FR2740781A1 - Procede et kit pour la quantification et la detection des micro-organismes - Google Patents
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Abstract
Dans le procédé selon l'invention, - on utilise ou on détermine une quantité du micro-organisme concerné ou celle d'ADN ou d'ARN de ce micro organisme et - après extraction, rétrotranscription et/ou amplification d'une fraction du génome du dit micro-organisme, on effectue une comparaison de la quantité de produit de transcription réverse et/ou amplification de l'ARN ou de l'ADN issu d'une concentration inconnue du micro-organisme avec la quantité des produits de transcription réverse et/ou amplification soit de l'ARN ou l'ADN issu d'une gamme de concentrations connues du dit micro-organisme, utilisées comme étalon externe et traitées en parallèle, soit d'une gamme de concentrations connues d'ARN ou d'ADN du dit micro-organisme. Application à la quantification et la détection de tous les micro-organismes.
Description
La présente invention concerne la quantification et la détection des micro-organismes. Elle concerne plus particulièrement le dosage quantitatif et/ou la détection des micro-organismes porteurs d'un génome à ADN ou à ARN.
L'invention s'applique à tous les micro-organismes connus, tels que des virus, bactéries, bacilles, protozoaires, hématozoaires, porteurs d'un génome à ADN ou à ARN, touchant l'homme, l'animal ou les végétaux, ainsi qu'aux micro-organismes tels qu'ils existent chez l'homme, les animaux et les végétaux, en état pathologique ou normal; elle s'applique également à la quantification et la détection de ces mêmes micro-organismes dans les produits issus des animaux, y compris l'homme, et des végétaux, de même que de ceux susceptibles d'exister dans l'eau.
La méthode selon l'invention est décrite plus loin pour la quantification de l'infection par le virus à ARN de l'immunodéficience humaine (VIH) et de l'infection par le virus de l'hépatite B à ADN humain (VHB).
L'étude de l'épidémiologie, le traitement et la prophylaxie des pathologies humaines, animales et végétales sont de nos jours un objectif prioritaire de la médecine humaine et vétérinaire et de l'agronomie ou de l'industrie phytosanitaire. L'identification et la quantification des micro-organismes dans des milieux tels que par exemple les tissus, les fluides biologiques et les préparations in vitro sont des étapes indispensables à la bonne conduite de tels projets. Compte tenu de la taille de la plupart des micro-organismes, notamment des virus, et de leur concentration dans les milieux biologiques (en général de l'ordre de 101 à 107 micro-organismes/ml), seuls les outils technologiques actuels faisant appel à l'amplification de fragments de génomes permettent à la fois l'identification moléculaire et une évaluation quantitative.La méthode d'amplification génomique la plus utilisée actuellement est dénommée amplification en chaîne par polymérase ou ACP (en anglais polymerase chain reaction ou PCR). Grâce à une enzyme, la polymérase, il est ainsi possible d'amplifier un fragment de génome à
ADN. De même, on peut réaliser une rétrotranscription (ou transcription réverse) d'ARN en ADN et une amplification grâce au couple transcriptase réverse + polymérase ou à une enzyme réalisant les deux opérations. Une fois amplifié, ce morceau de génome ou amplificat est spécifiquement identifié par différentes méthodes (sonde radioactive ou colorée, taille du fragment).
ADN. De même, on peut réaliser une rétrotranscription (ou transcription réverse) d'ARN en ADN et une amplification grâce au couple transcriptase réverse + polymérase ou à une enzyme réalisant les deux opérations. Une fois amplifié, ce morceau de génome ou amplificat est spécifiquement identifié par différentes méthodes (sonde radioactive ou colorée, taille du fragment).
Des méthodes de quantification de VIH par ACP sont par exemple décrites par Holodniy M. et al., dans J.
Infect. Dis. 163, 862-866 (1991); Aoki-Sei S. et al., dans
J. AIDS Res. Hum. Retrovirus 8, 1263-1270 (1992);
Bagnarelli P. et al., dans J. Virol.66, 7328-7335 (1992);
Piatak Jr. M. et al., dans Science 259, 1749-1755 (1993);
Bruisten S.M. et al., dans AIDS 7 (suppl. 2), S15-S20 (1993)-
Des méthodes de quantification d'ARN du virus de l'hépatite C ont été décrites par exemple par Kumar U. et al., dans J. Virol. Methods 47(1-2), 95-102 (1994); Manzin
A. et al., dans J. Clin. Microbiol. 32(8), 1939-44 (1994);
Ravaggi A. et al., J. Clin. Microbiol. 33(2), 265-9 (1995); Young K.K. et al., J. Clin. Microbiol. 33(3), 6547 (1995).
J. AIDS Res. Hum. Retrovirus 8, 1263-1270 (1992);
Bagnarelli P. et al., dans J. Virol.66, 7328-7335 (1992);
Piatak Jr. M. et al., dans Science 259, 1749-1755 (1993);
Bruisten S.M. et al., dans AIDS 7 (suppl. 2), S15-S20 (1993)-
Des méthodes de quantification d'ARN du virus de l'hépatite C ont été décrites par exemple par Kumar U. et al., dans J. Virol. Methods 47(1-2), 95-102 (1994); Manzin
A. et al., dans J. Clin. Microbiol. 32(8), 1939-44 (1994);
Ravaggi A. et al., J. Clin. Microbiol. 33(2), 265-9 (1995); Young K.K. et al., J. Clin. Microbiol. 33(3), 6547 (1995).
Des méthodes de quantification d'ADN du virus de l'hépatite B ont été décrites par exemple par Lehtovaara
P. et al., dans PCR Methods Appl. 3(3), 169-75 (1993); Wu
J. et al., dans J. Virol. Methods 49(3), 331-41 (1994);
Zaaijer H.L. et al., dans J. Clin. Microbiol. 32(9), 208891 (1994); Kaneko S. et al., dans J. Clin. Microbiol.
P. et al., dans PCR Methods Appl. 3(3), 169-75 (1993); Wu
J. et al., dans J. Virol. Methods 49(3), 331-41 (1994);
Zaaijer H.L. et al., dans J. Clin. Microbiol. 32(9), 208891 (1994); Kaneko S. et al., dans J. Clin. Microbiol.
27(9), 1930-33 (1989).
Cependant, la relation entre le produit amplifié et 1'ADN ou 1'ARN initial n'est réellement pas vraiment constante d'une expérience à l'autre, d'où la nécessité de se préoccuper du problème de la mesure d'un étalon dont les concentrations sont connues par ailleurs.
Les capacités d'amplification de 1'ACP ont pu être évaluées jusqu'ici grâce à des cellules n'ayant le génome à doser qu'en un nombre constant d'exemplaires ou à des plasmides comportant chacun un unique morceau de gène. I1 a ainsi pu être établi que même un seul fragment de gène peut, grâce à 1'ACP, être spécifiquement identifié. On a également établi qu'il existait un rapport de proportionnalité entre des concentrations d'ADN d'un plasmide soumises à amplification et les concentrations d'ADN mesurées après amplification. Cependant ce rapport de proportionnalité s'est avéré changer d'une expérience à l'autre, car l'amplification par ACP est un processus biologique, résultant de l'action de la polymérase, qui n'est pas maîtrisé de façon aussi complète que le serait une technique purement physique.
Cela a conduit les chercheurs et les ingénieurs des firmes de biotechnologie à introduire un étalonnage dans chaque expérience de quantification virale. Jusqu'à présent, l'étalon est constitué d'une série de concentrations (trois à cinq en général) d'un plasmide étalon dont le fragment d'ADN à amplifier a les mêmes amorces et est selon les technologies de séquence partiellement différente ou de séquence identique. Le rapport d'amplification de 1'ADN de concentrations égales de deux plasmides à amorces identiques, mais de longueur et donc de séquences différentes: 1) peut être différent d'un cas à l'autre et 2) n'est pas nécessairement identique à celui de l'ADN issu de concentrations identiques de virus natifs au sein de la même expérience.
Le problème est plus complexe encore si l'on cherche à quantifier ou à identifier des virus à ARN, tels que par exemple celui du SIDA (VIH). En effet, l'étape d'amplification par ACP doit, pour les virus à ARN, être associée à une étape de rétrotranscription (en abrégé RT) souvent réalisée soit grâce à une autre enzyme, la transcriptase réverse ou transcriptase inverse, soit grâce à une enzyme ayant les deux actions (de rétrotranscription et d'amplification de l'ADN). Dans l'un et l'autre cas, les enzymes actuellement disponibles sur le marché permettent d'obtenir des rapports de rétrotranscription pouvant varier d'une expérience à l'autre de 10 : 1 (c'est-à-dire que 10 copies d'ARN donnent 1 copie d'ADN) à 100 : 1 (100 copies d'ARN donnent 1 copie d'ADN).Le problème qui en résulte, à savoir la non-comparabilité des résultats d'expériences sucessives, a jusqu'à présent été résolu par incubation simultanée d'une gamme de concentrations d'un fragment d'ARN étalon (transcrit étalon) utilisant les mêmes amorces, mais dont la partie amplifiée est soit identique si on l'utilise en étalon externe, soit différente, en séquence ou en longueur, si on l'utilise en coamplification, le transcrit étant alors incubé dans le même tube que l'ARN du micro-organisme cible à doser. Il apparaît malheureusement que les concentrations d'amplificats issus des mêmes concentrations de deux transcrits peuvent être différentes et de même différentes de celles issues d'ARN provenant de concentrations identiques de virus.
En conclusion, - les techniques connues de rétrotranscription et/ou d'amplification ne donnent pas des résultats identiques d'une expérience à l'autre pour un même échantillon; - un étalon s'impose, qui peut être soit interne, soit externe; - un étalon externe composé soit d'un plasmide pour un micro-organisme à ADN, soit d'un ARN transcrit pour un micro-organisme à ARN, ne permet qu'une quantification relative, car le rapport d'amplification n'est pas nécessairement identique à celui de l'ADN ou de l'ARN du micro-organisme complet; - un étalon interne coamplifié fait de plus intervenir des longueurs ou des séquences différentes du plasmide ou du transcrit et a les mêmes inconvénients qu'un étalon externe utilisant un plasmide ou un transcrit.
Dans l'état de la technique actuelle, l'amplification de l8ADN d'un plasmide n'est pas vraiment proportionnelle à celle subie par l'ADN viral. Quant à l'étalon actuellement utilisé pour les virus à ARN, il s'agit d'un transcrit, qui a les mêmes inconvénients qu'un plamside et y ajoute la possibilité de dégradation d'ARN libre.
I1 y avait donc un besoin pour des tests de quantification et de détection de micro-organismes procurant des valeurs absolues du nombre de microorganismes cible.
On a maintenant trouvé que l'on peut quantifier ou détecter de façon absolue n'importe quel micro-organisme à
ADN ou à ARN, à la condition: (1) que l'on connaisse ou que l'on puisse déterminer par ailleurs une concentration étalon du micro-organisme ou la concentration de 1'ADN ou de 1'ARN porté par ce microorganisme, appelé micro-organisme étalon, et (2) que l'on compare la quantité du produit de la transcription réverse et/ou de l'amplification de l'ARN ou de l'ADN issu d'une concentration inconnue du microorganisme avec des quantités d'amplificat issues de l'ARN ou de 1'ADN de plusieurs concentrations connues du dit micro-organisme.
ADN ou à ARN, à la condition: (1) que l'on connaisse ou que l'on puisse déterminer par ailleurs une concentration étalon du micro-organisme ou la concentration de 1'ADN ou de 1'ARN porté par ce microorganisme, appelé micro-organisme étalon, et (2) que l'on compare la quantité du produit de la transcription réverse et/ou de l'amplification de l'ARN ou de l'ADN issu d'une concentration inconnue du microorganisme avec des quantités d'amplificat issues de l'ARN ou de 1'ADN de plusieurs concentrations connues du dit micro-organisme.
Un tel procédé constitue le premier objet de la présente invention.
Pour préparer des concentrations connues de microorganisme, on procède selon l'une quelconque des techniques connues de l'homme du métier, de préférence en centrifugeant et purifiant (à partir d'échantillons humains, animaux ou végétaux du milieu à tester, ou à partir de cultures cellulaires) des quantités quelconques du micro-organisme à doser, puis en extrayant 1'ADN ou 1'ARN de ces préparations centrifugées purifiées, par des moyens classiques. Les quantités à mettre en oeuvre dans la suite du procédé sont des quantités quelconques, qui doivent seulement être suffisantes pour que l'on obtienne finalement des quantités d'ADN ou d'ARN du micro-organisme étalon mesurables par les méthodes microbiologiques directes, n'utilisant pas l'amplification de type ACP et qui sont à la portée de l'homme du métier.Dans la pratique et compte tenu de la précision des matériels actuellement disponibles dans les laboratoires pour ces mesures, des quantités de l'ordre de plusieurs centaines de nanogrammes ou de quelques microgrammes conviennent.
Le procédé selon l'invention comporte avantageusement les étapes selon lesquelles: 1) on prélève et on purifie une quantité quelconque du micro-organisme à doser, à partir d'échantillons de prélèvement humains, animaux ou végétaux, ou à partir de cultures cellulaires, la quantité de micro-organisme étant avantageusement suffisante pour que les concentrations en
ADN ou ARN cible soient mesurables par des méthodes directes; 2) on extrait 1'ADN ou 1'ARN et on en mesure la quantité (exprimée en ng ou en Zg) recueillie; 3) on utilise par ailleurs le nombre de bases nucléotidiques du micro-organisme concerné, ce nombre étant connu, par exemple d'après des banques de données, ou déterminable par des méthodes classiques; 4) on calcule à partir de ce nombre de bases nucléotidiques la masse moléculaire totale de lgADN ou de 1'ARN du dit micro-organisme, en tenant compte de la masse moléculaire moyenne d'un nucléotide, elle aussi connue (environ 330 daltons); 5) on calcule ainsi, en utilisant le nombre d'Avogadro (soit 6,02 x 1023), la quantité d'ADN ou d'ARN portée par chaque micro-organisme; 6) on prépare et/ou utilise une gamme de concentrations de micro-organisme étalon obtenue à partir des dilutions successives du micro-organisme préalablement étalonné selon ses concentrations d'ADN ou d'ARN, pour former un étalon externe, dont on connaît ainsi pour chaque dilution (a) la concentration d'ADN ou d'ARN et (b) la concentration en micro-organismes; 7) on extrait parallèlement 1'ADN ou l'ARN des microorganismes étalon et cible et on soumet les extraits en parallèle à une rétrotranscription et/ou à au moins une amplification, de préférence à au moins une amplification en chaîne par polymérase, ACP ou TR-ACP, et on enregistre les valeurs obtenues; et 8) on compare les produits d'ACP ou TR-ACP des microorganismes cibles avec ceux de l'étalon externe, de façon à en déduire les valeurs de concentration en ADN ou ARN ou en micro-organisme total dans chaque échantillon de microorganisme cible.
ADN ou ARN cible soient mesurables par des méthodes directes; 2) on extrait 1'ADN ou 1'ARN et on en mesure la quantité (exprimée en ng ou en Zg) recueillie; 3) on utilise par ailleurs le nombre de bases nucléotidiques du micro-organisme concerné, ce nombre étant connu, par exemple d'après des banques de données, ou déterminable par des méthodes classiques; 4) on calcule à partir de ce nombre de bases nucléotidiques la masse moléculaire totale de lgADN ou de 1'ARN du dit micro-organisme, en tenant compte de la masse moléculaire moyenne d'un nucléotide, elle aussi connue (environ 330 daltons); 5) on calcule ainsi, en utilisant le nombre d'Avogadro (soit 6,02 x 1023), la quantité d'ADN ou d'ARN portée par chaque micro-organisme; 6) on prépare et/ou utilise une gamme de concentrations de micro-organisme étalon obtenue à partir des dilutions successives du micro-organisme préalablement étalonné selon ses concentrations d'ADN ou d'ARN, pour former un étalon externe, dont on connaît ainsi pour chaque dilution (a) la concentration d'ADN ou d'ARN et (b) la concentration en micro-organismes; 7) on extrait parallèlement 1'ADN ou l'ARN des microorganismes étalon et cible et on soumet les extraits en parallèle à une rétrotranscription et/ou à au moins une amplification, de préférence à au moins une amplification en chaîne par polymérase, ACP ou TR-ACP, et on enregistre les valeurs obtenues; et 8) on compare les produits d'ACP ou TR-ACP des microorganismes cibles avec ceux de l'étalon externe, de façon à en déduire les valeurs de concentration en ADN ou ARN ou en micro-organisme total dans chaque échantillon de microorganisme cible.
A titre d'exemples de sources bibliographiques dans lesquelles on peut trouver des indications ou les références de banques de données concernant le nombre de bases nucléotidiques des micro-organismes, on peut citer:
Virus Res. 23, 39-53 (1992); Gene 81, 275-284 (1989);
Virology 177, 305-311 (1990) et J. Gen. Virol. 69, 25752583 (1988).
Virus Res. 23, 39-53 (1992); Gene 81, 275-284 (1989);
Virology 177, 305-311 (1990) et J. Gen. Virol. 69, 25752583 (1988).
Selon une variante avantageuse pouvant être mise en oeuvre si les micro-organismes sont assez gros pour pouvoir être détectés et comptés directement, notamment par des moyens optiques et/ou électroniques, les étapes 2) à 5) susdites du procédé selon l'invention sont remplacées par la simple mesure directe du nombre de microorganismes.
En variante, on peut remplacer dans le procédé selon l'invention la préparation de concentrations connues de micro-organisme par la préparation de concentrations connues: du même micro-organisme inactivé, dont 1'ADN ou 1'ARN demeure apte à la rétrotranscription et/ou à l'amplification de façon identique à l'ADN ou 1'ARN du virus natif, d'une séquence nucléotidique complète, extraite du même micro-organisme, ou d'une séquence nucléotidique complète, fabriquée par synthèse.
Selon une variante particulièrement avantageuse du procédé selon l'invention, on prépare et on stocke jusqu'à leur mise à la disposition de l'utilisateur des préparations de concentrations connues étalonnées du micro-organisme complet à ADN ou à ARN du type à quantifier ou à détecter, ou des préparations de concentrations d'ADN ou d'ARN du génome du dit microorganisme correspondant à des concentrations connues de ce micro-organisme.
Une quantification moléculaire et une détection selon l'invention présentent un intérêt marqué aussi bien pour de petits micro-organismes que pour de plus gros microorganismes, mais en faible concentration ou dont les techniques empiriques traditionnelles d'évaluation ne sont plus systématiquement maîtrisées dans les pays développés.
L'invention a également pour objet un kit ou ensemble de moyens pour la quantification et la détection de microorganismes à ADN ou à ARN, comprenant essentiellement, dans des récipients appropriés et/ou sous la forme de dispositifs appropriés: - une série de concentrations connues étalonnées du microorganisme complet à ADN ou à ARN du type à quantifier ou à détecter, ou de concentrations d'ADN ou d'ARN correspondant à des concentrations connues du dit microorganisme, - des moyens d'extraction et de rétrotranscription et/ou d'amplification, notamment par ACP ou TR-ACP, de 1'ADN ou de 1'ARN du micro-organisme cible et étalon, - des moyens pour l'analyse des produits d'ACP ou de TR
ACP.
ACP.
I1 convient de noter que les moyens d'analyse des produits d'ACP ou de TR-ACP peuvent consister en des moyens extérieurs au kit et destinés à être utilisés en combinaison avec celui-ci. Ces moyens peuvent par exemple comprendre des dispositifs et/ou des produits pour la détermination par életrophorèse, par colorométrie, par radiométrie ou par tout autre moyen analytique approprié.
Le procédé et les moyens susdits procurent de manière originale une quantification absolue des micro-organismes à ADN ou à ARN, car le micro-organisme cible ou son génome à doser, est identique au micro-organisme étalon ou son génome traité en parallèle. De plus, ce procédé et ces moyens se sont avérés procurer une technique universelle de quantification et d'identification, car ils permettent la quantification de tous les micro-organismes.
En dehors même des préocupations de quantification, le procédé et les moyens selon l'invention peuvent être employés pour une détection de la quantité minimale de micro-organisme mesurable avec les méthodes actuelles de transcription réverse et/ou d'amplification des microorganismes à ARN ou à ADN. En pratique, la quantité minimale mesurable est de l'ordre de un à cinq microorganismes pour les micro-organismes à ADN, tandis qu'elle est de l'ordre de 10 à 100 micro-organismes pour les micro-organismes à ARN.
L'invention est décrite plus concrètement ci-après en référence aux dessins annexés, qui ne la limitent aucunement et dans lesquels: - Fig. 1 représente graphiquement la variation de la
sensibilité de détection et de l'efficacité
d'amplification de différentes expériences d'ACP
effectuées avec plusieurs concentrations différentes
d'ADN étalon du même virus; - Fig. 2 représente graphiquement la variation de la
sensibilité de détection et de l'efficacité
d'amplification de différentes expériences de TR-ACP
effectuées avec plusieurs concentrations d'ARN du
même virus; - Fig. 3 représente graphiquement la variation de
l'efficacité d'amplification dans des expériences
d'ACP effectuées avec plusieurs concentrations d'ADN
issues de préparations de virus provenant de
différents patients, au sein de la même expérience;; - Fig. 4 représente graphiquement la variation de
l'efficacité d'amplification dans des expériences
d'ACP effectuées respectivement avec plusieurs
concentrations d'ADN isues de plusieurs préparations
du même virus et avec plusieurs concentrations d'ADN
issues de deux plasmides différents; - Fig. 5 représente graphiquement la variation de
l'efficacité d'amplification dans des expériences de
RT-ACP effectuées avec plusieurs concentrations d'ARN
issues de préparations de virus provenant de
différents patients; - Fig. 6 représente graphiquement la variation de
l'efficacité d'amplification dans des expériences de
RT-ACP effectuées respectivement avec plusieurs
concentrations d'ARN issues de préparations de virus
provenant de différents patients et avec deux ARN de
transcrits différents.
sensibilité de détection et de l'efficacité
d'amplification de différentes expériences d'ACP
effectuées avec plusieurs concentrations différentes
d'ADN étalon du même virus; - Fig. 2 représente graphiquement la variation de la
sensibilité de détection et de l'efficacité
d'amplification de différentes expériences de TR-ACP
effectuées avec plusieurs concentrations d'ARN du
même virus; - Fig. 3 représente graphiquement la variation de
l'efficacité d'amplification dans des expériences
d'ACP effectuées avec plusieurs concentrations d'ADN
issues de préparations de virus provenant de
différents patients, au sein de la même expérience;; - Fig. 4 représente graphiquement la variation de
l'efficacité d'amplification dans des expériences
d'ACP effectuées respectivement avec plusieurs
concentrations d'ADN isues de plusieurs préparations
du même virus et avec plusieurs concentrations d'ADN
issues de deux plasmides différents; - Fig. 5 représente graphiquement la variation de
l'efficacité d'amplification dans des expériences de
RT-ACP effectuées avec plusieurs concentrations d'ARN
issues de préparations de virus provenant de
différents patients; - Fig. 6 représente graphiquement la variation de
l'efficacité d'amplification dans des expériences de
RT-ACP effectuées respectivement avec plusieurs
concentrations d'ARN issues de préparations de virus
provenant de différents patients et avec deux ARN de
transcrits différents.
Ainsi, à titre indicatif, on a concentré, purifié et extrait 1'ARN de VIH issu d'une culture de façon à en obtenir 300 ng; sachant que le nombre total de nucléotides du VIH est de 19000 et que la masse moléculaire d'un nucléotide est de 330 daltons, on en a déduit que la masse moléculaire globale d'un ARN de VIH est de 6.300.000 daltons. On a alors obtenu, par un calcul utilisant le nombre d'Avogadro, le nombre exact de génomes viraux et donc de virus d'où émane la quantité de 300 ng d'ARN, soit approximativement 3x1010 virus. Connaissant la concentration de virus d'une partie aliquote de la préparation virale purifiée, on peut alors préparer une gamme étalon de ce virus et l'utiliser dans le procédé selon la présente invention.
Le procédé selon l'invention permet une identification fiable et/ou une quantification absolue, car le micro-organisme cible (à doser) est identique au micro-organisme étalon. La méthode que ce procédé met en oeuvre est en outre universelle, car elle permet la quantification de tous les micro-organismes dont la quantité est mesurable parallèlement.
Ce procédé et le kit pour sa mise en oeuvre peuvent être utilisés non seulement pour la quantification des micro-organismes dans tous milieux ou spécimens, mais également pour la détection de la quantité minimale de micro-organisme mesurable avec les méthodes actuelles de transcription réverse et/ou d'amplification des microorganismes à ARN ou à ADN.
Pour les micro-organismes à ADN la quantité minimale mesurable est de l'ordre de 1 à 5 micro-organismes, tandis qu'elle est d'environ 10 à 100 micro-organismes pour ceux à ARN.
La présente invention apporte un progrès décisif aux moyens et aux méthodes de dosage quantitatif de microorganismes in vitro en procurant un moyen et une technique simples et efficaces pour la standardisation des dosages.
L'invention est décrite plus en détails dans les exemples ci-après, qui ne la limitent aucunement et dans lesquels les proportions et les pourcentages sont en poids/poids, sauf indication contraire.
Exemple 1: Démonstration de l'intérêt d'un étalon universel pour la détection et la quantification d'ADN cible par ACP (en anglais PCR).
On a étudié la variation de la sensibilité de détection et de l'efficacité d'amplification de lACP sur 1'ADN issu de différentes concentrations du même VHB. Les plasmas ont été obtenus à partir de porteurs de VHB chroniques par plasmaphérèse avec des titres en HBsAg élevés. Du virion à ADN de VHB a été purifié par centrifugation (pendant une nuit à 25.000 tours/min et à 40C dans une centrifugeuse Spinco 25) à travers un lit à 30 % (en poids/volume) de saccharose dans du milieu TEBM (Tris-HCl 0,01 M, pH 7,6, NaEDTA 0,001 M, 1 % d'albumine sérique bovine et 0,3 % de 2-mercapto-éthanol). La pureté des virions de VHB fractionnés a été suivie par microscopie électronique. L'ADN associé aux virions a été extrait par l'intermédiaire d'un kit de purification d'ADN du commerce. L'ADN viral obtenu a été quantifié par spectrophotométrie. Le nombre de copies d'ADN viral a été calculé au moyen de la masse moléculaire du génome viral de 1'ADN de VHB. En variante le nombre de virions peut également être quantifié par microscopie électronique. Des dilutions en série (10, 100, 1000, 10.000 copies) de l'ADN de VHB ont été soumises à une succession de cycles d'ACP identiques (940C pendant 60 s, 560C pendant 60 s et 720C pendant 90 s), avec 100 pmol de paires d'amorce de VHB spécifiques pour le gène C: (GCTTTGGGGCATGGACATTGCC/
GACTACTAGATCCCTGGATGCTGG). Les produits d'ACP spécifiques ont été analysés par une hybridation dot-blot avec une sonde marquée à l'extrémité par y~ 32 P (TCAGCTCTGTATCGAGAAGCC) et les comptages par minute (cpm) de chaque signal d'ACP ont été relevés par l'intermédiaire d'un compteur de rayonnement bêta.
GACTACTAGATCCCTGGATGCTGG). Les produits d'ACP spécifiques ont été analysés par une hybridation dot-blot avec une sonde marquée à l'extrémité par y~ 32 P (TCAGCTCTGTATCGAGAAGCC) et les comptages par minute (cpm) de chaque signal d'ACP ont été relevés par l'intermédiaire d'un compteur de rayonnement bêta.
Les résultats ont été enregistrés et reportés sous forme graphique sur la figure 1. I1 apparaît clairement que l'étalon donnerait des résultats différents et doit donc être mis en oeuvre dans chaque expérience en parallèle avec l'échantillon cible.
Ainsi, pour chaque input d'ADN de matrice constante (nombre de copies), il existe d'après les courbes de la figure 1 un large intervalle de concentrations de produit d'ACP d'une expérience à l'autre.
Exemple 2: Démonstration de l'intérêt d'un étalon universel pour la détection et la quantification d'ARN cible par TR-ACP (en anglais RT-PCR).
On a étudié la variation de la sensibilité de détection et de l'efficacité de la transcription réverse/amplification de 1'ACP sur 1'ARN issu de différentes concentrations du même VIH-1. Du virion à ARN de VIH-1 a été purifié par passage du surnageant de culture de blastes de cellules mononuclées du sang infectés par un isolat primaire sur une colonne de sépharose. La pureté des virions de VIH-1 fractionnés a été suivie par microscopie électronique. L'ARN associé aux virions a été extrait par l'intermédiaire d'un kit d'isolation d'ARN du commerce. L'ARN viral obtenu a été quantifié par spectrophotométrie. Le nombre de copies d'ARN viral a été calculé au moyen de la masse moléculaire du génome viral de l'ARN de VIH-1.Après addition de 1 microgramme d'ARNt, des dilutions en série (1.000.000, 100.000, 10.000, 1000 copies) de l'échantillon d'ARN ont été pastillées et remises en suspension dans 10 pl. Une partie aliquote de 10 pl d'ARN et 1 zg d'ARNt de référence (exempt de VIH) ont été ajoutés immédiatement à chacun des mélanges réactionnels (90 Rl) de TR-ACP contenant 10 unités de transcriptase réverse de virus de leucémie murine de Moloney recombinant et 3 unités d'ADN polymérase ampliTaq pour l'amplification du gène gag du VIH.La TR
ACP a été mise en oeuvre pendant 25 minutes à 420C, puis pendant 5 min à 940C et ensuite sur 40 cycles (940C peandnt 60 s, 560C pendant 60 s et 720C pendant 90 s) d'ACP utilisant 100 pmol de chacune des paires d'amorce de
VIH spécifiques du gène gag (GGAACATCAAGCAGCCATGC/
TCCTTTGGTCCTTGTCTTATGTC). Les produits d'ACP spécifiques ont été analysés par hybridation par dot-blot avec une sonde marquée à l'extrémité par y-32P (ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC) et les comptages par minute (cpm) de chaque signal d'ACP ont été relevés par l'intermédiaire d'un compteur de rayonnement bêta.
ACP a été mise en oeuvre pendant 25 minutes à 420C, puis pendant 5 min à 940C et ensuite sur 40 cycles (940C peandnt 60 s, 560C pendant 60 s et 720C pendant 90 s) d'ACP utilisant 100 pmol de chacune des paires d'amorce de
VIH spécifiques du gène gag (GGAACATCAAGCAGCCATGC/
TCCTTTGGTCCTTGTCTTATGTC). Les produits d'ACP spécifiques ont été analysés par hybridation par dot-blot avec une sonde marquée à l'extrémité par y-32P (ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC) et les comptages par minute (cpm) de chaque signal d'ACP ont été relevés par l'intermédiaire d'un compteur de rayonnement bêta.
Les résultats ont été enregistrés et reportés sous forme graphique sur la figure 2. Il apparaît que la variabilité des résultats est très importante d'une expérience à l'autre. Là encore, il apparaît clairement que l'étalon donnerait des résultats différents et doit donc être mis en oeuvre dans chaque expérience en parallèle avec l'échantillon cible.
Ainsi, pour chaque input d'ARN constant (nombre de copies), il existe d'après les courbes de la figure 2 un large intervalle de concentrations de produit d'ACP d'une expérience à l'autre.
Exemple 3: Validation d'un étalon d'ADN de virion.
Cet exemple illustre l'identité d'efficacité de l'amplification par des cycles d'ACP identiques d'ADN de virion de VHB natif provenant de sérums de différents patients infectés par VHB. Des dilutions en série d'échantillons de différents ADN de virion de VHB préparés comme indiqué dans l'exemple 1 ont été soumises à un même nombre de cycles d'ACP dans la même expérience. Le produit d'ACP (output) a été quantifié par dot blot et comptage de cpm.
Les résultats reportés sous forme graphique sur la figure 3 montrent que l'efficacité d'amplification par ACP est identique quelle que soit la source du virion VIH (ici pour quatre sources différentes).
Exemple 4: Validation d'un étalon d'ADN de virion.
En procédant comme indiqué dans l'exemple 3, mais en mettant en oeuvre à chaque fois dans les mêmes cycles d'ACP un ADN de virion natif et des ADN issus de deux plasmides VHB (input), on a pu établir les efficacités comparées de l'amplification par ACP (voir figure 4).
Des fragments d'ADN de la séquence de gène C de VHB ont été produits par ACP à partir de sérums de HBVsAg+ et ligaturés dans des plasmides pGEM-3Z (Promega) et pCTt (Invitrogen) (respectivement plasmide ADN1 et ADN2 de
VHB). Tous les construits ont été confirmés par séquençage d'ADN au moyen d'un kit commercial approprié.
VHB). Tous les construits ont été confirmés par séquençage d'ADN au moyen d'un kit commercial approprié.
Les résultats reportés sous forme graphique sur la figure 4 montrent qu'un nombre connu de copies peut avoir ou non une efficacité d'amplification comparable à celle d'un nombre de copies identique d'ADN viral natif issu de plusieurs échantillons.
I1 ressort ainsi des exemples 3 et 4 que des concentrations connues d'ADN de virion VHB de différentes provenances constituent un étalon universel idéal, alors que des fragments d'ADN viral intégrés dans des plasmides différents ont des comportements différents entre eux et différents des ADN natifs.
Exemple 5: Validation d'un étalon d'ARN de virion.
Cet exemple illustre l'identité d'efficacité de l'amplification par des cycles de TR-ACP identiques d'ARN de virion de VIH natif provenant de sérums de différents patients infectés par du VIH. Des dilutions en série d'échantillons de différents ARN de virion de VIH préparés comme indiqué dans l'exemple 2 ont été soumises à un cycle de TR-ACP dans la même expérience. Le produit d'ACP (output) a été quantifié par dot blot et comptage de cpm.
Les résultats reportés sous forme graphique sur la figure 5 montrent que l'efficacité d'amplification par TR
ACP est identique quelle que soit la source du virion VIH.
ACP est identique quelle que soit la source du virion VIH.
Exemple 6: Validation d'un étalon d'ARN de virion.
En procédant comme indiqué dans l'exemple 5, mais en mettant en oeuvre à chaque fois dans les mêmes cycles de
TR-ACP un ARN de virion natif et un ARN de transcrit avec un nombre connu de copies (input), on a pu établir les efficacités comparées de l'amplification par TR-ACP (voir figure 6).
TR-ACP un ARN de virion natif et un ARN de transcrit avec un nombre connu de copies (input), on a pu établir les efficacités comparées de l'amplification par TR-ACP (voir figure 6).
Des fragments d'ARN de séquence gag de VIH-1 ont été produits par transcription de matrices d'ADN de VIH-1 (respectivement plasmide pBR322 d'ADN de VIH-Z6 et plasmide pBH10-R3 d'ADN de VIHIIIB) avec de lARN polymérase de T7 (respectivement transcrits ARN1 et ARN2 de VIH).
Les résultats reportés sous forme graphique sur la figure 6 montrent qu'un ARN de transcrit ayant un nombre connu de copies a une efficacité d'amplification par TR
ACP différente de celle d'un ARN d'échantillon.
ACP différente de celle d'un ARN d'échantillon.
Il ressort ainsi des exemples 5 et 6 que des concentrations connues d'ARN de virion VIH de différentes provenances constituent un étalon universel idéal, alors que des fragments d'ARN viral intégrés dans des plasmides différents ont des comportements différents entre eux et différents des ARN natifs.
En conclusion: - l'utilisation selon l'invention d'ADN de virion comme étalon externe est de loin plus précise et commode que celle d'un ADN de plasmide servant d'étalon externe ou interne pour le suivi de l'efficacité de l'amplification dans un essai d'ACP quantitative; - l'utilisation selon l'invention d'ARN de virion comme étalon externe est de loin plus précise et commode que celle d'un ARN de transcrit servant d'étalon externe ou interne pour le suivi de l'efficacité de l'amplification dans un essai de TR-ACP quantitative.
Claims (8)
1. Procédé pour la quantification et la détection de n'importe quel micro-organisme à ADN ou à ARN, caractérisé en ce qu'il comprend: (1) l'utilisation ou la détermination d'une concentration étalon du micro-organisme ou de la concentration de 1'ADN ou de 1'ARN porté par ce micro-organisme, appelé microorganisme étalon, et (2) la comparaison de la quantité du produit de la transcription réverse et/ou de l'amplification de 1'ARN ou de 1'ADN issu d'une concentration inconnue du microorganisme avec des quantités d'amplificat issues de 1'ARN ou de 1'ADN de concentrations connues du dit microorganisme.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes selon lesquelles: 1) on prélève et on purifie une quantité quelconque du micro-organisme à doser, à partir d'échantillons de prélèvement humains, animaux ou végétaux, ou à partir de cultures cellulaires, la quantité de micro-organisme étant suffisante pour que les concentrations en ADN ou ARN cible soient mesurables par des méthodes directes; 2) on extrait 1'ADN ou l'ARN et on en mesure la quantité recueillie; 3) on utilise par ailleurs le nombre de bases nucléotidiques du micro-organisme concerné; 4) on calcule à partir de ce nombre de bases nucléotidiques la masse moléculaire totale de 1'ADN ou de 1'ARN du dit micro-organisme, en tenant compte de la masse moléculaire moyenne d'un nucléotide, elle aussi connue; 5) on calcule ainsi, en utilisant le nombre d'Avogadro, la quantité d'ADN ou d'ARN portée par chaque micro-organisme; 6) on prépare et/ou utilise une gamme de concentrations de micro-organisme étalon obtenue à partir des dilutions successives du micro-organisme préalablement étalonné selon ses concentrations d'ADN ou d'ARN, pour former un étalon externe, dont on connaît ainsi pour chaque dilution (a) la concentration d'ADN ou d'ARN et (b) la concentration en micro-organismes; 7) on extrait 1'ADN ou 1'ARN des micro-organismes étalon et cible et on soumet les extraits en parallèle à une rétrotranscription et/ou à au moins une amplification, de préférence à au moins une amplification en chaîne par polymérase, ACP ou TR-ACP, et on enregistre les valeurs obtenues; et 8) on compare les produits d'ACP ou TR-ACP des microorganismes cibles avec ceux de l'étalon externe, de façon à en déduire les valeurs de concentration en ADN ou ARN ou en micro-organisme total dans chaque échantillon de microorganisme cible.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les étapes 2) à 5) sont remplacées par la simple mesure directe du nombre de micro-organismes.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on remplace la préparation de concentrations connues de micro-organisme par la préparation de concentrations connues: du même micro-organisme inactivé, dont 1'ADN ou 1'ARN demeure apte à la rétrotranscription et/ou à l'amplification de façon identique à 1'ADN ou 1'ARN du virus natif, d'une séquence nucléotidique complète, extraite du même micro-organisme, ou d'une séquence nucléotidique complète, fabriquée par synthèse.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on prépare et on stocke jusqu'à leur mise à la disposition de l'utilisateur des préparations de concentrations connues étalonnées du micro-organisme complet à ADN ou à ARN du type à quantifier ou à détecter, ou des préparations de concentrations d'ADN ou d'ARN du génome du dit microorganisme correspondant à des concentrations connues de ce micro-organisme.
6. Kit ou ensemble de moyens pour la quantification et la détection de micro-organismes à ADN ou à ARN, comprenant essentiellement, dans des récipients appropriés et/ou sous la forme de dispositifs appropriés: - une série de concentrations connues étalonnées du microorganisme complet à ADN ou à ADN du type à quantifier ou à détecter, ou de concentrations d'ADN ou d'ARN correspondant à des concentrations connues du dit microorganisme, - des moyens d'extraction et de rétrotranscription et/ou d'amplification, notamment par ACP ou TR-ACP, de 1'ADN ou de 1'ARN du micro-organisme cible et étalon, - des moyens pour l'analyse des produits d'ACP ou de TR
ACP.
7. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la quantification des microorganismes dans tous les milieux ou spécimens ou pour la détection de la quantité minimale mesurable ou d'une quantité supérieure de micro-organisme.
8. Utilisation d'un kit ou ensemble selon la revendication 6 pour la quantification des microorganismes dans tous les milieux ou spécimens ou pour la détection de la quantité minimale mesurable ou d'une quantité supérieure de micro-organisme.
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