CZ120598A3

CZ120598A3 - Způsob kvantitativního stanovení a detekce mikroorganizmů, kit pro kvantitativní stanovení a detekci mikroorganizmů a jejich použití

Info

Publication number: CZ120598A3
Application number: CZ981205A
Authority: CZ
Inventors: Jean-Marie Andrieu; Wei Lu
Original assignee: Microdiag
Priority date: 1995-11-06
Filing date: 1996-11-05
Publication date: 1998-08-12
Also published as: NO982039L; EA000613B1; NO982039D0; EP0862654A1; EA199800438A1; BR9611334A; CA2236842A1; WO1997017465A1; AU7500496A; US6277560B1; JP2000500007A; FR2740781B1; FR2740781A1

Description

ZPŮSOB KVANTITATIVNÍHO STANOVENÍ A DETEKCE MIKROORGANIZMŮ, KIT PRO KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ A DETEKCI MIKROORGANIZMŮ A JEJICH POUŽITÍ

Oblast techniky: Navrhovaný vynález se týká kvantitativního stanovení a detekce mikroorganizmů. Především se týká kvantitativního stanovení a detekce mikroorganizmů s DNA nebo RNA genomem.

Vynález se týká všech známých mikroorganizmů, jako jsou viry, bakterie, bacily, protozoa, nebo hematozoa, které mají DNA nebo RNA genom, napadajících člověka, živočichy a rostliny, stejně jako mikroorganizmů žijících v člověku, živočiších i rostlinách v patologickém i nepatologickém smyslu; a dále se týká kvantitativního stanovení a určení zmíněných mikroorganizmů v produktech pocházejících z rostlin a živočichů (včetně člověka), stejně jako těch, žijících ve vodě.

V dalším textu bude metoda podle vynálezu popsána na příkladech kvantifikace infekce způsobené lidským RNA-virem HIV (virus získané imunodeficience) a infekce, způsobené lidským DNA-virem HBV (virus hepatitidy B).

Dosavadní stav techniky: V součastnosti je studium epidemiologie, léčba a prevence lidských, živočišných i rostlinných chorob v popředí zájmu lidské i veterinární medicíny a agronomie nebo průmyslu rostlinné výroby. Identifikace a kvantitativní určení mikroorganizmů v médiích, jakými jsou například tkáně, biologické tekutiny a in vitro preparáty jsou nezbytnými kroky při řešení takových projektů. Co se týče určení velikosti většiny • · • ·

mikroorganizmů, především virů, a určení jejich koncenrtace v biologických médiích (obvykle v řádech 10¹ až 10¹²mikroorganizmů v 1 ml) jsou jedinými technologickými postupy umožňujícími jak molekulární identifikaci, tak kvantitativní stanovení ty, které využívají amplifikaci genomových fragmentů. V součastnosti nejpoužívanější metodou amplifikace genomu je metoda, nazývaná polymerázová řetězová reakce, neboli PCR. Pomocí této metody je možné s použitím enzymu polymerázy amplifikovat fragment genomu, obsahující DNA. Dále je možné s pomocí dvou enzymů polymerázy a reverzní transkriptázy, nebo enzymu, katalyzujícího obě reakce, provést zpětnou transkripci RNA na DNA a následnou amplifikaci. Takto zmnožený genomový fragment nebo „amplifikát“ je dále identifikován různými metodami (radioaktivní nebo barevnou sondou, určením velikosti fragmentu ...).

Metody pro kvantifikaci HIV pomocí PCR byly popsány např. v Holodniy M. a kol., J. Infect. Dis, 163, 862-866 (1991); Aoki-Sei

S. a kol., J, AIDS Res. Hum. Retrovirus 8, 1263-1270 (1992); Bagnarelli P. a kol., J. Virol. 66, 7328-7335 (1992); Piatak M. Jr. a kol., Science 259, 1749-1755 (1993); Bruisten S. M. a kol., AIDS 7 (Suppl. 2), S15-S20 (1993).

Metody pro kvantifikaci RNA viru hepatitidy C byly popsány např. v Kumar U. a kol., J. Virol. Methods 47 (1-2), 95-102 (1994); Mazin A. a kol., J. Clin. Microbiol. 32 (8), 1939-1944 (1994); Ravaggi A. a kol., J. Clin, Microbiol. 33 (2), 265-269 (1995); Young K.K. a kol., J. Clin. Microbiol. 33 (3), 654-657 (1995). Metody pro kvantifikaci DNA viru hepatitidy B byly popsány např. v Lehtovaara P. a kol., PCR Methods Appl. 3 (3), 169-175 (1993);

·· · • · • ·· • · · · « · ♦ · · ♦ • ··· · ·♦··.· • ······· · · ·

Wu J. a kol., J. Virol. Methods 49 (3), 331-341 (1994); Zaaijer H.L. a kol., J. Clin. Microbiol. 32 (9), 2088-2091 (1994); Kaneko S. a kol.. J. Clin. Microbiol. 27 (9), 1930-1933 (1989).

Ovšem vztah mezi amplifikovaným produktem a výchozí DNA nebo RNA není v jednotlivých experimentech skutečně konstantní; proto je nezbytné zabývat se problémem měření standardů jejichž koncentrace jsou známé.

Dosud bylo možné hodnotit PCR amplifikační kapacitu pouze u buněk, jejichž studovaný genom je přítomen v konstantním počtu kopií, nebo u plazmidů, nesoucích každý jen jeden genový fragment. Můžeme konstatovat, že díky PCR je možné specificky identifikovat i jen jediný genový fragment. Dále bylo prokázáno, že existuje úměrnost mezi výchozí koncentrací DNA plazmidů před amplifikací a koncentrací DNA po amplifikací. Ovšem bylo zjištěno, že tato úměrnost se v jednotlivých experimentech liší, neboť amlpifikace pomocí PCR je biologický proces závislý na činnosti enzymu polymerázy, která nemůže být kontrolována tak dokonale, jako je tomu u čistě fyzikálních metod.

To vedlo vědce a techniky biotechnologických společností k zavedení standardizace do každého experimentu, který se týkal kvantifikace virů. Dosud je za standard považována série koncentrací (obvykle 3 až 5) standardního plazmidů, jehož DNA fragment je amplifikován ze stejných primerů a v závislosti na použité technologii má buď shodnou, nebo částečně odlišnou sekvenci. Stupeň amplifikace DNA při shodných koncentracích plazmidů, shodných primerech, ale odlišných délkách fragmentů, a tudíž i odlišných sekvencích se může (1) v jednotlivých případech ·· *··· lišit a (2) není nezbytně identický se stupněm amplifikace DNA nativního viru o stejné koncentraci ve stejném experimentu.

Problém je ještě komplexnější v případě kvantitativního stanovení nebo identifikace RNA virů, jakým je například virus AIDS (HIV). V případě RNA virů musí být amplifikace pomocí PCR spojena s krokem reverzní transkripce (zkracováno RT), který je často katalyzován buď dalším enzymen, reverzní transkriptázou, nebo jsou obě reakce (reverzní transkripce i amplifikace DNA) katalyzovány jedním enzymem. V obou případech umožňují komerčně dostupné enzymy dosáhnout stupně reverzní transkripce, který se v jednotlivých experimentech liší a je v rozmezí od 10:1 (pro vytvoření 1 kopie DNA je zapotřebí 10 kopií RNA) do 100:1 (pro vytvoření 1 kopie DNA je zapotřebí 100 kopií RNA). Dosud byl problém neporovnatelnosti výsledků obdržených v sérii experimentů řešen simultánní inkubací několika koncentrací standardního RNA fragmentu (standardní transkript) s identickými primery. Amplifikovaná část tohoto standardního RNA fragmentu je buď identická, to pokud je použit jako externí standard, nebo se liší v sekvenci nebo délce, to pokud je použit př ko-amplifikaci kdy je transkript inkubován v jedné zkumavce spolu s RNA studovaného mikroorganizmu. Bohužel se zdá, že se koncentrace obou transkriptů mohou lišit, a dokonce se mohou lišit i u transkriptů, pocházejících z RNA při identických koncentracích viru.

Ze zmíněných skutečností vyplývají následující závěry:

Známé techniky reverzní transkripce a/nebo amplifikace DNA neposkytují shodné výsledky v různých experimentech se shodným vzorkem;

Je nezbytné používat standard, který může být buď interní, nebo externí;

Externí standard, tvořený buď píazmídem (pro DNA mikroorganizmy), nebo transkriptem RNA (pro RNA mikroorganizmy) umožňuje pouze relativní kvantifikaci, neboť stupeň amplifikace není nezbytně identický se stupněm amplifikace DNA nebo RNA celého mikroorganizmu;

Navíc ko-amplifikovaný interní standard představuje odlišné ζ

délky nebo sekvence plazmidu nebo transkriptu a má stejné nevýhody, jako externí standard, ať už plazmidový, nebo RNA transkript.

Při současném stavu techniky není amplifikace plazmidové DNA skutečně proporcionální k amplifikaci virové DNA. Běžně používaným standardem pro RNA víry je transkript, který má stejné nevýhody, jako plazmid, a navíc zde existuje nebezpečí volné degradace RNA.

Proto vyvstala potřeba zavést testy pro kvantitativní stanovení a detekci mikroorganizmů, jejichž výsledkem by byly absolutní hodnoty množství studovaných mikroorganizmů.

Podstata vynálezu:

V poslední době bylo zjištěno, že je možné v absolutních číslech kvantitativně stanovit nebo určit jakýkoliv DNA nebo RNA mikroorganizmus, pokud:

(1) je známa, nebo je možné určit standardní koncentraci mikroorganizmu (tzv. standardního mikroorganizmu), nebo koncentraci DNA nebo RNA v něm obsažené; a ·· ♦ • · · ··· · · · · • · · · · ···· · ··· ♦ ····· · · · «· ··«_{e t} • · * «· · · · · • · 4 · · · · · «· ·· (2) je porovnáno množství produktu reverzní transkripce a/nebo amplifikace RNA nebo DNA pocházející z mikroorganizmu o neznámé koncentraci s množstvím amplifikovaného produktu pocházejícího z RNA nebo DNA několika známých koncentrací zmíněného mikroorganizmu.

Takový proces je prvním předmětem navrhovaného vynálezu.

Podle alternativního postupu se může krok (2) v základě sestávat ze srovnávacího určení koncentrace, založeného na porovnání koncentrací standardu s koncentrací studovaného mikroorganizmu, určenou nejraději tzv. metodou větvené DNA, nebo některou jinou vhodnou metodou, která nevyužívá amplifikace DNA nebo RNA standardu nebo studovaného mikroorganizmu.

Suspenze mikroorganizmů o známé koncentraci je připravena některou z technik, které jsou odborníkům dobře známé, nej častěji pomocí centrifugace a purifikace libovolného množství studovaných mikroorganizmů (z média s lidskými, živočišnými a nebo rostlinnými vzorky a nebo z buněčných kultur) a následné extrakce DNA nebo RNA z těchto mikroorganizmů pomocí běžných technik. Množství materiálu, použité v dalším kroku je libovolné s jedinou podmínkou - musí být dostatečné k dosažení takového konečného množství DNA nebo RNA standardního mikroorganizmu, které je měřitelné přímými mikrobiologickými technikami bez použití amplifikace PCR-typu a je snadno zpracovatelné jedním člověkem. Uvažujeme-li přesnost běžných laboratorních přístrojů, používaných pro tato měření, pak jsou obvyklá vhodná množství materiálu pro zpracování v rozmezí od několika set nanogramů do několika mikrogramů.

Způsob stanovení podle vynálezu se skládá z následujících kroků:

® ♦ f ······ ·· ·· ··<· · · · ···· • ··· e ···· · ··· • ······· · · · ···· · »*·♦ ·· · · · · ♦ · · ····* · · et

1) Vhodné množství mikroorganizmu, který má být určen je odebráno z lidského, živočišného a nebo rostlinného vzorku, nebo z buněčné kultury a purifikováno. Vhodné množství mikroorganizmu je takové, aby bylo výsledné množství vyizolované

DNA nebo RNA měřitelné přímými metodami;

2) DNA nebo RNA je vyizolována a je stanoveno její množství (udává se v ng nebo pg);

3) Dále je důležité znát počet nukleotidů mikroorganizmu. Toto číslo je možné zjistit buď v databance, nebo určit konvenčními metodami;

4) Celková molekulová hmotnost DNA nebo RNA zmíněného mikroorganizmu je vypočtena z počtu nukleotidů s použitím průměrné molekulové hmotnosti jednoho nukleotidu, která je také známá (330 daltonů);

5) S použitím Avogadrovy konstanty (6,02 x 10²³) je vypočteno množství DNA nebo RNA každého mikroorganizmu.

6) Série standardních koncentrací mikroorganizmů, získaná postupným ředěním mikroorganizmu, standardizovaného předem pomocí stanovení koncentrace jeho DNA nebo RNA je připravena a/nebo použita jako externí standard, pro který platí, že je známá

a) jeho DNA nebo RNA koncentrace a b) koncentrace mikroorganizmů pro každé ředění;

7) DNA nebo RNA standardu a studovaného mikroorganizmu je

vyizolována a extrakty	jsou	paralelně	dále	zpracovány	tzv.
metodou větvené DNA	nebo	některou	další	metodou,	která
nevyužívá amplifikace	DNA	nebo	RNA	standardu	nebo

studovaného mikroorganizmu a/nebo reverzní transkripcí a/nebo • · · • · • · « · jsou alespoň jedenkrát amplifikovány a výsledky jsou zaznamenány;

8) Koncentrace DNA nebo RNA standardu a studovaného mikroorganizmu jsou porovnány, a nebo jsou porovnány amplifikační produkty studovaného mikroorganizmu a externího standardu a je určena DNA nebo RNA koncentrace a nebo celková koncentrace mikroorganizmu v každém studovaném vzorku. Následující citace jsou příklady bibliografických zdrojů obsahujících údaje o počtu nukleotidů jednotlivých mikroorganizmů nebo odkazy na databanky obsahující takové údaje: Virus Res. 23, 39-53 (1992), Gene 81, 275-284 (1989), Virology 177, 305-311 (1990) a J. Gen. Virol, 69. 2575-2583 (1988).

Výhodnější varianta popsané metody může být použita, pokud jsou mikroorganizmy dostatečně velké, aby bylo možné je určit a spočítat přímo pomocí optických nebo elektronických metod. Potom jsou kroky 2) až 5) zmíněného postupu podle vynálezu nahrazeny jednodušším přímým změřením počtu mikroorganizmů.

V nejčastějším provedení zahrnuje proces podle vynálezu ještě přidání interní kontroly, nejčastěji ve formě heterologního plazmidu nebo RNA transkriptu, jejichž sekvence ani příměry nemají žádný vztah ke studované DNA nebo RNA. Zmíněná interní kontrola je s výhodou přidána ke každému z testovaných vzorků a slouží jako vnitřní kontrola (zde „IC“) především pro kontrolu účinnosti amplifikace, nebo amplifikace spojené s reverzní transkripcí.

Další variantou popsaného procesu může být postup, ve kterém je příprava série známých koncentrací mikroorganizmu nahrazena přípravou známých koncentrací • · • · • ·

- stejného inaktivovaného mikroorganizmu, jehož DNA nebo RNA zůstává ve stavu umožňujícím detekci či kvantifikaci metodami, jako jsou například metoda tzv. větvené DNA a/nebo revezní transkripce a/nebo amplifikace, shodnými s metodami použitými pro DNA nebo RNA nativního viru;

- kompletní sekvence nukleotidů, extrahované ze stejného mikroorganizmu; nebo

- kompletní nukleotidové sekvence, získané syntézou.

Zvláště výhodná varianta procesu podle vynálezu umožňuje oddělení známých standardizovaných koncentrací celkové DNA nebo RNA mikroorganizmu, který má být kvantifikován nebo určen, nebo přípravu koncentrací DNA nebo RNA z genomu zmíněných mikroorganizmů odpovídající známým koncentracím tohoto mikroorganizmu a jejich skladování až do doby, kdu jsou použity. Pro snazší pochopení je dále uveden ilustrativní příklad detekce pomocí amplifikace, konkrétně pomocí PCR nebo RT-PCR. Ovšem i další amplifikační metody, jako například NASBA (t.j. metoda založená na sekvenci nukleové kyseliny - „nucleic acid sequence based assay“) mohou být použity.

Molekukární kvantifikace a detekce podle vynálezu jsou velmi důležité jak v případě malých, tak i v případě větších mikroorganizmů pokud jsou přítomny v nízkých koncentracích a nebo nejsou konvenční empirické techniky pro jejich stanovení běžně zavedeny (v rozvojových zemích).

Vynález se dále týká kitu, nebo soupravy pro kvantitativní stanovení a detekci DNA nebo RNA mikroorganizmů, obsahující následující položky umístěné ve vhodných nádobách a/nebo přítomné ve formě vhodných nástrojů:

• · 9 · • · • · • · · · · · 9 9 · · ·· · • · · * · · · · • · 99 9 ·9999

- Soubor známých standardizovaných koncentrací DNA nebo RNA mikroorganizmu pro kvantitativní stanovení nebo detekci, nebo soubor koncentrací DNA či RNA odpovídající známým koncentracím zmíněného mikroorganizmu;

- Prostředky pro extrakci a určení a/nebo reverzní transkripci a/nebo amplifikaci DNA nebo RNA cílového a standardního mikroorganizmu pomocí PCR, RT-PCR nebo NASBA;

- Prostředky pro analýzu DNA nebo RNA cílového i standardního mikroorganizmu nebo amplifikačních produktů.

Zmíněný kit nebo soubor prostředků může případně obsahovat i vnitřní kontrolu a to bud’ ve formě přibližně 10³ kopií/μΐ heterologní plazmidové DNA nebo transkriptu RNA, která slouží pro kontrolu účinnosti amplifikace nebo amplifikace spojené s spojené s reverzní transkripcí.

Je nezbytné zmínit, že prostředky pro analýzu PCR nebo RT-PCR produktů nemusí být interní součástí kitu, ale jsou navrhovány tak, aby mohly být použity v kombinaci s kitem. Tyto prostředky zahrnují například přístroje a/nebo produkty pro určení nukleových kyselin pomocí elektroforézy, kolorimetrie, radiometrie, a nebo pomocí dalších vhodných analytických metod.

Zmíněný proces a prostředky umožňují v původním smyslu absolutní kvantifikaci DNA nebo RNA mikroorganizmů, neboť studovaný mikroorganizmus, nebo jeho genom, je identický se souběžně zpracovávaným standardním mikroorganizmem, nebo jeho genomem. Navíc bylo zjištěno, že tento proces a tyto prostředky představují univerzální způsob kvantitativního stanovení a identifikace, neboť umožňují kvantifikaci všech mikroorganizmů.

• · · · · · • · · · · · · ··· ··· • ······· · ·· ···· · • · · · · 99 9 9

9 9 99 99 9 9999

Kromě kvantitativního stanovení mohou být tento proces i prostředky podle vynálezu použity pro stanovení minimálního množství mikroorganizmu, měřitelného současnými metodami reverzní transkripce a/nebo amplifikace RNA nebo DNA mikroorganizmů. V praxi představuje minimální měřitelné množství 1 až 5 mikroorganizmů s DNA genomem a 10 až 100 mikroorganizmů s RNA genomem.

Dále je vynález popsán konkrétněji v textu doprovázejícím přiložené obrázky, který však není v žádném případě limitující.

~ Obr. 1 je grafickým znázorněním odlišností v citlivosti detekce a účinnosti amplifikace různých PCR experimentů provedených s několika odlišnými standardními koncentracemi DNA jednoho viru.

- Obr. 2 je grafickým znázorněním odlišností v citlivosti detekce a účinnosti amplifikace různých RT-PCR experimentů provedených s několika odlišnými koncentracemi RNA jednoho viru.

- Obr. 3 je grafikým znázorněním odlišností v účinnosti amplifikace v PCR exprimentu, provedeném s několika koncentracemi DNA ze vzorků virů pocházejících od různých pacientů.

- Obr. 4 je grafikým znázorněním odlišností v účinnosti amplifikace v PCR exprimentech provedených s několika koncentracemi DNA pocházející z různých vzorků stejného viru a s několika koncentracemi DNA pocházející ze dvou odlišných plazmidů resp.

- Obr. 5 je grafikým znázorněním odlišností v účinnosti amplifikace v RT-PCR exprimentech provedených s různými koncentracemi RNA virů, pocházejících od různých pacientů.

- Obr.

je grafikým znázorněním odlišností v účinnosti amplifikace v RT-PCR exprimentech provedených s několika koncentracemi RNA virů, pocházejících od různých pacientů a se dvěma odlišnými RNA transkripty resp.

Konkrétním příkladem může být zpracování RNA viru HIV pocházejícího z kultury. Kultura byla zakoncentrována a purifikována a RNA extrahována s výtěžkem 300 ng. Při znalosti celkového počtu nukleotidů viru HIV (19000) a průměrné molekulové hmotnosti jednoho nukleotidu (330 Da) bylo možné určit celkovou molekulovou hmotnost viru HIV, která činí 6 300

000 daltonů. Výpočtem s použitím Avogadrovy konstanty byl určen celkový počet virových genomů a tím i virových partikulí, které daly vzniknout 300 ng RNA, která byla získána na počátku experimentu, tj. přibližně 3 x 10³ virů. Je-li známá koncentrace virů v alikvotní části purifikovaného vzorku virů, může být připravena standardní škála koncentrací, která může být použita ve způsobu podle vynálezu.

Způsob podle vynálezu zajišťuje spolehlivou identifikaci a/nebo absolutní kvantifikaci, neboť cílový mikroorganizmus (ten, který má být určen) je identický se standardním mikroorganizmem. Navíc je metoda podle vynálezu univerzální, protože umožňuje kvantifikaci všech mikroorganizmů, jejichž množství je měřitelné.

Tento proces a kit pro jeho provedení může být používán nejen pro kvantitativní stanovení mikroorganizmů ve všech médiích nebo vzorcích, ale také pro určení minimálního množství mikroorganizmu, měřitelného současnými metodami reverzní transkripce a/nebo amplifikace RNA nebo DNA mikroorganizmů.

• ······ · · 4 4

4 4 4 4 4 4 ·

I» · · · · · · · · · 4 4 4 • ······· · 4 * 4 4 4 4 · ««4 · 4 9 ♦ · 9 • 4 4 · » · · » ·· «4

Pro mikroorganizmy s DNA genomem je minimální měřitelné množství 1 až 5 mikroorganizmů, zatímco pro mikroorganizmy s RNA genomem je to už 10 až 100 mikroorganizmů.

Navrhovaný vynález je rozhodně přínosem pro rozvoj prostředků a metod pro kvantitativní stanovení mikroorganizmů in vitro, neboť přináší jednoduché a účinné prostředky a techniky pro standardizaci těchto stanovení.

Detailněji je vynález popsán v následujících příkladech, které však nejsou v žádném případě limitující. Poměry a procenta jsou udávány jako hmotnostní, pokud není uvedeno jinak.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Ukázka výhod použití univerzálního standardu pro detekci a kvantitativní stanovení cílové DNA pomocí PCR.

V tomto experimentu byla studována variabilita v citlivosti stanovení a účinnosti amplifikace pro DNA pocházející z různých koncentrací stejného HBV. Od chronických nosičů viru hepatitidy B byla pazmaferézou s vysokými titry HBsAg získána plazma. DNA z vrionu HBV byla purifikována centrifugací (přes noc při 25 000 rpm a 4 °C, Spinco 25) ve 30% (w/v) sacharóze v TEBM médiu (Tns-HCl 0,01 M, pH 7,6, Na-EDTA 0,001 M, 1% hovězí sérový albumin a 0,3% 2-merkapto-etanol). Čistota oddělených virionů HBV byla ověřena elektronovou mikroskopií. DNA z virionů byla extrahována pomocí komerčního kitu pro purifikaci DNA. Získaná virová DNA byla spektrofotometricky kvantifikována. Počet kopií virové DNA byl vypočten pomocí • 444444 · 4 4 4 « 4 4 · · * 4 4 4 4 • ··» · 4 4·· · · · 4

V ·····»· · 4 * 9 9 4 9 9 « 4 « · 9 9 9 9 9 «· * 4·««· 4 · 4« známé molekulové hmotnosti virového genomu HBV. Další variantou může být stanovení počtu virionů pomocí elektronové mikroskopie. Se sérií postupných ředění (10, 100, 1000 a 10 000 kopií) HBV DNA byla postupně provedena stejná PCR reakce (94 °C 60 s, 56 °C 60 s a 72 °C 90 s) se 100 pmol dvojice HBV primerů, specifických pro gen

C.-(GCTTTGGGGCATGGACATTGCC/GACTACTAGATCCCTGGA TGCTGG). Specifické PCR produkty byly analyzovány pomocí dotblot hybridizace s γ-³²Ρ terminálně značenou sondou (TCAGCTCTGTATCGAGAAGCC) a počet impulzů za minutu (cpm) byl pro každý PCR signál zaznamenám pomocí scintilačního počítače.

Výsledky byly zaznamenýny a vyneseny v grafické formě na obr. 1. Je zřejmé, že standard vykazoval různé výsledky a měl by být tudíž použit v každém experimentu souběžně se studovaným vzorkem. Dále je z křivek na obrázku 1 zřejmé, že pro každou konstantní DNA ve smyslu počtu kopií existuje od jednoho experimentu ke druhému široký interval koncentrací PCR produktů.

Příklad 2: Ukázka výhod použití univerzálního standardu pro detekci a kvantitativní stanovení cílové RNA pomocí RT-PCR.

V tomto experimentu byla studována variabilita v citlivosti detekce a účinnosti amplifikace pomocí RT-PCR pro RNA pocházející z různých koncentrací stejného viru HIV-1. RNA z virionu HIV-1 byla získána purifikací na koloně (Sepharose) ze supernatantu kultury krevních blastových mononukleárních buněk, infikovaných primárním izolátem. Čistota frakce virionů HIV-1 byla sledována • * • · « · · · pomocí elektronové mikroskopie. RNA z virionů byla extrahována s použitím komerčního kitu pro izolaci RNA. Získaná virová RNA byla kvantifikována spektrofotometricky. Počet kopií virové RNA byl stanoven výpočtem ze známé molekulové hmotnosti virového genomu HIV-1 RNA. Po přidání 1 mikrogramu tRNA byla postupná ředění (1 000 000, 100 000, 10 000 a 1000 kopií) vzorku RNA přesrážena a resuspendována v 10 μΐ. Alikvotní podíl 10 μΐ RNA a pg referenční tRNA (bez příměsi HIV) byly okamžitě přidány ke každé RT-PCR reakční směsi (90 μΐ), obsahující 10 jednotek Moloney rekombinantní reverzní transkriptázy viru myší leukémie a 3 jednotky DNA polymerázy ampliTaq pro amplifikaci gag genu viru HIV. RT-PCR probíhala 25 min při 42 °C, 5 min při 94 °C, a poté po 40 cyklů (94 °C 60 s, 56 °C 60 s a 72 °C 90 s) se 100 pmol dvojice HIV primerů, specifických pro gen gag (GGAACATCAAGCAGCCATGC / TCCTTTGGTCCTTGTCTTATG TC). Specifické PGR produkty byly analyzovány pomocí dot-blot hybridizace s γ-³²Ρ terminálně značenou sondou (ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC) a počet impulzů za minutu (cpm) byl pro každý PCR signál zaznamenám pomocí scintilačního počítače.

Výsledky byly zaznamenány a vyneseny v grafické formě na obr. 2. Je zřejmé, že variabilita výsledků je mezi jednotlivými experimenty značná. Znovu je zde evidentní, že standard dává odlišné výsledky a měl by být proto použit v každém experimentu spolu se studovaným vzorkem.

Dále je z křivek na obrázku 2 zřejmé, že pro každou konstantní RNA ve smyslu počtu kopií existuje od jednoho experimentu ke druhému široký interval koncentrací PCR produktů.

• · · «····· ·· ·· ♦ * · *·· • · · · 9 «««· · ··· • ·····»· 9 · ·»999

Φ · · · Φ »« « * · * ··«·» » «4»

Příklad 3: Platnost standardu virové DNA

Na tomto příkladu je ukázáno, že účinnost amplifikace je identická, použijeme-li identické PCR cykly pro nativní DNA z virionů HBV pocházejících ze séra různých pacientů nakažených HBV. Postupná ředění různých DNA z virionů HBV byla připravena jako v příkladu 1 a byla podrobena shodnému počtu PCR cyklů ve shodném experimentu. PCR produkt byl kvantifikován pomocí dotblotu a stanovení cpm.

Výsledky, vynesené v grafu na obrázku 3 ukazují, že účinnost amplifikace pomocí PCR je identická nezávisle na zdroji virionů HIV (v tomto případě pro 4 odlišné zdroje).

Příklad 4: Platnost standardu virové DNA

V tomto experimentu bylo postupováno stejně jako v příkladu 3, ale ve všech případech byly ve stejném PCR cyklu použity DNA nativního virionů spolu s DNA pocházejícími ze dvou HBV plazmidů. Tak mohla být určena účinnost amplifikace srovnávacího PCR (viz obrázek 4).

DNA fragmenty sekvence genu C viru HBV byly amplifikovány pomocí PCR z HBVsAg+ séra a zaligovány do plazmidů pGEM-3Z (Promega) a pCT® (Invitrogen) (HBV plazmidy DNA1 a DNA2 resp.). Všechny konstrukty byly ověřeny DNA sekvenací s pomocí vhodného komerčního kitu.

Výsledky, vynesené v grafu na obrázku 4 ukazují, že známý počet kopií může a nemusí vykazovat účinnost amplifikace srovnatelnou s · Φ · · · ♦ · ♦ · « ·· • ·9999 · · 9 9· 9999 * · Φ Φ 9 9 99 • Φ * «<!>«<· 9 Φ <· · účinností amplifikace identického počtu kopií nativní virové DNA pocházející z několika vzorků.

Z příkladů 3 a 4 vyplývá, že známé koncentrace DNA z virionů HBV z různých zdrojů představují ideální univerzální standard, zatímco virové DNA fragmenty integrované do různých plazmidů se navzájem chovají odlišně a liší se i od nativních DNA.

Příklad 5: Platnost standardu virové RNA

Na tomto příkladu je dokázáno, že účinnost amplifikace je identická, použijeme-li identické RT-PCR cykly pro nativní RNA virionu HIV pocházející ze séra různých pacientů infikovaných HIV. Postupná ředění vzorků různých RNA z virionů HIV byla připravena tak jako v příkladu 2 a všechna byla podrobena stejnému RT-PCR cyklu ve stejném experimentu. Výsledné PCR produkty byly kvantifikovány pomocí dot-blotu a stanovení cpm. Výsledky, vynesené v grafu na obrázku 5 ukazují, že účinnost RTPCR amplifikace je identická nezávisle na zdroji virionu HIV.

Příklad 6: Platnost standardu virové RNA

V tomto experimentu bylo postupováno stejně jako v příkladu 5, ale ve všech případech byly ve stejném RT-PCR cyklu použity nativní virová RNA a RNA transkript o známém počtu kopií. Tak mohla být určena účinnost amplifikace srovnávacího RT-PCR (viz obrázek 6).

RNA fragmenty nesoucí sekvenci genu gag byly získány transkripcí HIV-1 DNA templátů (HIV-Z6 DNA v plazmidů pBR322 a HIVihb • 0 · • · · 0 ·

DNA v plazmidu pBH10-R3, resp.) pomocí T7 RNA polymerázy (HIV RNA1 a RNA2 transkripty, resp.).

Výsledky, vynesené v grafické formě na obrázku 6 ukazují, že účinnost amplifikace transkriptu RNA o známém počtu kopií pomocí RT-PCR je odlišná od účinnosti amplifikace vzorku.

Z výsledků v příkladech 5 a 6 tedy vyplývá, že známé koncentrace RNA viru HIV různého původu představují ideální univerzální standard, zatímco fragmenty virové RNA integrované do různých plazmidů se navzájem chovají odlišně a liší se i od nativních RNA.

Z výše uvedených příkladů vyplývá, že:

- Pro monitorování účinnosti amplifikace v kvantitativním PCR testu je podle vynálezu použití nativní virové DNA jako externího standardu přesnější a výhodnější než použití plazmidové DNA jako externího, nebo interního standardu.

- Pro monitorování účinnosti amplifikace v kvantitativním RT-PCR testu je podle vynálezu použití nativní virové RNA jako externího standardu mnohokrát přesnější a výhodnější než použití transkriptu RNA jako externího, nebo interního standardu.

Příklad 7: Kit pro vizuální kvantitativní detekci genomu viru lidské imunodeficience (HIV)

7.1. ÚVOD

Kit pro kvantitativní stanovení genomu viru lidské imunodeficience (HIV) podle vynálezu byl navržen pro detekci a kvantitativní stanovení genomové RNA viru HIV (včetně všech HIV-0, HIV-1 a HIV-2 genotypů) v jakékoliv bezbuněčné biologické tekutině (jako • 4» ♦ · · ··* « · 4<· · 9 · · · · · * · ·· · • ····· · · ♦ · « ·♦··»

4 · «9 4 4 ·· « 4 * 4 · 4 4 4 » · 4 4 jsou např. plazma, sérum, semeno, tekutina získaná výplacliem průdušek atd.), stejně jako v supernatantu buněčné kultury. Zahrnuty jsou i reagencie pro rychlou izolaci virové RNA reverzní transkripci RNA viru HIV na cDNA s použitím klonované reverzní transkriptázy viru Moloneyovy myší leukemie amplifikaci pomocí Taq DNA polymerázy - a konečně kvantitativní stanovení pomocí jednoduché vizualizace v agarózovém gelu. Nejmenší množství virové RNA, detekovatelné touto metodou je 1000 kopií a kvantitativní rozsah metody je více než 4 řády v jednom testu během 8 hodin. Kit obsahuje reagencie pro 100 reakcí (40μΐ každá) v konečném objemu podle protokolu 50 μΐ.

Kit dále obsahuje soubor standardů virionů HIV (dále nazývané „VirionStandardy“) tak, jak bylo popsáno výše (10⁴, 10³, 10² a 10 kopií/ μΐ určené pro 4 série testů), což umožňuje velmi přesné měření koncentrace RNA viru HIV v plazmě nebo v séru. Kit dále obsahuje plazmidovou DNA viru HIV (10² kopií/reakci určenou pro 4 série testů), která slouží jako pozitivní kontrola amplifikace, stejně jako případný heterologní RNA transkript, přidávaný do každého testovaného vzorku a sloužící jako vnitřní kontrola (dále jen „IC“) (10³ kopií/reakci, obsah dostačující pro 100 reakcí).

7.2. SEZNAM SLOŽEK TESTOVACÍHO KITU

Kit pro kvantitativní stanovení genomu HIV by měl být skladován nejraději při -20 °C v mrazícím boxu s konstantní teplotou nebo při 4 °C s použitím vhodného roztoku pro skladování enzymu. Pokud je výrobek skladován v předepsaných podmínkách, zůstává stabilní do data vyznačeného na obalu.

• ·

Číslo Reagencie		Objem	Množství Poznámka
1	HIV VirionStandard
la	VirionStandard 1 (I0⁴ kopií/ μΐ)	0,4 ml	1	pro kalibraci vzorku RNA
lb	VirionStandard 2 (10³ kopií/ μΐ)	0,4 ml	1	pro kalibraci vzorku RNA
1c	VirionStandard 3 (10² kopií/ μΐ)	0,4 ml	1	pro kalibraci vzorku RNA
ld	VirionStandard 4 (10 kopií/ μΐ)	0,4 ml	1	pro kalibraci vzorku RNA
1 e	VirionStandard 5 (HIV - negativní	0,4 ml	1	kontrola specificity (neg.
	sérum)				kontrola)
2	tRNA (0,1 mg/ml)		1 ml	1	slouží jako nosič RNA pro
					RNA vzorek
3	zásobní pufr pro RNA		250 μΐ	4	rozpouští RNA vzorek
4	HIV amplifikační směs	s HIV	1 ml	4	hybridizuje s HIV RNA a
	primery a IC primery	(jsou-li			cDNA genomy
	přítomny)
5	enzymová směs		28 μΐ	4	zpětně přepisuje cílovou
					RNA a amplifikuje cDNA
6	plazmidová HIV DNA (10	² kopií/	40 μΐ	1	HIV cDNA pozitivní
	μΐ)				kontrola
7	případný IC (10³ kopií/ μΐ)		1 ml	1	vnitřní kontrola RT
					amplifikační účinnosti
8	sterilní voda		40 μΐ	1	blank, negativní kontrola

7.3. REAGENCIE A VYBAVENÍ

7.3.1. REAGENCIE

- Chloroform (v ACS čistotě)

- Izopropanol (v ACS čistotě)

- 75% etanol (v ACS čistotě)

- Agaróza (bez příměsí DNáz)

- Etidium bromid • · ♦ · · · · · ··· · · ♦ ···♦<·♦ · W « ···· · • · · * · » · · · * ♦ ♦ · · ♦ · · »· · ·

- Roztoky pro izolaci RNA

7.3.2. VYBAVENÍ

- Centrifuga pro mikrozkumavky (4°C)

- Vakuová pumpa

- Termocycler (přístroj pro amplifikací DNA) s vyhřívaným víkem

- Zdroj a lázeň pro elektroforézu

7.4. PROTOKOL PRO KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ HIV POMOCÍ AMPLIFIKACE GENOMU SPOJENÉ S REVERZNÍ TRANSKRIPCÍ

7.4.1. IZOLACE RNA

100 μΐ HIV VirionStandardu a vzorek plazmy nebo séra byly homogenizovány se 400 μΐ roztoku pro izolaci RNA několika pohyby homogenizátoru. Dále bylo přidáno 60 μΐ chloroformu a směs byla prudce protřepána (15 s) a inkubována na ledu (10 min). Suspenze byla centrifugována 15 min při 12 000 g a 4 °C.

Po přidání chloroformu a centrifugaci vytvořil homogenát dvě fáze: spodní fenol-chloroformovou fázi (asi 240 μΐ) a horní vodnou fázi (asi 320 μ1). RNA zůstává výhradně ve vodné fázi, zatímco DNA a proteiny zůstávají v interfázi a v organické fázi.

Vodná fáze (asi 300 μΐ) byla převedena do Čisté zkumavky. K vodné fázi byl přidán stejný objem izopropanolu a vzorky byly inkubovány v -20 °C po dobu 1 h. Poté byly vzorky centrifugovány 10 min při 12 000 g (4 °C) a pelet byl lehce osušen. Supernatant byl odstraněn a RNA pelet byl jedenkrát promyt 75% etanolem (500 μΐ), vortexován a znovu centrifugován a nakonec byl RNA pelet vysušen ve vakuu. Poté byl pelet rozpuštěn vil μΐ pufru pro RNA.

·· · •· ··♦· • ·

Vy srážená RNA vytvoří na dně zkumavky bílo-žlutý pelet (viditelný jen ve velkém množství). Je důležité nesušit pelet příliš dlouho, neboť přílišné vysušení snižuje rozpustnost RNA.

7.4.2. REVERZNÍ TRANSKRIPCE A AMPLIFIKACE cDNA.

μΐ vzorků RNA a pozitivní/negativní kontroly bylo přidáno do čistých (200 μΐ) zkumavek ke 40 μΐ směsi pro HIV reverzní transkripci/amplifikaci (RTAM) (38,9 μΐ HIV amplifikační směsi +

1,1 μΐ enzymové směsi). Zkumavky byly umístěny do termocycleru s vyhřívaným víkem.

- 42 °C, 25 min;

- 94 °C, 5 min;

- 35 cyklů (94 °C, 35 s; 55 °C, 45 s; 72 °C, 60 s);

- Na závěr 55 °C, 5 min a 72 °C, 5 min.

7.5. VIZUALIZACE A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ μΐ vzorku bylo po PCR reakci naneseno na 1,5% agarózový gel s 0,5 μg/ml etidium bromidu. Elektroforéza probíhala 10 min při 150 V.

Specificky amplifikovaná sekvence HIV byla snadno rozeznána porovnáním rozdílů ve velikostech. Množství kopií virionů HIV ve 100 μΐ vzorku plazmy nebo séra může být určeno porovnáním intenzity proužku na elektroforéze po amplífikaci s HIV VirionStandardem (semikvantitatívní stanovení).

Příklad 8: Kit pro kvantitativní stanovení genomu viru lidské imunodeficience (HIV) pomocí měření optické denzity.

8.1. ÚVOD

Kit pro kvantitativní stanovení genomu viru lidské imunodeficience (HIV) podle vynálezu byl navržen pro detekci a kvantitativní ·· · * · stanovení genomové RNA viru HIV (včetně všech HIV-0, HIV-1 a HIV-2 genotypů) v jakékoliv bezbuněěné biologické tekutině (jako jsou např. plazma, sérum, semeno, tekutina získaná výplachem průdušek atd.), stejně jako v supernatantu buněčné kultury. Zahrnuty jsou i reagencie pro rychlou izolaci virové RNA reverzní transkripci RNA viru HIV na cDNA s použitím klonované reverzní transkriptázy viru Moloneyovy myší leukemie amplifikaci pomocí Taq DNA polymerázy - a konečně kvantitativní stanovení pomocí DIG hybridizace v tekutém médiu. Nejmenší množství virové RNA, detekovatelné touto metodou je 100 kopií a kvantitativní rozsah je více než 2 řády v jednom testu během 8 hodin. Kit obsahuje reagencie pro 100 reakcí (40μ1 každá) v konečném objemu podle protokolu 50 μΐ. Kit dále obsahuje soubor HIV VirionStandardů (ΙΟ³, 10², 10 a 1 kopii/ μΐ určené pro 4 série testů), což umožňuje velmi přesné měření koncentrace RNA viru HIV v plazmě nebo v séru. Kit dále obsahuje plazmidovou DNA viru HIV (10² kopií/reakci určenou pro 4 série testů), která slouží jako pozitivní kontrola amplifikace, stejně jako případný heterologní RNA transkript, přidávaný do každého testovaného vzorku a sloužící jako IC (10³ kopií/reakci, obsah dostačující pro 100 reakcí).

8.2. SEZNAM SLOŽEK TESTOVACÍHO KITU

Kit pro kvantitativní stanovení genomu HIV by měl být skladován nejraději při -20 °C v mrazícím boxu s konstantní taplotou nebo při 4 °C s použitím vhodného roztoku pro skladování enzymu. Pokud je výrobek skladován v předepsaných podmínkách, zůstává stabilní do data vyznačeného na obalu.

Číslo Reagencie

Objem Množství Poznámka

I Amplifikace genomu HIV spojená s reverzní transkripcí a značení DIG

HIV VirionStandard

la	VirionStandard 1 (I0³kopií/ μΐ)	0,4 ml	1	pro kalibraci vzorku RNA
lb	VirionStandard 2 (10² kopií/ μΐ)	0,4 ml	1	pro kalibraci vzorku RNA
lc	VirionStandard 3 (10 kopií/ μΐ)	0,4 ml	1	pro kalibraci vzorku RNA
ld	VirionStandard 4 (1 kopie/ μΐ)	0,4 ml	1	pro kalibraci vzorku RNA
le	VirionStandard 5 (HIV - negativní sérum)	0,4 ml	1	kontrola specificity (neg. kontrola)
2	tRNA (0,1 mg/ml)	1 ml	1	slouží jako nosič RNA pro RNA vzorek
3	zásobní pufr pro RNA	250 μΐ	4	rozpouští RNA vzorek
4	HIV amplifikační směs s HIV primery a IC primery (5 % DIGdUTP)	1 ml	4	hybridizuje s HIV RNA a cDNA genomy
5	enzymová směs	28 μΐ	4	zpětně přepisuje cílovou RNA a amplifikuje cDNA
6	plazmidová HIV DNA (10² kopií/ μΐ)	40 μΐ	1	HIV cDNA pozitivní kontrola
7	heterologní RNA transkript (10³ kopií/ μΐ)	1 ml	1	vnitřní kontrola RT amplifikační účinnosti
8	sterilní voda	40 μΐ	1	blank, negativní kontrola

II Hybridizace v tekutém médiu a detekce pomocí DIG

9	biotinylovaná HIV sonda	200 μΐ	1	váže HIV hybridizace	cDNA během v médiu
10	biotinylovaná IC	DNA- 100 μΐ	1	váže IC	cDNA během
	specifická sonda			hybridizace	v médiu
11	denaturační pufr	4 ml	1	umožňuje	denaturaci
				amplifikované dsDNA
12	hybridizační pufr	40 ml	1	umožňuje	hybridizaci

• · promývací pufr (lOx) • 4 ··*« «· ·« • · · * · · «

sondy s cílovou DNA ml 1 odstraňuje nespecifickou

DNA streptavidinem potažené kuličky 1 (24)

200 (nebo mikrotitrační destička - 8 jamek)

Anti-DIG-POD pracovní roztok 40 ml zachycení hybridizované

HIV cDNA z roztoku váže se k molekulám DIG specificky amplifikovaného produktu

ABTS roztok substrátu ml 1 Umožňuje barevnou reakci v systému POD

8.3. REAGENCIE A VYBAVENÍ

8.3.1. REAGENCIE

- Chloroform (v ACS čistotě)

- Izopropanol (v ACS čistotě)

- 75% etanol (v ACS čistotě)

- Roztoky pro izolaci RNA

- Streptavidinem potažená mikrotitrační destička

8.3.2. VYBAVENÍ

- Centrifuga pro mikrozkumavky (4°C)

- Vakuová pumpa

- Termocycler (přístroj pro amplifikaci DNA) s vyhřívaným víkem

- Vodní lázeň nebo inkubátor pro hybridizaci

- Automatický denzitometr

8.4. PROTOKOL PRO KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ HIV POMOCÍ

AMPLIFIKACE GENOMU SPOJENÉ S REVERZNÍ TRANSKRIPCÍ

8.4.1. IZOLACE RNA ♦ · ♦ ··· φ φ

Po přidání chloroformu a centrifugaci vytvořil homogenát dvě fáze: spodní fenol-chloroformovou fázi (asi 240 μΐ) a horní vodnou fázi (asi 320 μΐ). RNA zůstává výhradně ve vodné fázi, zatímco DNA a proteiny zůstávají v interfázi a v organické fázi.

Vodná fáze (asi 300 μΐ) byla převedena do čisté zkumavky. K vodné fázi byl přidán stejný objem izopropanolu a vzorky byly inkubovány v -20 °C po dobu 1 h. Poté byly vzorky centrifugovány 10 min při 12 000 g (4 °C) a pelet byl lehce osušen. Supernatant byl odstraněn a RNA pelet byl jedenkrát promyt 75% etanolem (500 μΐ), vortexován a znovu centrifugován a nakonec byl RNA pelet vysušen ve vakuu. Poté byl pelet rozpuštěn v 11 μΐ pufru pro RNA.

Vysrážená RNA vytvoří na dně zkumavky bílo-žlutý pelet (viditelný jen ve velkém množství). Je důležité nesušit pelet příliš dlouho, neboť přílišné vysušení snižuje rozpustnost RNA.

8.4.2. REVERZNÍ TRANSKRIPCE A AMPLIFIKACE cDNA μΐ vzorků RNA a pozitivní/negativní kontroly bylo přidáno do čistých (200 μΐ) zkumavek ke 40 μΐ směsi pro HIV reverzní transkripci/amplifikaci (RTAM) (38,7 μΐ HIV amplifikační směsi +

1,1 μΐ enzymové směsi + 0,2 μΐ DIG-dUTP). Zkumavky byly umístěny do přístroje pro PCR s vyhřívaným víčkem.

- 42 °C, 25 min;

τι ·· «··· «199 • · · · · · · 9 9 999 9 999

9 9999 9 9 9 99 999 99

·..· :

- 94 °C, 5 min;

- 36 cyklů (94 °C, 35 s; 55 °C, 45 s; 72 °C, 60 s);

- Na závěr 55 °C, 5 min a 72 °C, 5 min.

8.5. DETEKCE A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ μΐ produktu po amplifikaci (x2) a 10 x ředěné (x2) byly přdány do čistých zkumavek k 18 μΐ denaturačního roztoku a směs byla inkubována 10 min při pokojové teplotě. Po doplnění 180 μΐ hybridizačního roztoku (x4) s HIV sondou a IC sondou a promíchání (vortex) byla směs napipetována do streptavidinem potažených jamek mikrotitrační destičky a inkubována na třepačce 2 hodiny při 37 °C. Po odsátí roztoku byly jamky 3 x promyty 200 μΐ promývacího pufru a následně inkubovány na třepačce 30 min při 37 °C s 200 μΐ anti-DIG-POD pracovního roztoku. Poté byly jamky opět 3 x promyty 200 μΐ promývacího pufru a do každé jamky bylo přidáno 200 μΐ ABTS substrátového roztoku. Mikrotitrační destička byla inkubována ve tmě při 37 °C 30 min za stálého třepání. Po 30 minutách byla změřena absorbance při 405 nm. Počet virových partikulí HIV na ml byl pro každý vzorek séra nebo plazmy vypočten pomocí automatického počítačového systému za použití standardní křivky vypočtené pro HIV VírionStandardy (absolutní kvantifikace).

Příklad 9: Kit pro kvantitativní stanovení genomu viru lidské imunodeficience (HIV) pomocí měření fluorescence.

9.1. ÚVOD

Kit pro kvantitativní stanovení genomu viru lidské imunodeficience (HIV) podle vynálezu byl navržen a vyroben tak, jak bylo popsáno ·

• · • · 4 · · ·

4 ··· v příkladu 8. Liší se však v kvantitativním rozsahu metody, který činí více než 4 řády v jednom testu během 7 hodin.

9.2. SEZNAM SLOŽEK TESTOVACÍHO KITU

Číslo Reagencie Objem Množství Poznámka

I Amplifikace genomu HIV spojená s reverzní transkripcí

HIV VirionStandard

la	VirionStandard 1 (10³kopií/ μΐ)	0,4 ml	1	pro kalibraci vzorku RNA
lb	VirionStandard 2 (10² kopií/ μΐ)	0,4 ml	1	pro kalibraci vzorku
				RNA
lc	VirionStandard 3 (10 kopií/ μΐ)	0,4 ml	1	pro kalibraci vzorku
				RNA
ld	VirionStandard 4 (1 kopie/ μΐ)	0,4 ml	1	pro kalibraci vzorku
				RNA
le	VirionStandard 5 (HIV - negativní	0,4 ml	1	kontrola specificity
	sérum)			(neg. kontrola)
2	tRNA (0,1 mg/ml)	1 ml	1	slouží jako nosič RNA
				pro RNA vzorek
3	zásobní pufr pro RNA	250 μΐ	4	rozpouští RNA vzorek
4	HIV amplifikační směs s HIV	1 ml	4	hybridizuje s HIV RNA
	primery a IC primery			a cDNA genomy
5	enzymová směs	28 μΐ	4	zpětně přepisuje cílovou

RNA a amplifikuje cDNA ·· · ·· ·♦»· 9» ·9 • · · 9 9 9 9 · 9 9

9 9 9 9 4 994 9 9 99 • 9494999 9 4« 9 99 9 9 • 4 4 9 4 9 99« *· « 99 99· »9 9 9

6	plazmidová HIV DNA (10² kopií/ 40 μΐ μΐ)	1	HIV cDNA pozitivní kontrola
7	heterologní RNA transkript (10³	1 ml	1	vnitřní kontrola RT -
	kopií/ μΐ)			amplifikační účinnosti
8	sterilní voda	40 μΐ	1	blank, negativní

kontrola

II Hybridizace v tekutém médiu a detekce pomocí fluorescence

9	mikrotitrační destička potažená 8 jamek HIV sondou (+a-kmeny)	12	zachytí HIV cDNA během hybridizace v médiu
10	mikrotitrační destička potažená	8 jamek	12	váže IC cDNA během
	IC sondou			hybridizace v médiu
11	denaturační pufr	2 ml	1	umožňuje denaturaci amplifikované dsDNA
12	hybridizační pufr	20 ml	1	umožňuje hybridizaci sondy s cílovou DNA
13	promývací pufr (10x)	100 ml	1	odstraňuje nespecifickou DNA
14	Fluorescenční barvivo	10 ml	1	umožní detekci dsDNA
				po amplifikaci
15	Anti-DIG-POD pracovní roztok	40 ml	1	váže se k molekulám DIG specificky amplifiko váného produktu
16	ABTS roztok substrátu	40 ml	1	Umožňuje barevnou reakci v systému POD

9.3. REAGENCIE A VYBAVENÍ

9.3.1. REAGENCIE

- Chloroform (v ACS čistotě)

- Izopropanol (v ACS čistotě) ··· ··· ···· • · · · · · ··« · · ·· • · ···· · · · « · « ₍··· ·· · ··· ·· · ·· ··· ·* ··

- 75% etanol (v ACS čistotě)

- Roztoky pro izolaci RNA

9.3.2. VYBAVENÍ

- Centrifuga pro mikrozkumavky (4°C)

- Vakuová centrifuga

- Termocycler (přístroj pro amplifikaci DNA) s vyhřívaným víkem

- Vodní lázeň nebo inkubátor pro hybridizaci

- Citlivý fluorometr

9.4. PROTOKOL PRO KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ HIV POMOCÍ AMPLIFIKACE GENOMU SPOJENÉ S REVERZNÍ TRANSKRIPCÍ

9.4.1. IZOLACE RNA

100 μΐ HIV VirionStandardu a vzorek plazmy nebo séra byly homogenizovány se 400 μΐ roztoku pro izolaci RNA několika pohyby homogenizátoru. Dále bylo přidáno 60 μΐ chloroformu a směs byla prudce protřepána (15 s) a ustálena na ledu (10 min). Suspenze byla centrifugo vána 15 min při 12 000 g a 4 °C.

• ·

9.4.2. REVERZNÍ TRANSKRIPCE A AMPLIFIKACE cDNA μΐ vzorků RNA a pozitivní/negativní kontroly bylo přidáno do čistých (200 μΐ) zkumavek ke 40 μΐ směsi pro HIV reverzní transkripci/amplifikaci (RTAM) (38,9 μΐ HIV amplifikační směsi +

1,1 μΐ enzymové směsi). Zkumavky byly umístěny do přístroje pro PCR s vyhřívaným víčkem.

- 42 °C, 25 min;

- 94 °C, 5 min;

- 35 cyklů (94 °C, 35 s; 55 °C, 45 s; 72 °C, 60 s);

- Na závěr 55 °C, 5 min a 72 °C, 5 min.

9.5. DETEKCE A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ μΐ (2x) amplifikované směsi bylo přidáno do čistých zkumavek s 15 μΐ denaturačního pufru a inkubováno 10 min při pokojové teplotě. Poté bylo přidáno 180 μΐ (2x) hybridizačního roztoku, směs byla promíchána (vortex) a napipetována do jamek mikrotitrační destičky potažených HlV-sondou. Destičky byly inkubovány 2 hod při 37 °C za stálého míchání. Po skončení inkubace byl roztok z jamek odstraněn a jamky byly 3x promyty 200 μΐ promývacího pufru. Poté bylo přidáno 100 μΐ roztoku fluorescenčního barviva a destička byla přenesena do automatického fluorometru. Změřená fluorescence byla zaznamenána.

• φ

Příklad 10: Kit pro kvantitativní stanovení genomu viru lidské imunodeficience (HIV) pomocí měření chemiluminiscence.

10.1. ÚVOD

Kit pro kvantitativní stanovení genomu viru lidské imunodeficience (HIV) podle vynálezu byl navržen a vyroben tak, jak bylo popsáno v příkladu 8. Liší se však v kvantitativním rozsahu metody, který ěiní více než 4 řády v jednom testu během 7 hodin.

10.2. SEZNAM SLOŽEK TESTOVACÍHO KITU

Kit pro kvantitativní stanovení genomu HIV by měl být skladován nejraději při -20 °C v mrazícím boxu s konstantní teplotou. Pokud je výrobek skladován v předepsaných podmínkách, zůstává stabilní do data vyznačeného na obalu.

Číslo Reagencie Objem Množství Poznámka

I Amplifikace genomu HIV spojená s reverzní transkripcí

1	HIV VirionStandard
la	VirionStandard	1	(10³kopií/ μΐ)	0,4	ml	1	pro	kalibraci	vzorku
							RNA
lb	VirionStandard	2	(10² kopií/ μΐ)	0,4	ml	1	pro	kalibraci	vzorku
							RNA
lc	VirionStandard	3	(10 kopií/ μΐ)	0,4	ml	1	pro	kalibraci	vzorku
							RNA
ld	VirionStandard	4	(1 kopie/ μΐ)	0,4	ml	1	pro	kalibraci	vzorku
							RNA
le	VirionStandard	5	(HIV - negativní	0,4	ml	1	kontrola specificity (neg.
	sérum)						kontrola)
2	tRNA (0,1 mg/ml)	1 ml	1	slouží	jako nosič RNA

4444 «

pro RNA vzorek

3	zásobní pufr pro RNA	250 μΐ	4	rozpouští RNA vzorek
4	HIV amplifikační směs s biotinylovanými HIV příměry a IC primery	1 ml	4	hybridizuje s HIV RNA a cDNA genomy
5	enzymová směs	28 μΐ	4	zpětně přepisuje cílovou RNA a amplifikuje cDNA
6	plazmidová HIV DNA (10² kopii/ μΐ)	40 μΐ	1	HIV cDNA pozitivní kontrola
7	heterologní RNA transkript (10³kopií/ μΐ)	1 ml	1	vnitřní kontrola RT amplifikační účinnosti
8	sterilní voda	40 μΐ	1	blank, negativní kontrola
II Hybridizace v tekutém médiu í	i chemiluminiscenční značení
9	HlV-specifická sonda	100 μΐ	1	specificky hybridizuje s HIV cDNA
10	IC-specifická sonda	100 μΐ	1	specificky hybridizuje s IC cDNA
11	denaturační pufr	5 ml	1	umožňuje denaturaci amplifikované dsDNA
12	hybridizaČní pufr	50 ml	1	umožňuje hybridizaci sondy s cílovou DNA
13	promývací pufr (lOx)	50 ml	1	odstraňuje nespecifickou DNA
14	streptavidinem potažené kuličky (nebo mikrotitrační dstička)	200 (8 jamek)	1 (24)	váže hybridizovanou HIV cDNA během hybridizace v médiu
15	Anti-dsDNA-APL pracovní roztok	10 ml	1	značení hybridizované cílové DNA produktu
16	chemiluminiscenční substrátový roztok	10 ml	1	umožňuje detekci a kvantifikaci pomocí

chemiluminiscence • φ

10.3. REAGENCIE A VYBAVENÍ

10.3.1. REAGENCIE

- Chloroform (v ACS čistotě)

- Izopropanol (v ACS čistotě)

- 75% etanol (v ACS čistotě)

- Roztoky pro izolaci RNA

10.3.2. VYBAVENÍ

- Centrifuga pro mikrozkumavky (4°C)

- Vakuová centrifuga

- Termocycler (přístroj pro amplifikaci DNA) s vyhřívaným víkem

- Vodní lázeň nebo inkubátor pro hybridizaci v médiu

- Citlivý luminometr

10.4. PROTOKOL PRO KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ HIV POMOCÍ

AMPLIFIKACE GENOMU SPOJENÉ S REVERZNÍ TRANSKRIPCÍ

10.4.1. IZOLACE RNA

Vodná fáze (asi 300 μΐ) byla převedena do čisté zkumavky. K vodné fázi byl přidán stejný objem izopropanolu a vzorky byly inkubovány v -20 °C po dobu 1 h. Poté byly vzorky centrifugovány 10 min při 12 000 g (4 °C) a pelet byl lehce osušen. Supernatant • · byl odstraněn a RNA pelet byl jedenkrát promyt 75% etanolem (500 μΐ), vortexován a znovu centrifugován a nakonec byl RNA pelet vysušen ve vakuu. Poté byl pelet rozpuštěn v 11 μΐ pufru pro

RNA.

10.4.2. REVERZNÍ TRANSKRIPCE A AMPLIFIKACE cDNA μΐ vzorků RNA a pozitivní/negativní kontroly bylo přidáno do čistých (200 μΐ) zkumavek ke 40 μΐ směsi pro HIV reverzní transkripci/amplifikaci (RTAM) (38,9 μΐ HIV amplifikační směsi +

- 42 °C, 25 min;

- 94 °C, 5 min;

- 35 cyklů (94 °C, 35 s; 55 °C, 45 s; 72 °C, 60 s);

- Na závěr 55 °C, 5 min a 72 °C, 5 min.

10.5. DETEKCE A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ μΐ produktu po amplifikaci (x2) bylo přidáno do dvou čistých zkumavek k 15 μΐ denaturačního roztoku a směs byla inkubována 10 min při pokojové teplotě. Po doplnění 180 μΐ hybridizačního roztoku (x2) s HlV-specifickou sondou a (IC)-DNA-specifickou sondou a promíchání (vortex) byla směs napipetována do streptavidinem potažených jamek mikrotitrační destičky a inkubována na třepačce 2 hodiny při 37 °C. Po odsátí roztoku byly jamky 3 x promyty 200 μΐ promývacího pufru a následně inkubovány na třepačce 30 min při 37 °C s 200 μΐ roztoku anti dsDNA protilátek konjugovaných s alkalickou fosfatázou (APL). Poté byly jamky opět 3 x promyty 200 μΐ promývacího pufru a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ chemiluminiscenčního substrátového roztoku. Destičky byly okamžitě přeneseny do luminometru a byla změřena chemiluminiscence a výsledek byl zaznamenán. Počet HIV partikulí na ml každého vzorku plazmy nebo séra byl vypočten za pomoci automatického počítačového systému s použitím standardní křivky HIV VirionStandardů (absolutní kvantifikace).

Příklad 11: Kit pro kvantitativní stanovení genomu lidského viru hepatitidy B (HBV) pomocí měření chemiluminiscence

11.1. ÚVOD

Kit pro kvantitativní stanovení genomu viru hepatitidy B (HBV) podle vynálezu byl navržen pro detekci a kvantitativní stanovení genomové DNA viru HBV v jakékoliv bezbuněčné biologické tekutině (jako jsou např. plazma, sérum, semeno, tekutina získaná výplachem průdušek atd). Zahrnuty jsou i reagencie pro rychlou izolaci virové DNA - amplifikaci pomocí Taq DNA polymerázy - a kvantitativní stanovení pomocí hybridizace spojené s chemiluminiscencí. Nejmenší množství virové DNA, detekovatelné touto metodou je 50 kopií a kvantitativní rozsah je více než 4 řády v jednom testu během 5 hodin. Kit obsahuje reagencie pro 100 reakcí (40 μΐ každá) v konečném objemu podle protokolu 50 μΐ.

Kit dále obsahuje soubor HBV VirionStandardů (10⁴, ΙΟ³, 10² a 10 kopii/μΐ určené pro 4 série testů), což umožňuje velmi přesné měření koncentrace DNA viru HBV v plazmě nebo v séru. Kit dále • 99 ·

obsahuje plazmidovou DNA viru HBV (10³ kopií/reakci určenou pro 4 série testů), která slouží jako pozitivní kontrola amplifikace, stejně jako případná heterologní plazmidová DNA, přidávaná do každého testovaného vzorku a sloužící jako IC (10 kopií/reakci, obsah dostačující pro 100 reakcí).

11.2. SEZNAM SLOŽEK TESTOVACÍHO KITU

Kit pro kvantitativní stanovení genomu HBV by měl být skladován nejraději při -20 °C v mrazícím boxu s konstantní taplotou nebo při 4 °C s použitím vhodného roztoku pro skladování enzymu. Pokud je výrobek skladován v předepsaných podmínkách, zůstává stabilní do data vyznačeného na obalu.

Číslo Reagencie

Objem Množství Poznámka

I Amplifikace genomu HBV

1	HBV VirionStandard
la	VirionStandard 1 (10⁴kopií/ μΐ)	0,2 ml	1	pro kalibraci	vzorku
				DNA
lb	VirionStandard 2 (10³ kopii/ μΐ)	0,2 ml	1	pro kalibraci	vzorku
				DNA
lc	VirionStandard 3 (10² kopií/ μΐ)	0,2 ml	1	pro kalibraci	vzorku
				DNA
ld	VirionStandard 4 (10 kopií/ μΐ)	0,2 ml	1	pro kalibraci	vzorku
				DNA
le	VirionStandard 5 (HBV	0,2 ml	1	kontrola specificity (neg.
	negativní sérum)			kontrola)
2	HBV amplifikační směs	1,1 ml	4	hybridizuje s	DNA
	s biotinylovanými HBV primery a			genomu HBV
	IC primery
3	Taq DNA polymeráza	25 μΐ	1	amplifikuje cílovou DNA
4	plazmidová HBV DNA (10² kopii/	50 μΐ	1	HBV cDNA	pozitivní

μΐ) kontrola heterologní plazmidová DNA (ΙΟ² 1 ml vnitrní kontrola účinnosti kopií/ μΐ) sterilní voda amplifikace

100 μΐ 1 blank, negativní kontrola

DNA vymývací pufr

II Hybridizace v tekutém médiu a chemiluminiscenční značení

8	HBV-specifická sonda	100 μΐ	1	specificky hybridizuje s HBV cDNA
9	IC-specifická sonda	100 μΐ	1	specificky hybridizuje s IC DNA
10	denaturační pufr	5 ml	1	umožňuje denaturaci amplifikované dsDNA
11	hybridizační pufr	50 ml	1	umožňuje hybridizaci sondy s cílovou DNA
12	promývací pufr (10x)	50 ml	1	odstraňuje nespecifickou DNA
14	streptavidinem potažené kuličky (nebo mikrotitrační dstička)	200 (8 jamek)	1 (24)	váže hybridizovanou HBV cDNA během hybridizace v médiu
15	Anti-dsDNA-APL pracovní roztok	10 ml	1	značení hybridizované cílové DNA
16	chemiluminiscenční substrátový roztok	10 ml	1	umožňuje detekci a kvantifikaci pomocí luminiscence

11.3. NEZBYTNÉ VYBAVENÍ

- Centrifuga pro mikrozkumavky

- Termocycler (přístroj pro amplifikaci DNA) s vyhřívaným víkem

- Vodní lázeň pro hybridizaci v médiu

- Luminometr

11.4. PROTOKOL PRO PŘÍPRAVU VZORKU A AMPLIFIKACI DNA

11.4.1. PŘÍPRAVA VZORKU μΐ HBV VirionStandardu a homogenizováno s 50 μΐ DNA inkubována 15 min při 98 °C. centrifugovány 10 min při 7 500 výhradně v supernatantu (10 - 15 peletu.

11.4.2. AMPLIFIKACE CDNA • · · · • · ·· • · · · · • · · · · · • · ··· ·· ·· vzorků plazmy nebo séra bylo vymývacího pufru a směs byla Poté byly zkumavky se vzorky g. DNA zůstává po centrifugaci μΐ), zatímco proteiny zůstávají v μΐ supernatantu bylo přeneseno do čistých 200 μΐ zkumavek, do každé bylo přidáno 40 μΐ HBV amplifíkační směsi (40 μΐ HBV amplifikační směsi + 5 μΐ Taq DNA polymerázy) a zkumavky byly umístěny v termocycleru.

- 94 °C 5 min;

- 35 cyklů (94 °C, 35 s; 60 °C, 45 s; 72 °C, 60 s);

- na závěr 72 °C 5 min.

11.5. VIZUALIZACE A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ μΐ produktu po amplifikaci (x2) bylo přidáno do dvou čistých zkumavek k 15 μΐ denaturačního roztoku a směs byla inkubována 10 min při pokojové teplotě. Po doplnění 180 μΐ hybridizačního roztoku (x2) s HBV-specifickou sondou nebo (IC)-DNAspecifickou sondou a promíchání (vortex) byla směs napipetována do zkumavek se streptavidinem potaženými kuličkami nebo do streptavidinem potažených jamek mikrotitrační destičky a inkubována na třepačce 2 hodiny při 37 °C. Po odsátí roztoku byly jamky 3 x promyty 200 μΐ promývacího pufru a následně inkubovány na třepačce 30 min při 37 °C s 200 μΐ roztoku antidsDNA protilátek konjugovaných s alkalickou fosfatázou (APL).

Poté byly jamky opět 3 x promyty 200 μΐ promývacího pufru a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ chemiluminisceněního substrátového roztoku. Destičky byly okamžitě přeneseny do luminometru a byla změřena chemiluminiscence a výsledek byl zaznamenán. Počet HBV partikul! na ml každého vzorku plazmy nebo séra byl vypočten s pomocí automatického počítačového systému s použitím standardní křivky HBV VirionStandardů (absolutní kvantifikace).

Claims

1. Způsob kvantitativního stanovení a detekce jakéhokoliv DNA nebo RNA mikroorganizmu vyznačující se tím, že zahrnuje (1) použití nebo určení standardní koncentrace mikroorganizmu nebo koncentrace DNA nebo RNA obsažené v tomto mikroorganizmu nazývaném standradní mikroorganizmus a (2) porovnání množství produktu reverzní transkripce a/nebo amplifikace RNA nebo DNA pocházející z mikroorganizmu o neznámé koncentraci s množstvím amplifikačního produktu pocházejícího z RNA nebo DNA zmíněného mikroorganizmu o známé koncentraci.

(2) izolace DNA nebo RNA a změření jejího množství;

·· ·

2 nezbytně obsahuje srovnávací důkaz založený na porovnání koncentrací standardu s koncentrací cílového mikroorganizmu nejčastěji určené pomocí tzv. metody větvené DNA nebo pomocí jiné detekční metody, která nevyužívá amplifikace DNA nebo RNA standardu nebo cílového mikroorganizmu.

2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že krok

(3) použití počtu nukleotidů testovaného mikroorganizmu k dalším výpočtům;

3. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky (1) odebrání vzorku daného množství mikroorganizmu, který má být určen, z lidské, živočišné nebo rostlinné tkáně nebo z buněčné kultury a jeho purifikace, přičemž množství mikroorganizmu musí být dostatečné pro měření výsledné koncentrace cílové DNA nebo RNA přímými metodami;

4. Způsob podle nároku 3 vy zn a č u j í c í se tím, že kroky 2 až 5 jsou nahrazeny jednoduchým přímým měřením počtu mikroorganizmů.

• · ·

(4) výpočet celkové molekulové hmotnosti DNA nebo RNA řečeného mikroorganizmu ze známého celkového počtu nukleotidů s použitím průměrné molekulové hmotnosti nukleotidu, která je také známá;

5. Způsob podle nároků 1 až 4 v y z n a č u j í c í se tím, že navíc zahrnuje použití vnitřní (interní) kontroly (IC), nejčastěji ve formě heterologní plazmidové DNA nebo transkriptu RNA, jejichž sekvence a primery nemají žádný vztah k cílové DNA nebo RNA. IC slouží pro kontrolu účinnosti amplifikace nebo amplifikace spojené s reverzní transkripcí.

(5) výpočet množství DNA nebo RNA v každém mikroorganizmu s pomocí Avogadrova čísla;

6. Způsob podle nároků 1 nebo 2 vyznačující se tím, ž e příprava známých koncentrací mikroorganizmu je nahrazena přípravou známých koncentrací

- shodného inaktivovaného mikroorganizmu, jehož DNA nebo RNA zůstává schopna detekce a kvantifikace pomocí detekčních metod, jakými jsou např. tzv. metoda větvené DNA a/nebo reverzní transkripce a/nebo amplifikace, shodných s metodami, použitými pro kavntifikaci a/nebo detekci DNA nebo RNA nativního viru;

kompletní sekvence nukleotidů, izolované ze stejného mikroorganizmu; nebo

- kompletní nukleotidové sekvence, připravené syntézou.

(6) příprava a/nebo použití série standardních koncentrací mikroorganizmu získané postupným ředěním již dříve standardizovaného mikroorganizmu ve smyslu koncentrace jeho DNA nebo RNA. Taková série se nazývá externí standard a platí že (a) koncentrace DNA nebo RNA a (b) koncentrace mikroorganizmu je známá pro každé ředění;

7. Způsob podle nároků 1 až 6 vyznačující se tím, že vzorky známých standardních koncentrací celkové DNA nebo RNA mikroorganizmu, který má být určen nebo kvantifikován, nebo vzorky RNA nebo DNA genomu zmíněných mikroorganizmů o koncentraci, odpovídající známým koncentracím tohoto mikroorganizmu jsou připraveny s předstihem a uloženy až do doby použití.

(7) izolace DNA nebo RNA ze standardního a cílového mikroorganizmu a současná detekce extraktů pomocí tzv. metody větvené DNA nebo jiné detekční metody, která nevyužívá amplifikaci DNA nebo RNA standardů nebo cílového mikroorganizmu a/nebo pomocí reverzní transkripce a/nebo alespoň jedné amplifikace a zaznamenání výsledných hodnot; a (8) porovnání koncentrací DNA nebo RNA standardu a cílového mikroorganizmu s hodnotami externího standardu a následné odvození hodnot koncentrace DNA nebo RNA nebo celkové koncentrace mikroorganizmů v každém vzorku cílového mikroorganizmu.

8. Kit nebo soubor potřeb pro kvantitativní stanovení a detekci DNA nebo RNA mikroorganizmů vyznačující se tím, ž e obsahuje následující položky uspořádané ve vhodných nádobách a/nebo přítomné ve formě vhodných pomůcek:

• ··

- Soubor známých standardizovaných koncentrací celkové DNA nebo RNA mikroorganizmu stejného typu, jako je mikroorganizmus, který má být kvantifikován či určen, nebo DNA nebo RNA v koncentracích odpovídajících známým koncentracím zmíněného mikroorganizmu;

- Prostředky pro izolaci, určení a/nebo reverzní transkripci a/nebo amplifikaci DNA nebo RNA cílového a standardního mikroorganizmu především pomocí PCR, RT-PCR nebo NASBA;

- Prostředky pro analýzu DNA nebo RNA cílového a standardního mikroorganizmu nebo výsledných amplifikačních produktů.

9. Kit nebo soubor prostředků podle nároku 8 vyznačující se tím, že obsahuje prostředky pro jednoduché přímé měření počtu mikroorganizmů.

10. Kit nebo soubor prostředků podle nároku 8 a 9 vyznačující se tím, že dále obsahuje vnitřní kontrolu nej častěji ve formě heterologní plazmidové DNA nebo transkriptu RNA, jejíž sekvence a primery nemají žádný vztah k cílové DNA nebo RNA. IC slouží pro kontrolu účinnosti amplifikace nebo amplifikace spojené s reverzní transkripcí.

11. Použití způsobů podle nároků 1 až 7 pro kvantitativní stanovení mikroorganizmů ve všech médiích nebo vzorcích nebo pro stanovení minimálního měřitelného množství nebo i větších množství mikroorganizmu.

12. Použití kitu nebo souboru prostředků podle nároků 8 až 10 pro kvantitativní stanovení mikroorganizmů ve všech médiích nebo vzorcích nebo pro stanovení minimálního měřitelného množství nebo i větších množství mikroorganizmu.