺氏菌病原菌核酸无交叉反应，特异性强。

实施例7引物、探针的可重复性的验证

(1)用细菌基因组DNA提取试剂盒提取嗜水气单胞菌基因组。

(2)将嗜水气单胞菌基因组按10倍梯度从5×10⁴pg/μL、5×10³pg/μL、5×10²pg/μL、5×10¹pg/μL、5×10⁰pg/μL、5×10^-1pg/μL、5×10^-2pg/μL进行梯度稀释；每个稀释度重复检测3次，根据荧光曲线出现的时间计算其变异系数，分析荧光RPA方法的稳定性。

(3)按照上述的本发明试剂盒的使用方法，进行PRA扩增，加样试剂和体积如表1所示，加入上述不同模板，震荡离心。

(4)记录荧光数据并分析结果。

检测结果如图4所示：相同稀释度样品的检测结果之间无显著性差异，表明该引物和探针具有很好的可重复性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA引物组、探针和试剂盒及其应用

<130>

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atcaatcctg ttaccggaga aataccaa 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaataccaa ccttgtcagc tctggata 28

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caatcacagc caatatgtcg gtgaagac 28

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctacaaggct gacatctcct atccctatga 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aatacctggt gttacccgat caatcctgtt 30

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caaacatggt gatgtgaccc agtctgat 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctgttaccgg agaaatacca accttgtc 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caaacatggt gatgtgaccc agtctgat 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agatagctgg ttggcttgat aaaattcg 28

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtcacgtcca tgtcttcacc gacatattg 29

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtcacgtcca tgtcttcacc gacatatt 28

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gttgtacgca aaattgctga ccttgatg 28

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tatagcgctt gtcccactgg taacgaat 28

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttgataaaat tcgcgctgtc gtgtaccagt 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cttgaacttg ttcttggtgg tcaccttctc 30

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aggcataacc gagataatgc gccagatag 29

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cttgaacttg ttcttggtgg tcaccttctc 30

<210> 18

<211> 1040

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

acaagtatcg ccctattact cgagaggaag cccagagcgt taaaagcaat attgtcaata 60

tgatggggca gtggcaaata agcggtctgg ccaacggctg ggtaataatg gggccgggtt 120

ataatggtga aataaaaccg ggctcggcgt ccaatacctg gtgttacccg atcaatcctg 180

ttaccggaga aataccaacc ttgtcagctc tggatattcc agacggtgac gaagtggacg 240

tgcagtggcg actggtacac gacagcgcga attttatcaa gccaaccagc tatctggcgc 300

attatctcgg ttatgcctgg gtgggtggca atcacagcca atatgtcggt gaagacatgg 360

acgtgacccg tgatggcgat ggctgggtga tccgtggcaa caatgacggc ggttgcgagg 420

ggtatcgttg tggcgagaag acggccatca aggtcagcaa ttttgcgtac aacctggacc 480

ctgacagctt caaacgtggt gatgtgaccc agtctgatcg ccagctggtc aagacggtgg 540

tgggctgggc gatcaacgac agcgacaccc cgcaatccgg ctatgatgtc aaggtgacca 600

ccaagaacaa gttcaagtgg ccactggtag gggaaaccga actctccatc gagattgcgg 660

ccaaccagtc ctgggcctcc cagaacgggg gatctaccac cacctccctg tcgcaatccg 720

tgcggccgac ggtgccggcc cgctccaaga tcccggtgaa gatcgagctc tacaaggctg 780

acatctccta tccctatgaa ttcaaagccg atgtcagcta tgacctgacc ctgagcggct 840

tcctgcgctg gggcggcaat gcctggtata cccatccgga caaccgcccg aactggaacc 900

acaccttcgt catcgggccg tacaaggaca aggcgagcag cattcgttac cagtgggaca 960

agcgctatat cccgggtgaa gtgaagtggt gggactggaa ctggaccata cagcagaacg 1020

gcctgtctac catgcagaac 1040

<210> 19

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cagtggcgac tggtacacga cagcgcgaat tacaagccaa ccagctatc 49

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

attggatccc tgcctatcgc ttcagttca 29

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gctaagcttg catccgtgcc gtattcc 27

Claims

1.一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA引物组，其特征在于，所述RPA引物组的序列包括上游引物F和下游引物R；

所述上游引物F选自：

1F：5’-ATCAATCCTGTTACCGGAGAAATACCAA-3’；

2F：5’-GAAATACCAACCTTGTCAGCTCTGGATA-3’；

4F：5’-CAATCACAGCCAATATGTCGGTGAAGAC-3’；

5F：5’-CTACAAGGCTGACATCTCCTATCCCTATGA-3’；

6F：5’-AATACCTGGTGTTACCCGATCAATCCTGTT-3’；

7F：5’-CAAACATGGTGATGTGACCCAGTCTGAT-3’；

8F：5’-CTGTTACCGGAGAAATACCAACCTTGTC-3’；

9F：5’-CAAACATGGTGATGTGACCCAGTCTGAT-3’中的至少一个；

所述下游引物R选自：

1R：5’-AGATAGCTGGTTGGCTTGATAAAATTCG-3’；

2R：5’-GTCACGTCCATGTCTTCACCGACATATTG-3’；

3R：5’-GTCACGTCCATGTCTTCACCGACATATT-3’；

4R：5’-GTTGTACGCAAAATTGCTGACCTTGATG-3’；

5R：5’-TATAGCGCTTGTCCCACTGGTAACGAAT-3’；

6R：5’-TTGATAAAATTCGCGCTGTCGTGTACCAGT-3’；

7R：5’-CTTGAACTTGTTCTTGGTGGTCACCTTCTC-3’；

8R：5’-AGGCATAACCGAGATAATGCGCCAGATAG-3’；

9R：5’-CTTGAACTTGTTCTTGGTGGTCACCTTCTC-3’中的至少一个。

2.根据权利要求1所述的RPA引物组，其特征在于，所述RPA引物组的序列为：

上游引物1F：5’-ATCAATCCTGTTACCGGAGAAATACCAA-3’；

下游引物2R：5’-GTCACGTCCATGTCTTCACCGACATATTG-3’。

3.一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA探针，其特征在于，所述RPA探针序列为：5'-CAGTGGCGACTGGTACACGACAGCGCGAAT(荧光基团)T(THF)A(猝灭基团)CAAGCCAACCAGCTATC(修饰基团)-3'。

4.根据权利要求3所述的RPA探针，其特征在于，所述荧光基团包括FAM；所述猝灭基团包括BHQ；所述THF代表四氢呋喃分子；所述修饰基团包括C3-sapcer。

5.一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA检测试剂盒，其特征在于，所述RPA检测试剂盒包括权利要求1-2任一所述的引物组、权利要求3-4任一所述的探针、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、重组酶。

6.根据权利要求5所述的RPA检测试剂盒，其特征在于，所述RPA检测试剂盒还包括嗜水气单胞菌阳性对照。

7.权利要求5-6任一所述的RPA检测试剂盒在嗜水气单胞菌检测中的应用。

8.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述嗜水气单胞菌的检测步骤包括：

采集样品，提取核苷酸；

将提取的核苷酸与权利要求1-2任一所述的引物组、再水化缓冲液、重组酶混合；

加入醋酸镁溶液，进行RPA扩增；

对RPA扩增产物进行荧光检测；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述RPA扩增体系为：

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述RPA扩增条件为：37-39℃扩增18-22分钟。