JP2008136386A - ホップ潜在ウイルスの検出方法、検出用プライマーセット及び検出用キット - Google Patents

Abstract

【課題】ホップ潜在ウイルスを検出する抗体の性能（力価及び特異性）、検体数及び評価を行う場所を選ばず、栽培時・収穫時・保管時等のあらゆる季節において、ホップ潜在ウイルスを特異的かつ高感度に検出する方法を提供する。
【解決手段】検体からホップ潜在ウイルスのＲＮＡを抽出する抽出ステップと、特定な塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、このＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＬＡＭＰ法によってｃＤＮＡの増幅反応を行う増幅ステップと、特定な塩基配列を含有するｃＤＮＡの増幅が増幅ステップで認められた場合にホップ潜在ウイルスが存在すると判断する判断ステップと、を含む検出方法。
【選択図】なし

Description

ホップ潜在ウイルスの検出方法、検出用プライマーセット及び検出用キットに関する。

ホップ潜在ウイルスは、カルラウイルス属に属する植物病原性ウイルスであり、主にホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ Ｌ．）に感染する。ホップ潜在ウイルスがホップに一度感染すると、アブラムシの媒介によってホップの感染被害が拡大する。

ドイツ、アメリカ、イギリス及びチェコ等のホップの主要生産国並びに日本では、ホップ潜在ウイルスによる感染被害を防ぐため、茎頂培養によって生産したウイルスフリー苗を用いてホップの栽培が行われている。

ホップを栽培している農場では、ホップ潜在ウイルスの感染調査が定期的に行われ、ホップ潜在ウイルスの二次感染を防いでいる。ホップ潜在ウイルスの感染調査は、ホップに感染しているホップ潜在ウイルスをＥＬＩＳＡ法で検出するのが一般的である。

ＥＬＩＳＡ法によるホップ潜在ウイルスの検出方法は、ホップ潜在ウイルスを特異的に認識する一次抗体が固相されたマイクロプレート中で、検体に含まれるホップ潜在ウイルス粒子と一次抗体とを反応させるステップと、一次抗体に結合しなかった検体中の成分を洗浄するステップと、一次抗体と結合したホップ潜在ウイルス粒子と、酵素標識され、かつ、ホップ潜在ウイルスを特異的に認識する二次抗体とを反応させるステップと、ホップ潜在ウイルス粒子に結合しなかった二次抗体を洗浄するステップと、ニ次抗体に標識されている酵素と化学発色基質又は化学発光基質とを酵素反応させるステップと、酵素反応によって得られた発色又は発光の強さからホップ潜在ウイルス粒子の量を見積もるステップと、から構成される。

Ａｄａｍｓら、１９８２年、Ａｎｎ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｌ．、１０１巻、ｐ．４８３−４９４ Ｈａｔａｙａら、２０００年、Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．、１４５巻、ｐ．２５０３−２５２４

しかしながら、ＥＬＩＳＡ法で使用するホップ潜在ウイルスを認識する抗体の力価や特異性が不十分な場合には、検体中に存在するホップ潜在ウイルス以外の成分の影響を受けるため、ホップ潜在ウイルスの存在を示すシグナルをバックグラウンドのシグナルとして評価したり、非特異的な結合をホップ潜在ウイルスの存在を示すシグナルとして評価したりすることが生じる。

また、ＥＬＩＳＡ法によるホップ潜在ウイルスの検出方法は、上記の通り複数のステップから構成されており、各ステップは実験室で反応時間及び洗浄回数等を決めて同じ条件で作業する必要があるが、検体数が増加した場合には、各ステップでの作業は煩雑となり、正確な評価に支障をきたす傾向がある。

さらに、ＥＬＩＳＡ法は、ウイルス粒子そのものをターゲットとして検出する方法であるため、ウイルスゲノム又は宿主ゲノムに組み込まれたプロウイルスを検出することはできず、例えば、高温のためにホップ潜在ウイルス粒子の含有量が著しく低下することが知られている夏季には、ホップ潜在ウイルスに感染されているホップであっても擬陽性又は未検出と判断される場合がある。

そこで本発明の目的は、上記の問題点に鑑み、ホップ潜在ウイルスを検出する抗体の性能（力価及び特異性）、検体数及び評価を行う場所を選ばず、栽培時・収穫時・保管時等のあらゆる季節において、ホップ潜在ウイルスを特異的かつ高感度に検出する方法を提供することにある。本発明の目的はまた、この方法に使用するホップ潜在ウイルスの検出用プライマーセット及び検出用キットを提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明は、ホップ潜在ウイルスの検出方法であって、検体からホップ潜在ウイルスのＲＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、このＲＮＡを鋳型にＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ−ＬＡＭＰ）法によってｃＤＮＡの増幅反応を行う増幅ステップと、配列表の配列番号８で示される塩基配列を含有するｃＤＮＡの増幅が増幅ステップで認められた場合にホップ潜在ウイルスが存在すると判断する判断ステップと、を含む検出方法を提供する。

本発明者らは、等温の遺伝子増幅反応であるＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（以下、ＲＴ−ＬＡＭＰ法）を利用し、ホップ潜在ウイルスのコートタンパク質遺伝子の特定の領域を増幅することにより、ホップ潜在ウイルスの検出を簡易かつ高感度に行い得ることを見出した。ここで、「ＲＴ−ＬＡＭＰ法」とは、逆転写反応とＬＡＭＰ法による等温遺伝子増幅反応が組み合わされ、ＲＮＡを鋳型にこれに相補的なｃＤＮＡを増幅する方法である。原理の詳細部分については、国際公開第００／２８０８２号パンフレットに記載されている。

上記検出方法に従って、ホップ潜在ウイルスの感染の有無を調べたいホップの組織からＲＮＡを抽出し、その抽出液に配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを加えてＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応を行えば、ホップ潜在ウイルスのゲノムＲＮＡの一部配列のｃＤＮＡを簡易かつ高感度に検出することが可能となり、ホップ潜在ウイルスの感染の有無を判断できる。

また、配列表の配列番号８で示される塩基配列に相補的なホップ潜在ウイルスのゲノムＲＮＡの塩基配列及び配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドがそれぞれアニールするホップ潜在ウイルスのゲノムＲＮＡの塩基配列は、ホップ潜在ウイルスのコートタンパク質遺伝子の一部配列であり、これらの塩基配列を含有するホップ潜在ウイルスのゲノムＲＮＡの領域は、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によってｃＤＮＡを増幅するための標的領域として適している。このため、増幅されたｃＤＮＡの有無を確認することによって、ホップ潜在ウイルスの有無を特異的に検出できる。

上記プライマーセットは、配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットであることがより好ましい。

配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドに、配列表の配列番号５及び６で示される塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチドをＬｏｏｐ Ｐｒｉｍｅｒとして加えてｃＤＮＡの増幅反応を行えば、ＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となるため、増幅時間を短縮でき、より効率的なホップ潜在ウイルスの検出が可能となる。

また本発明は、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチド又は配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のオリゴヌクレオチド、を含むホップ潜在ウイルスの検出用プライマーセットを提供する。

ホップ潜在ウイルスの感染の有無を調べたいホップの組織からＲＮＡを抽出し、その抽出液に上記プライマーセットを加えてＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応を行えば、ホップ潜在ウイルスのゲノムＲＮＡの一部配列のｃＤＮＡを簡易かつ高感度に検出することが可能となり、ホップ潜在ウイルスの感染の有無を判断できる。

また本発明は、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチド又は配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のオリゴヌクレオチド、からなるホップ潜在ウイルスの検出用プライマーセット、逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含むホップ潜在ウイルスの検出用キットを提供する。

上記検出用キットがあれば、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるホップ潜在ウイルスの検出に必要な試薬を同時に入手することが可能であり、例えば、野外でホップ潜在ウイルスの検出を行なう場合であっても、試薬の濃度調製等の煩雑な作業が不要となり、簡易にホップ潜在ウイルスの検出を行なうことができる。

本発明によれば、検体数及び評価を行う場所を選ばず、栽培時・収穫時・保管時等のあらゆる季節において、ホップ潜在ウイルスを特異的かつ高感度に検出することができる。また、本発明のホップ潜在ウイルスの検出用プライマーセット及び検出用キットは、ＲＴ−ＬＡＭＰ法に好適に使用でき、ホップ潜在ウイルスの簡易かつ高感度な検出を可能にする。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。

本発明のホップ潜在ウイルスの検出方法は、検体からホップ潜在ウイルスのＲＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、このＲＮＡを鋳型にＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ−ＬＡＭＰ）法によってｃＤＮＡの増幅反応を行う増幅ステップと、配列表の配列番号８で示される塩基配列を含有するｃＤＮＡの増幅が増幅ステップで認められた場合にホップ潜在ウイルスが存在すると判断する判断ステップとを含むことを特徴としている。

「ホップ潜在ウイルス」とは、Ｈｏｐ Ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓのことであって、カルラウイルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）属に属するＲＮＡウイルスである。ホップ潜在ウイルスの宿主は、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ Ｌ．）であり、ホップ潜在ウイルスの感染を受けたホップは、毬花の収量が減少することが知られている。

上記検出方法で使用する「検体」としては、例えば、植物の葉、茎、根及び果実等を例示できるが、サンプリングが容易なことより葉及び果実が好ましく、葉がより好ましい。検体をサンプリングする時期としては、例えば、栽培時、収穫時及び保管時等を例示できる。

上記抽出ステップでは、細胞壁で囲まれた植物細胞中に存在しているホップ潜在ウイルスのＲＮＡを抽出するが、例えば、蒸留水又は弱アルカリ性付近のｐＨを有する緩衝液中で検体を物理的にホモジナイズすることによりホップ潜在ウイルスのＲＮＡを抽出できる。

使用する緩衝液のｐＨは、例えば、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．５付近が好ましく、使用する緩衝液としては、例えば、トリス／塩酸緩衝液、トリス／酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。また、検体からホップ潜在ウイルスのＲＮＡをより効率的に抽出するには、植物からＲＮＡを抽出する方法やゲノムＤＮＡを抽出する方法が適しており、これらの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）等の遺伝子工学プロトコールに記載されている。ＲＮＡを抽出する方法では、グアニジンチオシアネートを、ゲノムＤＮＡを抽出する方法では、Ｃｅｔｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（以下、ＣＴＡＢ）を含有した抽出バッファーを使用するのがより好ましい。

ホモジナイズは、検体の細胞壁を壊し、植物細胞中に存在するホップ潜在ウイルスのＲＮＡを抽出できればよく、例えば、ポリトロンホモジナイザー、テフロンホモジナイザー、乳鉢等を用いて行うことができる。また、検体を凍結した状態でホモジナイズすれば、より効率的に検体の細胞壁を壊し、細胞中に存在するホップ潜在ウイルスのＲＮＡを容易に抽出できる。また、上記したグアニジンチオシアネートを含有するＲＮＡ抽出バッファーやＣＴＡＢを含有するゲノムＤＮＡ抽出バッファーを使用する場合には、ボルテックスミキサー等で撹拌を繰り返すだけでも、細胞中に存在するホップ潜在ウイルスのゲノムＲＮＡを抽出することが可能である。

抽出ステップで抽出されたホップ潜在ウイルスのゲノムＲＮＡは、アルコール沈殿を行うことによって沈殿として回収し、ＲＴ−ＬＡＭＰ法に適した緩衝液に置換してもよいが、蒸留水又は弱アルカリ性付近のｐＨを有する緩衝液中でホップ潜在ウイルスのＲＮＡを抽出した場合には、そのまま以下の増幅ステップで使用することも可能である。

増幅ステップでは、配列表の配列番号２及び４で示される塩基配列からなる二種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、抽出ステップで抽出されたホップ潜在ウイルスのＲＮＡを鋳型に逆転写反応が行われ、引き続き、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、逆転写反応で得られたｃＤＮＡを鋳型にＬｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（以下、ＬＡＭＰ法）による等温遺伝子増幅反応が繰り返し行われる。

増幅ステップで行われるｃＤＮＡの増幅方法は、ＲＴ−ＬＡＭＰ法と呼ばれ、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写反応とＬＡＭＰ法による等温遺伝子増幅反応とを同時に等温で行うことによって、ホップ潜在ウイルスのゲノムＲＮＡの標的領域の一部配列のｃＤＮＡを増幅できる。

図１は、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットとホップ潜在ウイルスのゲノムＲＮＡの標的領域との位置関係を示した図である。

配列表の配列番号７は、ホップ潜在ウイルスのゲノムＲＮＡの標的領域のｃＤＮＡの塩基配列を示している。

配列表の配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＨＬＶ−ＦＩＰプライマー）はＦＩＰプライマーであり、Ｆ２ｃ領域と相補的な配列であるＦ２領域を３’末端側に持ち、５’末端側にＦ１ｃ領域と同じ配列を持つようにすれば設計できる。

配列表の２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＨＬＶ−ＢＩＰプライマー）はＢＩＰプライマーであり、Ｂ２ｃ領域と相補的な配列であるＢ２領域を３’末端側に持ち、５’末端側にＢ１ｃ領域と同じ配列を持つようにすれば設計できる。

配列表の配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＨＬＶ−Ｆ３プライマー）は、Ｆ３プライマーであり、Ｆ３ｃ領域と相補的な配列であるＦ３領域を持つようにすれば設計できる。

配列表の配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＨＬＶ−Ｂ３プライマー）は、Ｂ３プライマーであり、Ｂ３ｃ領域と相補的な配列であるＢ３領域を持つようにすれば設計できる。

ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応は、抽出ステップで抽出されたホップ潜在ウイルスのＲＮＡと、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、逆転写酵素と、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素と、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ）と、緩衝液と、を含む反応液を、等温で一定時間静置すればよい。

温度は、５０℃以上７５℃以下が好ましく、６０℃以上６５℃以下がより好ましく、６５℃がさらに好ましい。静置時間は、１５分以上であればｃＤＮＡの増幅を検出できるが、１５分以上１時間以内が好ましく、２０分以上４０以内がより好ましい。

逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液としては、例えば、Ｌｏｏｐａｍｐ ＲＮＡ増幅試薬キット（栄研化学社製）に含まれる各試薬を使用できる。

また、増幅ステップでは、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットの代わりに、配列表の配列番号５及び６で示される塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマーを加えた配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のプライマーセットを使用することが好ましい。

配列表の配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＨＬＶ−ＬｏｏｐＦプライマー）及び配列表の配列番号６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＨＬＶ−ＬｏｏｐＢプライマー）は、増幅反応の起点となるダンベル構造の５’末端側のループの１本鎖部分に相補的な配列を持つＬｏｏｐプライマーである。ＨＬＶ−ＬｏｏｐＦは、図１中のＦ１領域とＦ２領域の間の配列に相補的な配列を持つようにすれば設計でき、ＨＬＶ−ＬｏｏｐＢは、図１中のＢ１領域とＢ２領域の間の配列に相補的な配列を持つようにすれば設計できる。ＨＬＶ−ＬｏｏｐＦ及びＨＬＶ−ＬｏｏｐＢを用いることにより、ＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となり、増幅効率が上がり、増幅に要する時間を１／３〜１／２に短縮することが可能となる。

判断ステップでは、配列表の配列番号８で示される塩基配列を繰り返し含有するｃＤＮＡの増幅が上記増幅ステップで認められた場合に、ホップ潜在ウイルスが存在すると判断できる。

配列表の配列番号８で示される塩基配列は、ホップ潜在ウイルスのゲノムＲＮＡの標的領域の一部配列のｃＤＮＡであって、上記プライマーセットを用いたＲＴ−ＬＡＭＰ法で繰り返し増幅されるコア配列である。このコア配列に相補的なホップ潜在ウイルスのゲノムＲＮＡの塩基配列及び配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドがそれぞれアニールするホップ潜在ウイルスのゲノムＲＮＡの塩基配列は、ホップ潜在ウイルスのコートタンパク質遺伝子の一部配列であり、これらの塩基配列を含有するホップ潜在ウイルスのゲノムＲＮＡの領域は、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によってｃＤＮＡを増幅するための標的領域として適している。このため、増幅されたｃＤＮＡの有無を確認することによって、ホップ潜在ウイルスの有無を特異的に検出することを可能にしている。

ホップ潜在ウイルスの有無の判断は、例えば、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応を行った後の反応液を肉眼で観察し、反応液の白濁が確認された場合にホップ潜在ウイルスが存在したと判断できる。また、この反応液に蛍光インターカレーターを加え、ＵＶ照射下でｃＤＮＡの増幅を示す発光が確認された場合にホップ潜在ウイルスが存在したと判断できる。

より詳細にホップ潜在ウイルスの有無を判断するには、例えば、増幅されたｃＤＮＡを配列表の配列番号８で示される塩基配列中に存在する制限酵素ＮａｅＩで消化して電気泳動を行い、２８５ｂｐのＤＮＡ断片が確認された場合にホップ潜在ウイルスが存在したと判断できる。

本発明のホップ潜在ウイルスの検出用プライマーセットは、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むこと又は配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴としている。

上記のプライマーセットは、配列表の配列番号１〜６のそれぞれの塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ合成機で合成できる。

また、本発明のホップ潜在ウイルスの検出方法を使用するために必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。具体的には、配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチド又は配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写酵素、鎖置換活性を有する鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩又はマンガン塩等）、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類をキットとして提供できる。

キットには、本発明のプライマーによってＲＴ−ＬＡＭＰ反応が正常に進行することを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明のプライマーにより増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。

以下、実施例を挙げて本発明について更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１） ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるホップ潜在ウイルスの検出
（ホップ潜在ウイルスの検出に用いるホップ組織サンプルの調製）
ホップ潜在ウイルスに感染したホップの脇芽由来のホップ試験管苗から根を除いたものをホップ潜在ウイルス検出用検体とし、ウイルスフリーのホップ試験管苗から根を除いたものをコントロール検体とし、それぞれの検体からホップ組織サンプルを調製した。

ホップ潜在ウイルス検出用検体及びコントロール検体は、それぞれ液体窒素で凍結し、組織がパウダー状になるまで乳鉢で粉砕し、そこに検体重量に対し５倍量の蒸留水を加えて縣濁した。こうして得られたホップ潜在ウイルス検出用検体及びコントロール検体の縣濁液は、それぞれホップ組織サンプルとして以下の実験に用いた。

（ＲＮＡ試料の調製）
各ホップ組織サンプル（各４０μＬ）に、それぞれ１６０μＬの２×ＣＴＡＢ溶液（２％ セチルトリメチルアンモニウムブロミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．４Ｍ ＮａＣｌ、５％ β−メルカプトエタノール、０.１Ｍ トリス、ｐＨ ９.５）を加え、６５℃で２０分間保温した。その後、１５，０００回転で１０分間遠心分離して残渣を沈殿として取り除き、その上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。そこに２００μＬのイソプロパノールを加えて混和し、１５，０００回転で１０分間遠心分離することによってＲＮＡを沈殿として回収し、７０％エタノールで洗浄後に風乾し、４０μＬの滅菌水で溶解してＲＮＡ試料とした。

こうして得られたホップ潜在ウイルス検出用検体のＲＮＡ試料及びコントロール検体のＲＮＡ試料は、それぞれ滅菌水で１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍及び１０^７倍に段階希釈し、そのうちの２μＬをＲＮＡ希釈試料としてＲＴ−ＬＡＭＰに供試した。ＲＮＡ希釈試料は、ホップ組織サンプルの２×１０^４分の１、２×１０^５分の１、２×１０^６分の１、２×１０^７分の１及び２×１０^８分の１にそれぞれ相当する。

（ＲＴ−ＬＡＭＰ法に使用するプライマー）
プライマーには、ＦＩＰプライマーとしてＨＬＶ−ＦＩＰプライマー（配列番号１）、ＢＩＰプライマーとしてＨＬＶ−ＢＩＰプライマー（配列番号２）、Ｆ３プライマーとしてＨＬＶ−Ｆ３プライマー（配列番号３）、Ｂ３プライマーとしてＨＬＶ−Ｂ３プライマー（配列番号４）、ＬｏｏｐプライマーとしてＨＬＶ−ＬｏｏｐＦ（配列番号５）及びＨＬＶ−ＬｏｏｐＢ（配列番号６）を用いた。これらの６種類のプライマーを使用してＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅を行うことで、ホップ潜在ウイルスのコートタンパク質遺伝子のｃＤＮＡの一部配列である配列表の配列番号８で示される塩基配列を繰り返して含有するｃＤＮＡを増幅できる。

（ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅）
ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅は、Ｌｏｏｐａｍｐ ＲＮＡ増幅試薬キット（栄研化学社製）を用いて行った。具体的には、製造元のプロトコールに従って、反応液に段階希釈した上記ＲＮＡ希釈試料（２μｌ）をそれぞれ加え、そこに上記の６種類のプライマー、逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を加え、６５℃で、５０分間静置した。

（増幅したｃＤＮＡの検出）
ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅が認められる場合には、遊離したピロリン酸がマグネシウムイオンと反応してピロリン酸マグネシウムを形成するため、反応液が白濁した場合にｃＤＮＡの増幅が認められたと判定できる。上記のＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅で増幅されるｃＤＮＡは、ホップ潜在ウイルスのコートタンパク質遺伝子のｃＤＮＡの一部配列に相当する配列表の配列番号８で示される塩基配列であるため、反応液が白濁した場合にホップ潜在ウイルスが存在すると判断した。

表１は、ホップ潜在ウイルス検出用検体のＲＮＡ希釈試料及びコントロール検体のＲＮＡ希釈試料を用いて、ＲＴ−ＬＡＭＰ法でホップ潜在ウイルスの検出を行なった結果である。

その結果、コントロール検体のＲＮＡ希釈試料では、いずれもホップ潜在ウイルスは検出されなかったが、ホップ潜在ウイルス検出用検体のＲＮＡ希釈試料では、ホップ組織サンプルを２×１０^７倍希釈してもホップ潜在ウイルスを検出することができた。以上より、ＲＴ−ＬＡＭＰ法による検出では、ホップ潜在ウイルスが感染したホップ潜在ウイルス検出用検体でのみホップ潜在ウイルスが検出されることが判明し、後述するＥＬＩＳＡ法による検出よりも検出感度がはるかに高いことが示唆された。

しかしながら、ＲＴ−ＬＡＭＰ法で、非特異的にｃＤＮＡが増幅された場合であっても反応液の白濁は認められるため、以下の実験により確認試験を行った。具体的には、ホップ潜在ウイルス検出用検体のＲＮＡ希釈試料を用いたＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応で、ｃＤＮＡの増幅が認められた各反応液の１μＬを制限酵素ＮａｅIで消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、２８５ｂｐのＤＮＡ断片が検出されるか否かを確認した。ＮａｅＩは配列表の配列番号８に示される塩基配列中に存在するため、制限酵素ＮａｅＩで消化することにより、ＲＴ−ＬＡＭＰ法で増幅されたｃＤＮＡを２８５ｂｐのＤＮＡ断片として検出することが可能となる。電気泳動後のゲルは、エチジウムブロマイド溶液に１０分間浸漬することにより分画されたＤＮＡ断片を染色し、紫外線を照射することによりＤＮＡバンドを可視化できる。

図２は、ホップ潜在ウイルス検出用検体のＲＮＡ希釈試料を用いてＲＴ−ＬＡＭＰ法で増幅されたｃＤＮＡを制限酵素ＮａｅIで消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動したときのバンドパターンを示すゲル写真である。

その結果、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応で白濁が認められ、表１でホップ潜在ウイルスが検出された各反応液中のｃＤＮＡは、いずれも制限酵素ＮａｅＩで消化することにより２８５ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。ゲル中には、２８５ｂｐのメジャーバンドの他に、１８６ｂｐ、１４２ｂｐのマイナーバンドが確認されるが、ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅反応では、標的領域の一部配列のｃＤＮＡがつながった状態で増幅されるため、２８５ｂｐのメジャーバンドの他に、１８６ｂｐ、１４２ｂｐのマイナーバンドが確認されることは正しい結果であるといえる。

以上より、上記の実施例１において、ＲＴ−ＬＡＭＰ法でｃＤＮＡの増幅を示す白濁が認められた場合には、非特異的なｃＤＮＡの増幅が起こったのではなく、ホップ潜在ウイルスのコートタンパク質遺伝子の一部が特異的に増幅したものであることが立証され、ホップ潜在ウイルスの検出は、ホップ潜在ウイルスの存在に依存した結果であることが明らかとなった。

したがって、実施例１に示されたＲＴ−ＬＡＭＰ法によるホップ潜在ウイルスの検出方法は、後述するＥＬＩＳＡ法によるホップ潜在ウイルスの検出と比べて非常に高感度な方法であり、反応液の白濁を視覚的に判断するだけで容易にホップ潜在ウイルスの有無を判定できる方法であることが示唆された。

（比較例１） ＥＬＩＳＡ法によるホップ潜在ウイルスの検出
（ホップ潜在ウイルスの検出用のＥＬＩＳＡ用プレートの作成）
ホップ潜在ウイルスを特異的に認識する抗ホップ潜在ウイルス抗体（北海道大学農学部植物ウイルス学研究室より分与）を、０．０５Ｍ ＳＣＢバッファー（１．５９ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＣＯ_３、２．９３ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６穴マイクロプレートに０．２ｍＬずつ注入し、３７℃で４時間静置した。その後、０．０２Ｍ ＰＢＳ−Ｔ（８．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、２．９ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、０．５ｍＬ／Ｌ ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）を用いて５分間隔で５回洗浄し、こうして得られた抗体固相プレートをホップ潜在ウイルスの検出用のＥＬＩＳＡ用プレートとして以下の試験に用いた。

（ＥＬＩＳＡ法による検出）
実施例１に記載したホップ潜在ウイルス検出用検体及びコントロール検体の縣濁液から調製した各ホップ組織サンプル（各４０μＬ）に、１６０μＬの蒸留水を加え、さらに２００μＬのＰＢＳ−Ｔ／ＰＶＰ溶液（１６．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．４ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、５．８ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．４ｇ／Ｌ ＫＣｌ、１．０ｍＬ／Ｌ ｔｗｅｅｎ−２０、４０ｇ／Ｌ ポリビニルピロリドン、ｐＨ７．４）を加えて混合し、１５，０００回転で１０分間遠心分離し、２００μＬの上清を回収しタンパク質試料とした。

こうして得られたホップ潜在ウイルス検出用検体のＲＮＡ試料及びコントロール検体のタンパク質試料は、残りの上清を用いて、それぞれＰＢＳ−Ｔ／ＰＶＰ溶液で１０倍、１０^２倍、１０^３倍に段階希釈し、それぞれ２００μＬをタンパク質希釈試料としてＥＬＩＳＡに供試した。希釈をしていないタンパク質試料は、ホップ組織サンプルの２分の１に相当し、１０倍、１０^２倍及び１０^３倍に段階希釈したタンパク質希釈試料は、ホップ組織サンプルの２０分の１、２×１０^２分の１、２×１０^３分の１にそれぞれ相当する。

次にタンパク質試料及び各タンパク質希釈試料（各２００μＬ）のそれぞれを上記のＥＬＩＳＡ用プレートに添加し、一晩静置した。０．０２Ｍ ＰＢＳ−Ｔを用いて５分間隔で５回洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識した上記抗ホップ潜在ウイルス抗体を０．０２Ｍ ＰＢＳ−Ｔで１０００倍希釈したものを２００μＬずつ加え、３７℃で３時間静置した。その後、ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルを０．０２Ｍ ＰＢＳ−Ｔを用いて５分間隔で５回洗浄し、２００μＬの基質溶液（１０％ Ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１ｇ／Ｌ ｐ−ニトロフェニル燐酸二ナトリウム）を加え、室温にて一定時間反応させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。

表２は、ホップ潜在ウイルス検出用検体のタンパク質試料及び各タンパク質希釈試料並びにコントロール検体のタンパク質試料及び各タンパク質希釈試料を用いて、ＥＬＩＳＡ法でホップ潜在ウイルスの検出を行なった結果である。

その結果、コントロール検体のＲＮＡ希釈試料では、いずれもホップ潜在ウイルスは検出されなかったが、ホップ潜在ウイルス検出用検体のタンパク質試料及び各タンパク質希釈試料では、ホップ組織サンプルを２０倍希釈までであればホップ潜在ウイルスを検出することができた。以上より、ＥＬＩＳＡ法による検出では、ホップ潜在ウイルスが感染したホップ潜在ウイルス検出用検体でのみホップ潜在ウイルスが検出され、ＥＬＩＳＡの系は正常にホップ潜在ウイルスを検出していることが確認できたが、上記のＲＴ−ＬＡＭＰ法による検出と比較して、検出感度が少なくとも１０^６倍（１００万倍）低いことが明らかとなった。

配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットとホップ潜在ウイルスのゲノムＲＮＡの標的領域との位置関係を示した図である。 ホップ潜在ウイルス検出用検体のＲＮＡ希釈試料を用いてＲＴ−ＬＡＭＰ法で増幅されたｃＤＮＡを制限酵素ＮａｅIで消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動したときのバンドパターンを示すゲル写真である。

Claims (5)

1. ホップ潜在ウイルスの検出方法であって、
   検体からホップ潜在ウイルスのＲＮＡを抽出する抽出ステップと、
   配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、前記ＲＮＡを鋳型にＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ−ＬＡＭＰ）法によってｃＤＮＡの増幅反応を行う増幅ステップと、
   配列表の配列番号８で示される塩基配列を含有するｃＤＮＡの増幅が前記増幅ステップで認められた場合にホップ潜在ウイルスが存在すると判断する判断ステップと、
   を含む、検出方法。
2. 前記プライマーセットは、配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットである、請求項１記載の検出方法。
3. 配列表の配列番号１〜４で示される塩基配列からなる４種類のオリゴヌクレオチドを含む、ホップ潜在ウイルスの検出用プライマーセット。
4. 配列表の配列番号１〜６で示される塩基配列からなる６種類のオリゴヌクレオチドを含む、ホップ潜在ウイルスの検出用プライマーセット。
5. 請求項３又は４記載のプライマーセット、逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、ホップ潜在ウイルスの検出用キット。

Images