JP2000500007A - 微生物の定量化と検出のための方法とキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明による方法において、外部標準として、当該微生物またはこの微生物のＤＮＡまたはＲＮＡの所与の量を使用し、抽出、特定の方法または前記微生物のゲノムの一部分の逆転写による顕色、および／または増幅の後、標準および対象微生物のＤＮＡまたはＲＮＡ濃度、あるいは対象微生物の増幅生成物を外部標準のそれらと比較し、対象微生物のそれぞれの標本内のＤＮＡまたはＲＮＡの濃度の値または総微生物濃度を演繹する。全ての微生物の定量化および検出への応用。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物の定量化と検出のための方法とキット 本発明は微生物の定量化と検出に関するものである。もっと具体的にはＤＮＡ またはＲＮＡゲノムを有する微生物の定量的決定および／または検出に関するも のである。 本発明はヒト、動物または植物に影響するＤＮＡまたはＲＮＡゲノムの担体で あるウィルス、バクテリア、細菌、原生動物、住血原虫などの周知の全ての微生 物ならびに、病原性または通常の状態で、ヒト、動物または植物の中に存在する ような微生物に適用される。さらにヒトを含む動物ならびに植物からの生成物の 中の当該微生物、ならびに水中に存在する可能性のあるものの定量化と検出にも 適用される。 本発明による方法はＲＮＡにおけるヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）による 感染、およびヒトＤＮＡにおけるＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）による感染の定量 化について後で説明される。 ヒト、動物および植物の疫学研究、処置と予防は今日ヒトの医学、獣医学およ び農学または植物衛生学の優先課題になっている。組織、生物流体、および試験 管内調節物などの媒体内の微生物の識別と定量化はかかるプロジェクトを進める 上で不可欠な過程である。ウィルスを始めとする大半の微生物のサイズと、生物 媒体内の濃度（一般的に１ml内の微生物は１０¹から１０¹²程度）を考慮に入れ て、ゲノム断片の増幅を用いる現在の技術的ツールだけが分子の識別と定量的評 価を同時に可能にする。現在一番多く用いられているゲノム増幅法はポリメラー ゼによる連鎖増幅またはＰＣＲと命名されている（英語ではpolymerase chain r eactionまたはＰＣＲ）。酵素、ポリメラーゼのおかげで、ＤＮＡゲノム断片の 増幅が可能になる。同様に、逆転写酵素とポリメラーゼの対または２つの機能を 果たす一つの酵素によってＲＮＡからＤＮＡへの逆転写と増幅を実現することが できる。いったん増幅されると、このゲノム断片または増幅体は様々な方法（放 射性または染色プローブ、断片サイズ）によって具体的に識別される。 ＰＣＲによるＨＩＶの定量化法は例えば次の文献に記載されている：Holodniy M．et al.，J．Infect．Dis．163，862-866(1991); Aoki-Sei S．et al.，J．AI DS Res．Hum．Retrovirus 8，1263-1270(1992); Bagnarelli P．et al.，J．Vir ol.66，7328-7335(1992); Piatak Jr.M.et al.，Science 259，1749-1755(1993) ; Bruisten S.M．et al.，AIDS 7(suppl．2)，S15-S20(1993)。 Ｃ型肝炎ウィルスのＲＮＡ定量化法は例えば、下記の文献に記載されている： Kumar U．et al.，J．Virol．Methods 47(1-2)，95-102(1994); Manzin A．et a l.，J．Clin．Microbiol．32(8)，1939-44(1994); Ravaggi A．et al.，J．Clin ．Microbiol．33(2)，265-9(1995); Young K.K．et al.，J．Clin．Micorbiol． 33(3)，654-7(1995)。 Ｂ型肝炎ウィルスのＤＮＡ定量化法は例えば、下記の文献に記載されている： Lehtovaara P.et al.,PCR Methods Appl．3(3)，169-75(1993); Wu J．et al.， J．Virol．Methods 49(3)，331-41(1994); Zaaijer H.L．et al.，J．Clin．Mic robiol．32(9)，2088-91(1994); Kaneko S．et al.，J．Clin．Microbiol．27(9 )，1930-33(1989)。 しかしながら、増幅された製品と当初のＤＮＡまたはＲＮＡの間の関係は実験 ごとに本当には一定ではなく、そのため濃度が別途確認されている標準の測定の 問題に関心を持つ必要がある。 ＰＣＲの増幅能力は今日まで、定量されるゲノムを一定の個数でしか持たない 細胞またはそれぞれ単一の遺伝子断片を含むプラスミドによって評価することが できた。それによってたった一つの遺伝子断片でさえも、ＰＣＲによって、具体 的に識別できることが確立できた。さらに増幅にかけられたプラスミドのＤＮＡ 濃度と増幅の後に測定されたＤＮＡの濃度の間に比例関係があることも確定され た。しかしながらこの比例関係は実験ごとに変動することがわかった、なぜなら ＰＣＲによる増幅は、ポリメラーゼの作用から生じる生物学的プロセスであり、 純粋に物理学的な技術のようには完全に制御できないからである。 そのためにバイオテクノロジー企業の研究者や技師はウィルス定量化実験ごと に検定を導入するようになった。現在まで標準は、増幅されるそのＤＮＡ断片が 同じプライマーを有する標準プラスミドの一連の濃縮物（一般的に３から５）で 構成され、部分的に異なる配列または同一の配列の技術によるものである。同一 プライマーであるが、長さ、したがって配列が異なる２つのプラスミドの等しい 濃縮物のＤＮＡの増幅比は：１）毎回異なることがあり、２）同じ実験内の自生 ウィルスの同一濃縮物から発生したＤＮＡのそれと必ずしも同一ではない。 例えば、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ）のそれなどの、ＲＮＡウィルスを定量化または識 別しようとする場合には問題は一層複雑になる。実際、ＰＣＲによる増幅段階は 、ＲＮＡウィルスの場合、別の酵素、逆転写酵素（ＲＴと略す）によって、ある いは２つの作用（ＤＮＡの逆転写と増幅）を有する一つの酵素によって多く実現 される逆転写段階と組み合わされなければならない。いずれの場合にも、現在市 場で入手できる酵素は実験ごとに１０：１（すなわちＲＮＡの１０のコピーから ＤＮＡの１つのコピーが与えられる）から１００：１（ＲＮＡの１００のコピー からＤＮＡの１つのコピーが与えられる）の間で変動することのある逆転写比を 得ることができる。そこから生じる問題、すなわち連続する実験結果の比較が不 可能であることは、同じプライマーを使用するが、その増幅部分が外部標準を用 いた場合には同一であり、共増幅でそれを用いた場合には配列すなわち長さが異 なる標準ＲＮＡ断片（標準転写）の一連の濃縮物を同時に培養してこれまで解決 され、この場合転写体は定量化対象微生物のＲＮＡと同じ試験管内で培養される 。 残念なことに、２つの転写体の同じ濃縮物から出た増幅体の濃縮物は異なるこ とがあり、さらにはウィルスの同一濃縮物に由来するＲＮＡから得られたものと 異なることさえある。 結論として、 ・既知の逆転写および／または増幅技術は同じ標本について実験ごとに同一の結 果が得られない、 ・標準は、内部、または外部のものとすることができる、 ・ＤＮＡ型微生物についてはプラスミドから成り、ＲＮＡ型微生物についてはＲ ＮＡ転写産物から成る外部標本は相対的定量化しかできない、なぜなら増幅比が 完全な微生物のＤＮＡまたはＲＮＡのそれとは必ずしも同一ではないからだ、 ・共増幅した内部標準はさらにプラスミドまたは転写産物の異なる長さまたは配 列を生じさせ、さらにはプラスミドまたは転写産物を用いる外部標準と同じ不便 がある。 現状技術において、プラスミドのＤＮＡの増幅はウィルスのＤＮＡが受ける増 幅に正確に比例はしない。ＲＮＡウィルスに対して現在使用される標準は転写産 物であり、プラスミドと同じ不便があり、さらに遊離ＲＮＡを劣化させるおそれ もある。 したがって、対象微生物の絶対数が得られるような微生物の定量化と検出の試 験の必要があった。 ところが以下の条件の下に任意のＤＮＡまたはＲＮＡ微生物を絶対的かつ直接 的に定量化または検出できることがわかった： （１）微生物の標準濃度または、標準微生物と呼ばれるこの微生物が有するＤＮ ＡまたはＲＮＡの濃度がわかっているか、別途求めることができる、さらに （２）微生物の未知の濃縮物から得られたＤＮＡまたはＲＮＡの逆転写および／ または増幅生成物の量を前記微生物のいくつかの既知の濃縮物のＲＮＡまたはＤ ＮＡから得られた増幅生成物の量と比較する。 このような方法が本発明の第一の目的である。 この方法の変型によれば、過程（２）は標準の濃縮物と好適には分岐ＤＮＡと 呼ばれる方法または標準または対象微生物のＤＮＡまたはＲＮＡを増幅しない他 のいっさいの顕色方法（revealing method）によって検出されるような対象微生 物の濃縮物との比較に基づく顕色で主として構成することができる。 微生物の既知の濃縮物を調製するために、当業者には周知の技術のいずれか一 つによって、定量する微生物の任意の量を好適には遠心分離または（試験される 媒体のヒト、動物または植物の標本から、または細胞培養から）精製し、ついで 、通常の方法によって、この精製された遠心分離調製品からＤＮＡまたはＲＮＡ を抽出する。その後のプロセスに使用する量は任意であるが、ただＰＣＲ型の増 幅によらない、当業者が利用しやすい、直接微生物学法によって測定可能な標準 微 生物のＤＮＡまたはＲＮＡの量が最終的に得られるのに十分な量でなければなら ない。実際には、この種の測定のために実験室で現在利用可能な機器の精度を考 慮に入れて、数百ナノグラムまたは数マイクログラム程度が適切である。 本発明による方法は有利には次の過程を含む： １）ヒト、動物または植物の採取標本から、または細胞培養から、定量する微生 物の任意の量を採取し、精製する、ここで微生物の量は有利には対象ＤＮＡまた はＲＮＡの濃度が直接法によって測定できるのに十分な量とする、 ２）ＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、その採取量（単位ｎｇまたはμｇ）を測定す る、 ３）他方で当該微生物のヌクレオチド基の数を用いる、この数は例えば、データ バンクによって知られているか、従来の方法で求めることができる、 ４）このヌクレオチド基の数から、同じく既知の（およそ３３０ダルトン）ヌク レオチドの平均分子量を考慮して、前記微生物のＤＮＡまたはＲＮＡの合計分子 量を計算する、 ５）このようにしてアボガドロ数（すなわち６．０２×１０²³）を用いて、それ ぞれの微生物が有するＤＮＡまたはＲＮＡの量を計算する、 ６）それぞれの希釈について（ａ）ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度と（ｂ）微生物の 濃度がわかっている、外部標準を形成するために、そのＤＮＡまたはＲＮＡ濃縮 物に応じてあらかじめ検定された微生物の連続する希釈から得られた標準微生物 濃度範囲を調整および／または使用する、 ７）標準および対象微生物のＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、分岐ＤＮＡと呼ばれ る方法、または標準または対象微生物のＤＮＡまたはＲＮＡを増幅しない他のい っさいの顕色方法による顕色および／または逆転写および／または少なくとも一 回の増幅に並行してかけられ、得られた値を記録する、そして ８）標準および対象微生物のＤＮＡまたはＲＮＡの濃度、あるいは対象微生物の 増幅生成物と外部標準のそれを比較して、そこから対象微生物のそれぞれの標本 の中のＤＮＡまたはＲＮＡまたは総微生物の濃度の値を演繹する。 微生物のヌクレオチド基の数に関するデータバンクの表示や参照を見つけるこ とのできる文献の例として、Virus Res．23，39-53(1992); Gene 81，275-284(1 989); Virology 177，305-311(1990)，J．Gen．Virol．69，2575-2583(1988)を 挙げることができる。 光学的手段および／または電子的手段などによって、直接検出または数えるこ とができるほど微生物が大きい場合に実施することができる有利な変型によれば 、本発明による方法の上記の過程２）から５）は微生物数の単純な直接測定に代 えられる。 好適実施態様によれば、本発明による方法は、好適には異種プラスミドのＤＮ Ａまたは異種転写産物のＲＮＡの形の、配列やプライマーが対象ＤＮＡまたはＲ ＮＡとは無関係な、内部対照添加を随意に含むことができる。前記内部対照は有 利には検査される標本のそれぞれに添加され、内部対照の役割（以下”ＩＣ”と 略す）を果たす、すなわち増幅効果、または逆転写（以下”ＲＴ”）に結びつく 増幅効果の対照の役割を果たす。 変型において、本発明による方法の中の微生物の既知の濃度の調製物を、 ・分岐ＤＮＡと呼ばれる顕色法および／または逆転写および／または自生ウィル スのＤＮＡまたはＲＮＡと同一の仕方の増幅などの顕色方法による検出または定 量にＤＮＡまたはＲＮＡが適したままである、不活性化した同じ微生物、 ・同じ微生物から抽出した完全なヌクレオチド配列、または ・合成によって製造した、完全なヌクレオチド配列、 の既知の濃度の調製物に代えることができる。 本発明による方法の特に有利な変型によれば、定量または検出されるタイプの ＤＮＡまたはＲＮＡの完全な微生物の検定された既知の濃度の調製物またはこの 微生物の既知の濃度に対応する前記微生物のゲノムのＤＮＡまたはＲＮＡの濃度 の調製物を調製し、使用者の利用に供するまで保管する。 説明を簡単にするために、以下において、単に代表的な例として、増幅によっ て、もっと正確にはＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによって実現された検出について 述べるが、いわゆるＮＡＳＢＡ法（すなわち "nucleic acid sequence based as say"による方法）などの他の増幅法も使用することができる。 本発明による分子定量化および検出は小さな微生物にも、あるいは大型ではあ るが低濃度であるか、評価のためのその従来の経験的技術が先進諸国ではもはや 体系的に習熟されていない微生物にも顕著な利益がある。 本発明はまた適切な容器内におよび／または適切な装置の形で、主として、 ・一連の定量化または検出されるタイプのＤＮＡまたはＲＮＡの完全な微生物の 検定された既知の濃度、または前記微生物の既知の濃度に対応するＤＮＡまたは ＲＮＡの濃度、 ・対象および標準微生物のＤＮＡまたはＲＮＡのＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたはＮ ＡＳＢＡによるものを始めとする、抽出、顕色および／または逆転写および／ま たは増幅の手段、 ・対象および標準微生物、あるいは顕色あるいは増幅生成物のＤＮＡまたはＲＮ Ａ分析のための手段： とから成るＤＮＡまたはＲＮＡ微生物の定量化または検出のためのキットまたは 手段全体も対象とする。 前記キットまたは手段の全体は例えば、増幅効果のための、あるいはＲＴに結 びつく増幅効果の対照として、異種プラスミドのＤＮＡまたは異種転写ＲＮＡを およそ１０³コピー／μｌの形で内部対照を随意に含むこともできる。 ここで、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ生成物の分析手段はキットの外部手段でキ ットと組み合わせて使用されるものとすることができる。これらの手段は例えば 、電気泳動、比色定量、放射線測定、または適切な他のいっさいの分析手段によ る決定のための装置および／または製品を含むことができる。 前述の方法と手段では独自の仕方でＤＮＡまたはＲＮＡ微生物の絶対的定量化 が得られるが、それは対照微生物または定量化するそのゲノムが標準微生物また は並行処理されたそのゲノムと同一だからである。さらに、この方法とこれらの 手段は定量化と識別の万能技術を提供する、なぜならそれらは全ての微生物の定 量化を可能にするからである。 定量化の考慮を別にしても、本発明による方法と手段は、ＤＮＡまたはＲＮＡ 微生物の逆転写および／または増幅の現状技術によって測定可能な微生物の最低 量の検出にも使用することができる。実際には、測定可能な最低量はＤＮＡ微生 物については１からの５程度の微生物であり、ＲＮＡ微生物については１０から １００程度の微生物である。 以下に本発明を、非制限的な、付属の図面を参照してもっと具体的に説明する 。 図１は同じウィルスの標準ＤＮＡの異なるいくつかの濃度で実施した異なるＰ ＣＲ実験の検出感度と増幅効果の変動をグラフで表している。 図２は同じウィルスのＲＮＡの異なるいくつかの濃度で実施した異なるＲＴ− ＰＣＲ実験の検出感度と増幅効果の変動をグラフで表している。 図３は同じ実験で、異なる患者からのウィルスの調製物から得られたＤＮＡの いくつかの濃度で実施したＰＣＲ実験の増幅効果の変動をグラフで表している。 図４はそれぞれ、同じウィルスの複数の調製物から得られたＤＮＡのいくつか の濃度と、異なる２つのプラスミドで得られたＤＮＡのいくつかの濃度で実施し たＰＣＲ実験の増幅効果の変動をグラフで表している。 図５は異なる患者に由来するウィルスの複数の調製物から得られたＲＮＡのい くつかの濃度で実施したＲＴ−ＰＣＲ実験の増幅効果の変動をグラフで表してい る。 図６はそれぞれ、異なる患者に由来するウィルスの複数の調製物から得られた ＲＮＡのいくつかの濃度と、異なる転写産物の２つのＲＮＡで実施したＲＴ−Ｐ ＣＲ実験の増幅効果の変動をグラフで表している。 このように、参考までに、３００ｎｇが得られるように培養から得られたＨＩ ＶのＲＮＡを濃縮、精製、抽出した。ＨＩＶのヌクレオチド合計数が１９０００ であり、ヌクレオチドの分子量を３３０ダルトンとして、ＨＩＶのＲＮＡの総分 子量が６，３００，０００ダルトンであると演繹した。このとき、アボガドロ数 を用いて、ウィルスゲノムの、したがって、そこから３００ｎｇのＲＮＡが発生 するウィルスの正確な数が得られ、それはおよそ３×１０¹⁰ウィルスである。精 製したウィルス調製物のアリコート部分のウィルス濃度を知ることによって、こ のウィルスの標準的な範囲を調製し、本発明による方法に使用することができる 。 本発明による方法は信頼できる同定および／または絶対定量化を可能にする、 なぜなら（定量される）対象微生物は標準微生物と同一だからである。さらにこ のプロセスで使用される方法は万能である、なぜなら平行して量が測定可能な全 ての微生物の定量化を可能にするからである。 その実施のための方法とキットはあらゆる媒体または標本内の微生物の定量化 に使用できるだけでなく、ＤＮＡまたはＲＮＡ微生物の逆転写および／または増 幅が現在の方法で測定可能な微生物の最低量の検出にも使用できる。 ＤＮＡ微生物の場合の測定可能な最低量は１から５の微生物でありＲＮＡ微生 物の場合はおよそ１０から１００微生物である。 本発明は定量の標準化のための単純かつ効果的な技術と方法を提供することに よって試験管内での微生物の定量化の手段と方法に決定的な進歩をもたらすもの である。 次に本発明を非制限的な実施例において詳細に説明するが、特記事項なき限り 、その中の比率と百分率は重量／重量である。 実施例１：ＰＣＲによる標的ＤＮＡの検出と定量化のための万能標準の利点の実 証。 同じＨＢＶの異なる濃度から得られたＤＮＡに対するＰＣＲの検出感度と増幅 効果の変動を研究した。プラズマは高ＨＢｓＡｇ力値でプラズマフェレシスによ って慢性ＨＢＶキャリアーから得られた。ＨＢＶのＤＮＡウィリオンはＴＥＢＭ 媒質（トリス−ＨＣｌ ０．０１Ｍ、ｐＨ７．６、ＮａＥＤＴＡ ０．００１Ｍ 、ウシの血清アルブミン１％、０．３％の２−メルカプト−エタノール）内の３ ０％（重量／体積）のショ糖の床を通して遠心分離（Ｓｐｉｎｃｏ２５遠心分離 器内で、２５，０００ｒｐｍ、４℃で一晩）によって精製された。分画したＨＢ Ｖのウィリオンの純度は電子顕微鏡で追跡した。ウィリオンに組み合わされたＤ ＮＡは市販のＤＮＡ精製キットによって抽出された。得られたウィルスＤＮＡは 分光測定によって定量した。ウィルスＤＮＡのコピー数はＨＢＶのＤＮＡのウィ ルスゲノムの分子量によって計算した。変型として、ウィリオンの数は電子顕微 鏡で定量化することもできる。ＨＢＶのＤＮＡの一連の希釈（１０、１００、１ ０００、１０，０００コピー）はＣ遺伝子に固有のＨＢＶプライマー対：（Ｇ ＣＴＴＴＧＧＧＧＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＣＣ／ＧＡＣＴＡＣＴＡＧＡＴＣＣＣ ＴＧＧＡＴＧＣＴＧＧ）１００ｐｍｏｌで、同一のＰＣＲのサイクルの連続（９ ４℃で６０秒、５６℃で６０秒、７２℃で９０秒）にかけた。特定ＰＣＲの生成 物をγ−³²Ｐ（ＴＣＡＧＣＴＣＴＧＴＡＴＣＧＡＧＡＡＧＣＣ）によって先端に マーカーを付けたプローブによるドットブロット雑種形成によって分析し、ＰＣ Ｒのそれぞれの信号の毎分の計数（ｃｐｍ）はβ線カウンターによって明らかに された。 結果を記録し、図１にグラフの形で報告した。標準は異なる結果を出し、その ため実験ごとに対象標本と並行して使用されなければならないことが明らかであ る。 したがって、一定マトリックス（コピー数）のＤＮＡが入力されるごとに、図 １のグラフによれば、実験ごとにＰＣＲ生成物濃度の間に大きな開きがある。 実施例２：ＲＴ−ＰＣＲによる標的ＲＮＡの検出と定量化のための万能標準の利 点の実証。 同じＨＩＶ−１の異なる濃度から得られたＲＮＡに対するＰＣＲの検出感度と 逆転写／増幅効果の変動を研究した。ＨＩＶ−１のＲＮＡウィリオンはセファロ ースのカラム上で一次単離物によって感染させた血液の単核細胞の芽の培養の上 澄みを濾して精製した。分画したＨＩＶ−１のウィリオンの純度は電子顕微鏡で 追跡した。ウィリオンに組み合わされたＲＮＡは市販のＲＮＡ単離キットによっ て抽出した。得られたウィルスＲＮＡは分光測定によって定量した。ウィルスＲ ＮＡのコピー数はＨＩＶ−１のＲＮＡのウィルスゲノムの分子量によって計算し た。１マイクログラムのｔＲＮＡを添加した後、ＲＮＡの標本の一連の希釈（１ ，０００，０００、１００，０００、１０，０００、１０００コピー）はペレッ ト化し１０μｌ内に懸濁させた。組み替えＭｏｌｏｎｅｙマウスの白血病ウィル スの逆転写酵素１０単位とＨＩＶギャグ遺伝子の増幅のためのａｍｐｌｉＴａｑ ポリメラーゼＤＮＡ３単位を含有するＲＴ−ＰＣＲの反応混合物（９０μｌ）の それぞれにＲＮＡの１０μｌのアリコート部分と基準ｔＲＮＡ（ＨＩＶのないも の）１μｇをすぐに添加した。ＲＴ−ＰＣＲは４２℃で２５分間、ついで ９４℃で５分間実施し、その後ギャグ遺伝子に固有のＨＩＶプライマー対：（Ｇ ＧＡＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣ／ＴＣＣＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣ ＴＴＡＴＧＴＣ）をそれぞれ１００ｐｍｏｌ用いる４０サイクルのＰＣＲ（９４ ℃で６０秒、５６℃で６０秒、７２℃で９０秒）にかけた。特定ＰＣＲの生成物 をγ−³²Ｐ（ＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧ ＴＡＴＡＧＣＣＣＴＡＣ）によって先端にマーカーを付けたプローブによるドッ トブロットによる雑種形成によって分析し、ＰＣＲのそれぞれの信号の毎分の計 数（ｃｐｍ）はβ線カウンターによって明らかにされた。 結果を記録し、図２にグラフの形で報告した。結果の変動性は実験ごとに非常 に大きいことがわかる。ここでも、標準は異なる結果を出し、そのため実験ごと に対象標本と並行して使用されなければならないことが明らかである。 したがって、一定（コピー数）のＲＮＡが入力されるごとに、図２のグラフに よれば、実験ごとにＰＣＲ生成物濃度の間に大きな開きがある。 実施例３：ウィリオンＤＮＡ標準の有効化 この実施例はＨＢＶに感染した異なる患者の血清に由来する自生ＨＢＶのウィ リオンのＤＮＡの同一ＰＣＲサイクルによる増幅効果の同一性を示している。実 施例１に示したごとく調製したＨＢＶのウィリオンのＤＮＡの異なる標本の一連 の希釈を同じ実験内で同じ数のＰＣＲサイクルにかけた。ＰＣＲ生成物（出力） はドットブロットとｃｐｍ計数によって定量化した。 図３にグラフの形で表した結果はＨＢＶ源のいかなるを問わず（ここでは異な る４つのＨＢＶ源）、ＰＣＲ増幅効果が同一であることを示している。 実施例４：ウィリオンＤＮＡ標準の有効化 実施例３と同じ手順であるが、自生ウィリオンのＤＮＡと２つのＨＢＶプラス ミドから得られたＤＮＡ（入力）を同じサイクルのＰＣＲで毎回使用して、ＰＣ Ｒによる増幅の比較効果を出すことができた（図４参照）。 ＨＢＶのＣ遺伝子の配列のＤＮＡの断片はＨＢＶｓＡｇ＋の血清からＰＣＲに よって生成され、プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とｐＣＴ（登録 商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（それぞれＨＢＶのＤＮＡ１およびＤＮＡ２プ ラスミド）内で結紮した。全ての構成物は適切な市販のキットでＤＮＡ配列決定 によって確認した。 図４にグラフの形で表した結果は既知の数のコピーが複数の標本から得られた 自生ウィルスＤＮＡの同一のコピー数のそれと同等の増幅効果を有するか否かを 示している。 実施例３と４からわかるように、由来の異なるＨＢＶのウィリオンのＤＮＡの 既知の濃度は理想的な万能標準になり、一方異なるプラスミドに取り込まれたウ ィルスＤＮＡの断片は相互に異なり、また自生ＤＮＡとは異なる振る舞いを示す 。 実施例５：ウィリオンＲＮＡ標準の有効化 この実施例はＨＩＶに感染した異なる患者の血清に由来する自生ＨＩＶのウィ リオンのＲＮＡの同一ＲＴ−ＰＣＲサイクルによる増幅効果の同一性を示してい る。実施例２に示したごとく調製したＨＩＶのウィリオンのＲＮＡの異なる標本 の一連の希釈を同じ実験内で１サイクルのＲＴ−ＰＣＲにかけた。ＰＣＲ生成物 （出力）はドットブロットとｃｐｍ計数によって定量化した。 図５にグラフの形で表した結果はＨＩＶ源のいかなるを問わず、ＲＴ−ＰＣＲ 増幅効果が同一であることを示している。 実施例６：ウィリオンＲＮＡ標準の有効化 実施例５と同じ手順であるが、自生ウィリオンのＲＮＡと既知の数のコピーで 転写した１つのＲＮＡ（入力）を同じサイクルのＲＴ−ＰＣＲで毎回使用して、 ＲＴ−ＰＣＲによる増幅の比較効果を出すことができた（図６参照）。 ＨＩＶ−１のギャグ配列のＲＮＡの断片はＨＩＶ−１のＤＮＡのマトリックス （それぞれＨＩＶ−Ｚ６のＤＮＡのｐＢＲ３２２プラスミドとＨＩＶ_IIIBのＤＮ ＡのｐＢＨ１０−Ｒ３プラスミド）をＴ７のポリメラーゼＲＮＡ（それぞれＨＩ ＶのＲＮＡ１およびＲＮＡ２転写産物）によって転写して生成された。 図６にグラフの形で表した結果は既知の数のコピーを有する転写産物のＲＮＡ が標本のＲＮＡのそれとは異なるＲＴ−ＰＣＲによる増幅効果を有することを示 している。 実施例５と６からわかるように、由来の異なるＨＩＶのウィリオンのＲＮＡの 既知の濃度は理想的な万能標準になり、一方異なるプラスミドに取り込まれたウ ィルスＲＮＡの断片は相互に異なり、また自生ＲＮＡとは異なる振る舞いを示す 。 したがって、 ・外部標準としてのウィリオンのＤＮＡの本発明による使用は定量的ＰＣＲ試験 における増幅効果の追跡のための外部または内部標準に使われるプラスミドのＤ ＮＡの使用よりもはるかに正確かつ便利である、 ・外部標準としてのウィリオンのＲＮＡの本発明による使用は定量的ＲＴ−ＰＣ Ｒ試験における増幅効果の追跡のための外部または内部標準に使われる転写産物 のＲＮＡの使用よりもはるかに正確かつ便利である。 実施例７：視覚化による検出のためのヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）のゲノ ムの定量化キット ７．１．はじめに 本発明によるヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）のゲノムの定量化キットは細 胞のない全ての生物流体（プラズマ、血清、精液、気管支胞状洗浄流体、など） ならびに培養の上澄み内のＨＩＶ（ＨＩＶ−０、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２の全て のゲノタイプを含む）のゲノムＲＮＡの検出と定量化のために考案されたもので ある。そこには迅速な方法−クローン化Ｍｏｌｏｎｅｙマウスの白血病ウィルス の逆転写酵素によるｃＤＮＡへのＨＩＶウィリオンのＲＮＡの逆転写−このとき はポリメラーゼＤＮＡＴａｑを用いる増幅−そして最後に、ウィルスＲＮＡの１ ０００コピーの検出限度と８時間の１回だけの試験で４程度を越える大きさの定 量化の範囲を可能にした、アガロースゲル上での視覚化による単純な手順による 定量的検出−によるウィルスＲＮＡの単離を可能にするための試薬が含まれる。 最終体積５０μｌの手順で１００回の反応（それぞれ４０μｌ）のために十分な 試薬が提供された。 キットには上述のごとく（４シリーズの試験について提供された、１０⁴，１ ０³、１０²および１０コピー／μｌ）ＨＩＶのウィリオン標準（以下"ウィリオ ン標準" と称する）のセットが含まれ、プラズマ・血清のＨＩＶウィリオンのＲＮＡ濃度 の正確な測定が可能になった。キットには正の増幅信号の対照の役割を果たすプ ラスミドのＨＩＶのＤＮＡ（４シリーズの試験について、反応当たり１０²コピ ー）が含まれ、さらに随意に、検査する標本のそれぞれに添加され、内部対照（ 以下”ＩＣ”）の役割を果たす異種転写産物のＲＮＡが含まれる（反応当たり１ ０³コピー、反応１００回分を提供）。 ７．２．キットの構成要素のリスト ＨＩＶのゲノムの定量化キットは好適には定温冷凍庫内で−２０℃に、あるい は適切な酵素の保存溶液を用いて４℃で保存しなければならない。適切な条件で 保存したとき、物質はラベルに印刷された検査日まで安定している。 ７．３．試薬と装置 ７．３．１．試薬 ・クロロホルム（分析用の純粋品） ・イソプロパノール（分析用の純粋品） ・７５％エタノール（分析用の純粋品） ・アガロース（ＤＮａｓｅのないもの） ・臭化エチジウム ・ＲＮＡ単離溶液 ７．３．２．装置 ・マイクロチューブ遠心分離器（４℃） ・真空化装置 ・加熱蓋式熱サイクル装置 ・電気泳動用の発電器と槽 ７．４．逆転写に結びつけられたゲノムの増幅によるＨＩＶの定量化のための手 順 ７．４．１．ＲＮＡ抽出 ＨＩＶのウィリオン標準とプラズマまたは血清の標本１００μｌを均質化器内 で数回揺動しながら、ＲＮＡ単離溶液４００μｌで均質化した。クロロホルム６ ０μｌを添加し、１５秒間強く攪拌してから、１０分間水の上に放置した。懸濁 液は１２，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離にかけた。 クロロホルムを添加し、遠心分離した後、下部のフェノール・クロロホルム相 （〜２４０μｌ）と上部の水性相（〜３２０μｌ）の２相が形成された。ＲＮＡ は水性相だけに残留し、ＤＮＡとタンパク質は境界相と有機相にあった。 水性相（３００μｌ）は新しい試験管に移した。等量のイソプロパノールを添 加し、標本を−２０℃で１時間保存した。標本は１２，０００ｇ（４℃）で１０ 分間遠心分離にかけ、ペレットを短時間で乾燥させた。上澄みを除去し、ＲＮＡ のペレットは対流効果によって７５％エタノール（５００μｌ）で１回洗浄され 、最終的にＲＮＡのペレットを真空乾燥させた。ＲＮＡのペレットはＲＮＡの予 備緩衝液１１μｌ内に溶解した。 ＲＮＡの沈殿は試験管の底に白黄色（大量のときにしか見えない）のペレット を形成した。ＲＮＡのペレットは完全に乾燥させないことが重要である、なぜな ら乾燥させるとその可溶性が大幅に低下するからである。 ７．４．２．ＲＮＡの逆転写とｃＤＮＡの増幅 新しい試験管（２００μｌ）内にＲＮＡ標本１０μｌと正／負の対照を添加し た。逆転写・増幅混合物（ＲＴＡＭ）４０μｌ（ＨＩＶ増幅混合物３８．９μｌ と酵素混合物１．１μｌ）をそれぞれの試験管に入れた。試験管は、加熱蓋式熱 サイクル実施装置（商用名はThermal Cycler）に移した。 ・４２℃で２５分、 ・９４℃で５分、 ・３５サイクル（９４℃で３５秒、５５℃で４５秒、７２℃で６０秒） ・ついで５５℃で５分間、さらに７２℃で５分間。 ７．５．視覚化と定量化 反応後混合物の１０μｌを臭化エチジウム０．５μｇ／ｍｌを含有する１．５ ％アガロースゲルの上に分配し、１５０Ｖで１０分間電気泳動を実施した。 特有に増幅されたＨＩＶの配列はサイズの差によって容易に視覚化できた。プ ラズマ・血清標本１００μｌ内のＨＩＶウィリオンのＲＮＡコピーの範囲はその 増幅帯をＨＩＶのウィリオン標準のそれとの比較によって推定できた（半定量化 ）。 実施例８：光密度読み取り器による検出のためのヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩ Ｖ）のゲノムの定量化キット ８．１．はじめに 本発明によるヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）のゲノムの定量化キットは細 胞のない全ての生物流体（プラズマ、血清、精液、気管支蜂の巣構造洗浄流体、 など）ならびに培養の上澄み内のＨＩＶ（ＨＩＶ−０、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２ の全てのゲノタイプを含む）のゲノムＲＮＡの検出と定量化のために考案された ものである。そこには迅速な方法−クローン化Ｍｏｌｏｎｅｙマウスの白血病ウ ィルスの逆転写酵素によるｃＤＮＡへのＨＩＶウィリオンのＲＮＡの逆転写−こ のときはポリメラーゼＤＮＡＴａｑを用いる増幅−そして最後に、ウィルスＲＮ Ａの１００コピーの検出限度と８時間に１回だけの試験でおよそ２程度の大きさ の定量化範囲を可能にした、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）に結びつけられた液体雑 種交雑手順による定量的検出−によるウィルスＲＮＡの単離を可能にするための 試薬が含まれる。最終体積５０μｌの手順で１００回の反応（それぞれ４０μｌ ）のために十分な試薬が提供された。 キットには上述のごとく（４シリーズの試験について提供された、１０³、１ ０²、１０および１コピー／μｌ）ＨＩＶウィリオン標準"ウィリオン標準"のセ ットが含まれ、プラズマ・血清のＨＩＶウィリオンのＲＮＡ濃度の正確な測定が 可能になった。キットには正の増幅信号の対照の役割を果たすプラスミドのＨＩ ＶのＤＮＡ（４シリーズの試験について、反応当たり１０²コピー）が含まれ、 さらに随意に、検査する標本のそれぞれに添加され、内部対照”ＩＣ”の役割を 果たす異種転写産物のＤＮＡが含まれる（反応当たり１０³コピー、反応１００ 回分を提供）。 ８．２．キットの構成要素のリスト ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）のゲノムの定量化キットは好適には定温冷 凍庫内で−２０℃に、あるいは適切な酵素の保存溶液を用いて４℃で保存しなけ ればならない。適切な条件で保存したとき、物質はラベルに印刷された検査日ま で安定している。 ８．３．試薬と装置 ８．３．１．試薬 ・クロロホルム（分析用の純粋品） ・イソプロパノール（分析用の純粋品） ・７５％エタノール（分析用の純粋品） ・ＲＮＡ単離溶液 ・ストレプタビジンを被覆したマイクロプレート ８．３．２．装置 ・マイクロチューブ遠心分離器（４℃） ・真空化装置 ・加熱蓋式熱サイクル装置 ・液体交雑のための湯煎鍋または保温器 ・自動光学密度読み取り器 ８．４．逆転写に結びつけられたゲノムの増幅によるＨＩＶの定量化のための手 順 ８．４．１．ＲＮＡ抽出 ＨＩＶのウィリオン標準とプラズマまたは血清の標本１００μｌを均質化器内 で数回揺動しながら、ＲＮＡ単離溶液４００μｌで均質化した。クロロホルム６ ０μｌを添加し、１５秒間強く攪拌してから、１０分間氷の上に放置した。懸濁 液は１２，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離にかけた。 クロロホルムを添加し、遠心分離した後、下部のフェノール・クロロホルム相 （〜２４０μｌ）と上部の水性相（〜３２０μｌ）の２相が形成された。ＲＮＡ は水性相だけに残留し、ＤＮＡとタンパク質は境界相と有機相にあった。 水性相（３００μｌ）は新しい試験管に移した。等量のイソプロパノールを添 加し、標本を−２０℃で１時間保存した。標本は１２，０００ｇ（４℃）で１０ 分間遠心分離にかけ、ペレットを短時間で乾燥させた。上澄みを除去し、ＲＮＡ のペレットは対流効果によって７５％エタノール（５００μｌ）で１回洗浄し、 最終的にＲＮＡのペレットを真空乾燥させた。ＲＮＡのペレットはＲＮＡの予備 緩衝液１１μｌ内に溶解した。 ＲＮＡの沈殿は試験管の底に白黄色（大量のときにしか見えない）のペレット を形成した。ＲＮＡのペレットは完全に乾燥させないことが重要である、なぜな ら乾燥させるとその可溶性が大幅に低下するからである。 ８．４．２．ＲＮＡの逆転写とｃＤＮＡの増幅 新しい試験管（２００μｌ）内にＲＮＡ標本１０μｌと正／負の対照を添加し た。逆転写・増幅混合物（ＲＴＡＭ）４０μｌ（ＨＩＶ増幅混合物３８．７μｌ と酵素混合物１．１μｌと０．２μlのDIG-dUTP）をそれぞれの試験管に入れた。 試験管は、加熱蓋式熱サイクル実施装置に移した。 ・４２℃で２５分、 ・９４℃で５分、 ・３６サイクル（９４℃で３５秒、５５℃で４５秒、７２℃で６０秒） ・ついで５５℃で５分間、さらに７２℃で５分間。 ８．５．検出と定量化 増幅生成物２μl（×２）と１０倍希釈（×２）をあたらしい試験管内に加え 、環境温度で１０分間変性溶液１８μlと混合した。ＨＩＶプローブとＩＣプロ ーブを含む交雑溶液（×４）を最大１８０μｌまで添加、対流、ついでストレプ タビジンで被覆したマイクロプレートのピット（well）内にピペットで移送、つ いで振動器上で３７℃で２時間保温した後、溶液を捨て、それぞれのピットまた は槽は洗浄緩衝液２００μlで３回洗浄され、それぞれのピットにＡＢＴＳ基質 の溶液２００μlを加え、攪拌しながら３７℃で３０分間保温した。保温の間プ レートは暗 所に置いた。４０５ｎｍでの吸光度を読み取った。それぞれのプラズマ・血清標 本のｍｌあたりのＨＩＶ粒子数はＨＩＶのウィリオン標準によって発生した標準 曲線を用いる電算機自動化システムによって記録することができた（絶対定量化 ）。 実施例９：蛍光による検出のためのヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）のゲノム の定量化キット ９．１．はじめに 本発明によるヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）のゲノムの定量化キットは、 定量化範囲が７時間に１回だけの試験で４倍以上の大きさであった点を除いて、 ほぼ実施例８に記載されたとおりに設計され、実施された。 ９．２．キットの構成要素のリスト ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）のゲノムの定量化キットは好適には定温冷 凍庫内で−２０℃に、あるいは適切な酵素の保存溶液を用いて４℃で保存しなけ ればならない。適切な条件で保存したとき、物質はラベルに印刷された検査日ま で安定している。 ９．３．試薬と装置 ９．３．１．試薬 ・クロロホルム（分析用の純粋品） ・イソプロパノール（分析用の純粋品） ・７５％エタノール（分析用の純粋品） ・ＲＮＡ単離溶液 ９．３．２．装置 ・マイクロチューブ遠心分離器（４℃） ・真空化設備または遠心ポンプ ・加熱蓋式熱サイクル装置 ・液体交雑のための湯煎鍋または保温器 ・高感度蛍光光度計 ９．４．逆転写に結びつけられたゲノムの増幅によるＨＩＶの定量化のための手 順 ９．４．１．ＲＮＡ抽出 ＨＩＶのウィリオン標準とプラズマまたは血清の標本１００μｌを均質化器内 で数回揺動しながら、ＲＮＡ単離溶液４００μｌで均質化した。クロロホルム６ ０μｌを添加し、１５秒間強く攪拌してから、１０分間氷の上に放置した。懸濁 液は１２，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離にかけた。 クロロホルムを添加し、遠心分離した後、下部のフェノール・クロロホルム相 （〜２４０μｌ）と上部の水性相（〜３２０μｌ）の２相が形成された。ＲＮＡ は水性相だけに残留し、ＤＮＡとタンパク質は境界相と有機相にあった。 水性相（３００μｌ）は新しい試験管に移した。等量のイソプロパノールを添 加し、標本を−２０℃で１時間保存した。標本は１２，０００ｇ（４℃）で１０ 分間遠心分離にかけ、ペレットを短時間で乾燥させた。上澄みを除去し、ＲＮＡ のペレットは対流効果によって７５％エタノール（５００μｌ）で１回洗浄し、 最終的にＲＮＡのペレットを真空乾燥させた。ＲＮＡのペレットはＲＮＡの予備 緩衝液１１μｌ内に溶解した。 ＲＮＡの沈殿は試験管の底に白黄色（大量のときにしか見えない）のペレット を形成した。ＲＮＡのペレットは完全に乾燥させないことが重要である、なぜな ら乾燥させるとその可溶性が大幅に低下するからである。 ９．４．２．ＲＮＡの逆転写とｃＤＮＡの増幅 新しい試験管（２００μｌ）内にＲＮＡ標本１０μｌと正／負の対照を添加し た。逆転写・増幅混合物（ＲＴＡＭ）４０μｌ（ＨＩＶ増幅混合物３８．９μｌ と酵素混合物１．１μｌ）をそれぞれの試験管に入れた。試験管は、加熱蓋式熱 サイクル実施装置に移した。 ・４２℃で２５分、 ・９４℃で５分、 ・３５サイクル（９４℃で３５秒、５５℃で４５秒、７２℃で６０秒） ・ついで５５℃で５分間、さらに７２℃で５分間。 ９．５．検出と定量化 反応後混合物５μl（×２）をあたらしい試験管内に加え、環境温度で１０分 間変性溶液１５μlと混合した。交雑溶液を最大１８０μl（×２）まで添加、対 流、ついでＨＩＶプローブで被覆したマイクロプレートのピット内にピペットで 移送、ついで振動器上で３７℃に２時間保温した後、溶液を捨て、それぞれのピ ットまたは槽は洗浄緩衝液２００μlで３回洗浄した。フルオロクロム溶液１０ ０μlを加え、蛍光計数のために自動化蛍光光度計上にマイクロプレートを移送 し、結果を編集した。 実施例１０：化学ルミネセンスによる検出のためのヒト免疫不全症ウィルス（Ｈ ＩＶ）のゲノムの定量化キット １０．１．はじめに 本発明によるヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）のゲノムの定量化キットは、 定量化範囲が７時間に１回だけの試験で４倍以上の大きさであった点を除いて、 ほぼ実施例８に記載されたとおりに設計され、実施された。 １０．２．キットの構成要素のリスト ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）のゲノムの定量化キットは好適には定温冷 凍庫内で−２０℃に、あるいは適切な酵素の保存溶液を用いて４℃で保存しなけ ればならない。適切な条件で保存したとき、物質はラベルに印刷された検査日ま で安定している。 １０．３．試薬と装置 １０．３．１．試薬 ・クロロホルム（分析用の純粋品） ・イソプロパノール（分析用の純粋品） ・７５％エタノール（分析用の純粋品） ・ＲＮＡ単離溶液 １０．３．２．装置 ・マイクロチューブ遠心分離器（４℃） ・真空化設備または遠心ポンプ ・加熱蓋式熱サイクル装置 ・液体交雑のための湯煎鍋または保温器 ・光度計 １０．４．逆転写に結びつけられたゲノムの増幅によるＨＩＶの定量化のための 手順 １０．４．１．ＲＮＡ抽出 ＨＩＶのウィリオン標準とプラズマまたは血清の標本１００μｌを均質化器内 で数回揺動しながら、ＲＮＡ単離溶液４００μｌで均質化した。クロロホルム６ ０μｌを添加し、１５秒間強く攪拌してから、１０分間氷の上に放置した。懸濁 液は１２，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離にかけた。 クロロホルムを添加し、遠心分離した後、下部のフェノール・クロロホルム相 （〜２４０μｌ）と上部の水性相（〜３２０μｌ）の２相が形成された。ＲＮＡ は水性相だけに残留し、ＤＮＡとタンパク質は境界相と有機相にあった。 水性相（３００μｌ）は新しい試験管に移した。等量のイソプロパノールを添 加し、標本を−２０℃で１時間保存した。標本は１２，０００ｇ（４℃）で１０ 分間遠心分離にかけ、ペレットを短時間で乾燥させた。上澄みを除去し、ＲＮＡ のペレットは対流効果によって７５％エタノール（５００μｌ）で１回洗浄し、 最終的にＲＮＡのペレットを真空乾燥させた。ＲＮＡのペレットはＲＮＡの予備 緩衝液１１μｌ内に溶解した。 ＲＮＡの沈殿は試験管の底に白黄色（大量のときにしか見えない）のペレット を形成した。ＲＮＡのペレットは完全に乾燥させないことが重要である、なぜな ら乾燥させるとその可溶性が大幅に低下するからである。 １０．４．２．ＲＮＡの逆転写とｃＤＮＡの増幅 新しい試験管（２００μｌ）内にＲＮＡ標本１０μｌと正／負の対照を添加し た。逆転写・増幅混合物（ＲＴＡＭ）４０μｌ（ＨＩＶ増幅混合物３８．９μｌ と酵素混合物１．１μｌ）をそれぞれの試験管に入れた。試験管は、加熱蓋式、 熱サイクル実施装置に移した。 ・４２℃で２５分、 ・９４℃で５分、 ・３５サイクル（９４℃で３５秒、５５℃で４５秒、７２℃で６０秒） ・ついで５５℃で５分間、また７２℃で５分間。 １０．５．検出と定量化 反応後混合物５μl（×２）を２本のあたらしい試験管内に加え、環境温度で １０分間変性溶液１５μlと混合した。ＨＩＶ固有プローブまたは内部対照（Ｉ Ｃ）ＤＮＡ固有のプローブを含む交雑溶液を最大１８０μl（×２）まで添加、 対流、ついでストレプタビジンで被覆した球の試験管内またはストレプタビジン で被覆したマイクロプレートのピット内にピペットで移送、ついで振動器上で３ ７℃に２時間保温した後、溶液を捨て、それぞれのピットまたは槽は洗浄緩衝液 ２００μlで３回洗浄した。アルカリ性フォスファターゼ（ＡＰＬ）と結合した 抗ｄｓＤＡＮ抗体２００μlを加え、振動器の上で３７℃で３０分間保温した。 洗浄緩衝液２００μｌで３回洗浄した後、化学ルミネセンス基質溶液１００μｌ を添加した。 ついで、化学ルミネセンスの計数と結果の編集のためにマイクロプレートは直ち に光度計に移した。それぞれのプラズマ・血清標本のｍｌあたりのＨＩＶ粒子数 はＨＩＶのウィリオン標準によって発生した標準曲線を用いる電算機自動化シス テムによって記録することができた（絶対定量化）。 実施例１１：化学ルミネセンスによるヒトＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のゲノム の定量化キット １１．１．はじめに 本発明によるヒトＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のゲノムの定量化キットは細胞 のない全ての生物流体（プラズマ、血清、精液、気管支蜂の巣構造洗浄流体、な ど）のＨＢＶのゲノムＤＮＡの検出と定量化のために考案されたものである。そ こには迅速な方法によるウィルスＤＮＡの単離、ポリメラーゼＤＮＡＴａｑによ るＨＢＶウィリオンのＤＮＡ増幅、そして、ウィルスＤＮＡの５０コピーの検出 限度と５時間に１回だけの試験で４程度を越える大きさの定量化の範囲を可能に した、化学ルミネセンスに結びつけられる液体交雑手順による定量的検出を可能 にするための試薬が含まれる。最終体積５０μｌの手順で１００回の反応（それ ぞれ４０μｌ）のために十分な試薬が提供された。 キットには（４シリーズの試験について提供された、１０⁴，１０³、１０²お よび１０コピー／μｌ）ＨＢＶウィリオン標準のセットが含まれ、プラズマ・血 清のＨＢＶウィリオンのＤＮＡ濃度の正確な測定が可能になった。キットには正 の増幅信号の対照の役割を果たすプラスミドのＨＢＶのＤＮＡ（４シリーズの試 験について、反応当たり１０³コピー）が含まれ、さらに随意に、検査する標本 のそれぞれに添加され、内部対照”ＩＣ”の役割を果たす異種転写産物のＤＮＡ が含まれる（反応当たり１０³コピー、反応１００回分を提供）。 １１．２．キットの構成要素のリスト ＨＢＶのゲノムの定量化キットは好適には定温冷凍庫内で−２０℃に、あるい は適切な酵素の保存溶液を用いて４℃で保存しなければならない。適切な条件で 保存したとき、物質はラベルに印刷された検査日まで安定している。 １１．３．試薬と装置 ・マイクロチューブ遠心分離器 ・加熱蓋式熱サイクル装置 ・液体交雑のための湯煎鍋 ・光度計 １１．４．標本調製と増幅のための手順 １１．４．１．標本調製 ＨＢＶのウィリオン標準とプラズマまたは血清の標本５０μｌを均質化器内で 数回揺動しながら、ＤＮＡ排出または放出緩衝液５０μｌで均質化し、９８℃で １０分間放置した。 遠心分離した後、ＤＮＡは液相（１０〜１５μｌ）だけに残留し、タンパク質 はペレット内にあった。 １１．４．２．ｃＤＮＡの増幅 新しい試験管（２００μｌ）内に液相１０μｌを移した。ＨＢＶ増幅混合物４ ０μｌ＋ポリメラーゼＤＮＡ Ｔａｑ ５μｌ）をそれぞれの試験管に入れた。 試験管は、加熱蓋式熱サイクル実施装置に移した。 ・９４℃で５分、 ・３５サイクル（９４℃で３５秒、６０℃で４５秒、７２℃で６０秒） ・ついで、さらに７２℃で５分間。 １１．５．視覚化と定量化 反応後混合物５μl（×２）を並行して２本のあたらしい試験管内に加え、環 境温度で１０分間変性溶液１５μlと混合した。ＨＢＶ固有プローブまたは内部 対照（ＩＣ）ＤＮＡ固有のプローブを含む交雑溶液（×２）を最大１８０μlま で添加、対流、ついでストレプタビジンで被覆した球の試験管内に移送またはス トレプタ ビジンで被覆したマイクロプレートのピット内にピペットで移送、ついで振動器 上で３７℃に２時間保温した後、溶液を捨て、それぞれのピットまたは槽は洗浄 緩衝液２００μlで３回洗浄した。アルカリ性フォスファターゼ（ＡＰＬ）と結 合した抗ｄｓＤＮＡ抗体２００μlを加え、振動器の上で３７℃で３０分間保温 した。洗浄緩衝液２００μｌで３回洗浄した後、化学ルミネセンス基質溶液１０ ０μｌを添加した。ついで、化学ルミネセンスの計数と結果の編集のためにマイ クロプレートは直ちに光度計に移した。それぞれのプラズマ・血清標本のｍｌあ たりのＨＢＶ粒子数はＨＢＶのウィリオン標準によって発生した標準曲線を用い る電算機自動化システムによって記録することができた（絶対定量化）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年１月１２日（１９９８．１．１２） 【補正内容】 同じ実験内の自生ウィルスの同一濃縮物から発生したＤＮＡのそれと…同一…。 例えば、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ）のそれなどの、ＲＮＡウィルスを定量化または識 別しようとする場合には問題は一層複雑になる。実際、ＰＣＲによる増幅段階は 、ＲＮＡウィルスの場合、別の酵素、逆転写酵素（ＲＴと略す）によって、ある いは２つの作用（ＤＮＡの逆転写と増幅）を有する一つの酵素によって多く実現 される逆転写段階と組み合わされなければならない。いずれの場合にも、現在市 場で入手できる酵素は実験ごとに１０：１（すなわちＲＮＡの１０のコピーから ＤＮＡの１つのコピーが与えられる）から１００：１（ＲＮＡの１００のコピー からＤＮＡの１つのコピーが与えられる）の間で変動することのある逆転写比を 得ることができる。そこから生じる問題、すなわち連続する実験結果の比較が不 可能であることは、同じプライマーを使用するが、その増幅部分が外部標準を用 いた場合には同一であり、共増幅でそれを用いた場合には配列すなわち長さが異 なる標準ＲＮＡ断片（標準転写）の一連の濃縮物を同時に培養してこれまで解決 され、この場合転写体は定量化対象微生物のＲＮＡと同じ試験管内で培養される 。 例えば文書ＦＲ−Ａ−２６９１１６２は特にレトロウィルスに適用可能な、定 量決定法において、外部標準として、ＨＩＶ１またはＨＩＶ２ウィルスに関して はタンパク質Ｐ２４／２５またはＰ２７を始めとする、その基準ウィルス性タン パク質または「コアタンパク質」で滴定した、前記ウィルスの決定された量によ って感染した細胞の培養の濃度の使用を含む方法が記載されている。 残念なことに、２つの転写体の同じ濃縮物から出た増幅体の濃縮物は異なるこ とがあり、さらにはウィルスの同一濃縮物に由来するＲＮＡから得られたものと 異なることさえある。 結論として、 ・既知の逆転写および／または増幅技術は同じ標本について実験ごとに同一の結 果が得られない、 請求の範囲 １．任意のＤＮＡまたはＲＮＡ微生物の定量化と検出のための方法において、 （１）外部標準を形成するように、そのＤＮＡまたはＲＮＡ濃度によってあらか じめ検定された微生物の連続的希釈から得られた標準微生物の濃度範囲の形での 、微生物の標準濃度または、標準微生物と呼ばれるこの微生物が有するＤＮＡま たはＲＮＡの濃度の使用または決定と、 （２）定量される対象微生物またはそのゲノムが標準微生物または並列処理され るそのゲノムに等しいとき、微生物の未知の濃度から得られたＤＮＡまたはＲＮ Ａの逆転写および／または増幅生成物の量と前記微生物の既知の濃度のＲＮＡま たはＤＮＡから得られた増幅生成物の量との比較と、 さらに増幅効果またはＲＴ効果の対照のために内部対照の添加： を含むことを特徴とする方法。 ２．過程（２）が標準の濃度と好適には分岐ＤＮＡと呼ばれる方法または標準ま たは対象微生物のＤＮＡまたはＲＮＡを増幅しない他のいっさいの顕色方法によ って検出されるような対象微生物の濃度との比較に基づく顕色で主として構成さ れることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．１）ヒト、動物または植物の採取標本から、または細胞培養から、定量する 微生物の任意の量を採取し、精製する、ここで微生物の量は有利には対象ＤＮＡ またはＲＮＡの濃度が直接法によって測定できるのに十分な量とする過程と、 ２）ＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、その採取量を測定する過程と、 ３）他方で当該微生物のヌクレオチド基の数を用いる過程と、 ４）このヌクレオチド基の数から、同じく既知のヌクレオチドの平均分子量を計 算に入れて、前記微生物のＤＮＡまたはＲＮＡの合計分子量を計算する過程と、 ５）このようにしてアボガドロ数を用いて、それぞれの微生物が有するＤＮＡま たはＲＮＡの量を計算する過程と、 ６）それぞれの希釈について（ａ）ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度と（ｂ）微生物の 濃度がわかっている、外部標準を形成するために、そのＤＮＡまたはＲＮＡ濃度 に応じてあらかじめ検定された微生物の連続する希釈から得られた標準微生物濃 度範囲を調製および／または使用する過程と、 ７）標準および対象微生物のＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、内部対照を添加し、 分岐ＤＮＡと呼ばれる方法または標準または対象微生物のＤＮＡまたはＲＮＡを 増幅しない他のいっさいの顕色方法による顕色および／または逆転写および／ま たは少なくとも一回の増幅に抽出物を並行してかけ、得られた値を記録する過程 と、 ８）標準および対象微生物のＤＮＡまたはＲＮＡの濃度、あるいは対象微生物の 増幅生成物と外部標準のそれを比較して、そこから対象微生物のそれぞれの標本 の中のＤＮＡまたはＲＮＡまたは総微生物の濃度の値を演繹する過程： とから成ることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ４．過程２）から５）が微生物数の単純な直接測定に代えられたことを特徴とす る請求項３に記載の方法。 ５．増幅効果、またはＲＴに結びつく増幅効果の対照として異種プラスミドのＤ ＮＡまたは異種転写産物のＲＮＡの形の、配列やプライマーが対象ＤＮＡまたは ＲＮＡとは無関係な、内部対照添加を含むことを特徴とする請求項１から４のい ずれか一つに記載の方法。 ６．微生物の既知の濃度の調製物を、 ・分岐ＤＡＮと呼ばれる顕色法および／または逆転写および／または自生ウィル スのＤＮＡまたはＲＮＡと同一の仕方の増幅などの顕色方法による検出または定 量にＤＮＡまたはＲＮＡが適したままである、不活性化した同じ微生物、 ・同じ微生物から抽出した完全なヌクレオチド配列、または ・合成によって製造した、完全なヌクレオチド配列、 の既知の濃度の調製物に代えることを特徴とする請求項１または２のいずれか一 つに記載の方法。 ７．定量または検出されるタイプのＤＮＡまたはＲＮＡの完全な微生物の検定さ れた既知の濃度の調製物または……前記微…のゲノムのＤＮＡまたはＲＮＡの濃 度の調製物を調製し、使用者の利用に供するまで保管することを特徴とする請求 項１から６のいずれか一つに記載の方法。 １２．全ての媒体または標本内の微生物の定量化のための、または微生物の測定 可能最小量、またはそれを超える量の検出のための請求項８から１０のいずれか 一つに記載のキットまたはセットの使用。 【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年２月１２日（１９９８．２．１２） 【補正内容】 ……この微生物の既知の濃度に対応する…生物……。 ８．適切な容器内におよび／または適切な装置の形で主として、 ・一連の、そのＤＮＡまたはＲＡＮ濃度によってあらかじめ検定された、定量ま たは検出されるタイプのＤＮＡまたはＲＮＡの完全な微生物の既知の濃度、また は前記微生物の既知の濃度に対応するＤＮＡまたはＲＮＡの濃度、 ・対象および標準微生物のＤＮＡまたはＲＮＡのＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたはＮ ＡＳＢＡによるものを始めとする、抽出、顕色および／または逆転写および／ま たは増幅の手段、 ・対象および標準微生物、あるいは顕色あるいは増幅生成物のＤＮＡまたはＲＮ Ａ分析のための手段と、 内部対照： を含むＤＮＡまたはＲＮＡ微生物の定量または検出のためのキットまたは手段の セット。 ９．微生物数の単純な直接測定のための手段を含むことを特徴とする請求項８に 記載のキットまたは手段のセット。 １０．増幅効果、またはＲＴに結びつく増幅効果の対照として好適には異種プラ スミドのＤＮＡまたは異種転写産物のＲＮＡの形の、配列やプライマーが対象Ｄ ＮＡまたはＲＮＡとは無関係な、内部対照添加を含むことを特徴とする請求項８ または９のいずれか一つに記載のキットまたは手段のセット。 １１．全ての媒体または標本内の微生物の定量化のための、または微生物の測定 可能最小量、またはそれを超える量の検出のための請求項１から７のいずれか一 つに記載の方法の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＺ，ＧＥ ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ， ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，Ｔ Ｒ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．任意のＤＮＡまたはＲＮＡ微生物の定量化と検出のための外部標準を用いる 方法において、 （１）微生物の標準濃度または、標準微生物と呼ばれるこの微生物が有するＤＮ ＡまたはＲＮＡの濃度の使用または決定と、 （２）定量される対象微生物またはそのゲノムが標準微生物または並列処理され るそのゲノムに等しいとき、微生物の未知の濃度から得られたＤＮＡまたはＲＮ Ａの逆転写および／または増幅生成物の量と前記微生物の既知の濃度のＲＮＡま たはＤＮＡから得られた増幅生成物の量との比較： を含むことを特徴とする方法。 ２．過程（２）が標準の濃度と好適には分岐ＤＮＡと呼ばれる方法または標準ま たは対象微生物のＤＮＡまたはＲＮＡを増幅しない他のいっさいの顕色方法によ って検出されるような対象微生物の濃度との比較に基づく顕色で主として構成さ れることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．１）ヒト、動物または植物の採取標本から、または細胞培養から、定量する 微生物の任意の量を採取し、精製する、ここで微生物の量は有利には対象ＤＮＡ またはＲＮＡの濃度が直接法によって測定できるのに十分な量とする過程と、 ２）ＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、その採取量を測定する過程と、 ３）他方で当該微生物のヌクレオチド基の数を用いる過程と、 ４）このヌクレオチド基の数から、同じく既知のヌクレオチドの平均分子量を計 算に入れて、前記微生物のＤＮＡまたはＲＮＡの合計分子量を計算する過程と、 ５）このようにしてアボガドロ数を用いて、それぞれの微生物が有するＤＮＡま たはＲＮＡの量を計算する過程と、 ６）それぞれの希釈について（ａ）ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度と（ｂ）微生物の 濃度がわかっている、外部標準を形成するために、そのＤＮＡまたはＲＮＡ濃度 に応じてあらかじめ検定された微生物の連続する希釈から得られた標準微生物濃 度範囲を調製および／または使用する過程と、 ７）標準および対象微生物のＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、分岐ＤＮＡと呼ばれ る方法または標準または対象微生物のＤＮＡまたはＲＮＡを増幅しない他のいっ さいの顕色方法による顕色および／または逆転写および／または少なくとも一回 の増幅に抽出物を並行してかけ、得られた値を記録する過程と、 ８）標準および対象微生物のＤＮＡまたはＲＮＡの濃度、あるいは対象微生物の 増幅生成物と外部標準のそれを比較して、そこから対象微生物のそれぞれの標本 の中のＤＮＡまたはＲＮＡまたは総微生物の濃度の値を演繹する過程： とから成ることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ４．過程２）から５）が微生物数の単純な直接測定に代えられたことを特徴とす る請求項３に記載の方法。 ５．増幅効果、またはＲＴに結びつく増幅効果の対照として好適には異種プラス ミドのＤＮＡまたは異種転写産物のＲＮＡの形の、配列やプライマーが対象ＤＮ ＡまたはＲＮＡとは無関係な、内部対照添加をさらに含むことを特徴とする請求 項１から４のいずれか一つに記載の方法。 ６．微生物の既知の濃度の調製物を、 ・分岐ＤＮＡと呼ばれる顕色法および／または逆転写および／または自生ウィル スのＤＮＡまたはＲＮＡと同一の仕方の増幅などの顕色方法による検出または定 量にＤＮＡまたはＲＮＡが適したままである、不活性化した同じ微生物、 ・同じ微生物から抽出した完全なヌクレオチド配列、または ・合成によって製造した、完全なヌクレオチド配列、 の既知の濃度の調製物に代えることを特徴とする請求項１または２のいずれか一 つに記載の方法。 ７．定量または検出されるタイプのＤＮＡまたはＲＮＡの完全な微生物の検定さ れた既知の濃度の調製物またはこの微生物の既知の濃度に対応する前記微生物の ゲノムのＤＮＡまたはＲＮＡの濃度の調製物を調製し、使用者の利用に供するま で保管することを特徴とする請求項１から６のいずれか一つに記載の方法。 ８．適切な容器内におよび／または適切な装置の形で主として、 ・一連の定量または検出されるタイプのＤＮＡまたはＲＮＡの完全な微生物の検 定された既知の濃度、または前記微生物の既知の濃度に対応するＤＮＡまたはＲ ＮＡの濃度、 ・対象および標準微生物のＤＮＡまたはＲＮＡのＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたはＮ ＡＳＢＡによるものを始めとする、抽出、顕色および／または逆転写および／ま たは増幅の手段、 ・対象および標準微生物、あるいは顕色あるいは増幅生成物のＤＮＡまたはＲＮ Ａ分析のための手段： とから成るＤＮＡまたはＲＮＡ微生物の定量または検出のためのキットまたは手 段のセット。 ９．微生物数の単純な直接測定のための手段を含むことを特徴とする請求項８に 記載のキットまたは手段のセット。 １０．増幅効果、またはＲＴに結びつく増幅効果の対照として好適には異種プラ スミドのＤＮＡまたは異種転写産物のＲＮＡの形の、配列やプライマーが対象Ｄ ＮＡまたはＲＮＡとは無関係な、内部対照添加をさらに含むことを特徴とする請 求項８または９のいずれか一つに記載のキットまたは手段のセット。 １１．全ての媒体または標本内の微生物の定量化のための、または微生物の測定 可能最小量、またはそれを超える量の検出のための請求項１から７のいずれか一 つに記載の方法の使用。 １２．全ての媒体または標本内の微生物の定量化のための、または微生物の測定 可能最小量、またはそれを超える量の検出のための請求項８から１０のいずれか 一つに記載のキットまたはセットの使用。