CN114958980A

CN114958980A - 一种检测hiv基因组拷贝数的方法

Info

Publication number: CN114958980A
Application number: CN202110189319.3A
Authority: CN
Inventors: 黄维金; 王佑春; 赵晨燕; 周泽华; 张新禹
Original assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Current assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Priority date: 2021-02-19
Filing date: 2021-02-19
Publication date: 2022-08-30

Abstract

本发明涉及一种检测待测样品中HIV基因组拷贝数的方法以及一种数字PCR检测结果的评价方法，本发明还涉及一种试剂盒以及细胞组合的用途。本申请的方法克服了数字PCR存在不稳定结果的问题，能够对数字PCR进行质量控制。

Description

一种检测HIV基因组拷贝数的方法

技术领域

本发明涉及生物学，具体涉及一种检测待测样品中HIV基因组拷贝数的方法以及一种数字PCR检测结果的评价方法，本发明还涉及一种试剂盒以及细胞组合的用途。

背景技术

治愈HIV的主要障碍是病毒在血液和不同解剖部位建立稳定的持续感染细胞库。这些库长期存在，可以大致分为两种。在“潜伏库”中，细胞携带着一个完整的病毒基因组，该基因组不表达病毒转录本或蛋白质。这些潜伏的原病毒不受ART影响，也不被免疫系统清除；然而，在刺激后，它们可以恢复到病毒生产状态。目前消除潜伏库的方法就是逆转病毒的潜伏期，从而消除受感染的细胞，这种方法被称为“震杀”。除了潜伏库，“活性库”是一群转录活性细胞，产生HIV-1相关的RNA、蛋白质和可能的病毒粒子，这些可以在艾滋病毒感染者(PWH)中检测到。消除这两种病毒储存库是实现功能性治愈的重点，测量病毒储存库的大小是消除病毒储存库的前提。

HIV-1在活化的CD4+T细胞中复制良好，潜伏感染被认为只发生在静止的CD4+T细胞。当受感染的CD4+淋巴细胞在HIV-1的细胞病变作用下存活，逃避免疫系统并携带完整的前病毒返回到静息记忆状态时，就可能形成一个稳定的病毒储存库。由于记忆细胞的生物学功能是持续很长一段时间，以允许对先前遇到过的抗原再刺激作出反应，而且由于这些细胞中的病毒DNA是稳定整合的，这些潜伏感染的记忆细胞会成为HIV-1的长期病毒储存库。目前，已有人通过测量HIV-1病毒的DNA含量来测量病毒储存库的大小并提供了解释，而且当细胞数量有限时，由于其他方法对定量测量不够敏感，测量HIV-1病毒的DNA含量可能是唯一的化验方法。因为整合后潜伏期被认为是病毒持续存在的主要形式，所以整合HIV-1DNA的含量水平会提供比较准确的病毒库大小的测量结果。

然而，当前可用的数字PCR平台都会受到假阳性分区的影响(Bosman KJ,NijhuisM,van Ham PM,Wensing AMJ,Vervisch K,Vandekerckhove L,et al.Comparison ofdigital PCR platforms and semi-nested qPCR as a tool to determine the size ofthe HIV reservoir.Sci Rep.2015；5:13811.)，例如在国外研究者的一次HIV-1RNA检测中，每3孔阴性对照中就有1孔有2～3个阳性液滴。当检测HIV-1DNA含量更低的样本时，这种影响会更大，比如PBMCs、全血、干血点或组织活检。并且，在该文献中还提到，假阳性会导致将待测样本确认为HIV感染样本的错误结果，并继续进行ART(抗反转录病毒治疗)，如果意欲区分待测样本中是否存在HIV DNA，则不建议使用数字PCR。

因此，为了解决上述问题，本申请意在提供一种能够利用数字PCR稳定、准确检测HIV-1基因组拷贝数的方法。

发明内容

本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，解决了数字PCR中存在的结果不稳定问题。分别对细胞计数和数字PCR的检测结果进行相关性分析，获得了准确的检测结果。

因此，在第一方面，本申请提供了一种检测待测样品中HIV基因组拷贝数的方法：

(a)提供含有单拷贝HIV基因组的细胞以及待测样品，提取所述细胞中的核酸以及待测样品中的核酸，将所述细胞中的核酸称为第一核酸，将所述待测样品中的核酸称为第二核酸；

(b)通过数字PCR检测第一核酸和第二核酸的拷贝数；

(c)对所述细胞进行计数；

(d)计算细胞计数的数值与第一核酸的拷贝数的数值的比值；当所述比值处于0.7至1.3的范围内时，获得的第二核酸的拷贝数即为HIV的拷贝数。

在本文中，含有单拷贝HIV基因组的细胞不仅包括单个的体细胞，体细胞群，分离的单个血细胞或血细胞群，还包括各种人工制备或工业构建的细胞。

在第二方面，本申请提供了一种数字PCR检测结果的评价方法：

(a)提供含有单拷贝靶核酸的细胞以及待测样品，提取所述细胞中的靶核酸以及待测样品中的靶核酸，将所述细胞中的靶核酸称为第一核酸，将所述待测样品中的靶核酸称为第二核酸；

(b)通过数字PCR检测第一核酸和第二核酸的拷贝数；

(c)对所述细胞进行计数；

(d)计算细胞计数的数值与第一核酸的拷贝数的数值的比值；当所述比值处于0.7至1.3的范围内时，表明该数字PCR检测结果准确，获得的第二核酸的拷贝数即为待测样品中靶核酸的拷贝数。

在本文中，含有单拷贝靶核酸的细胞不仅包括单个的体细胞，体细胞群，分离的单个血细胞或血细胞群，还包括各种人工制备或工业构建的细胞。

在某些实施方案中，所述细胞选自8E5，J-lat6.3，J-lat8.4，J-lat9.2，J-lat15.4，J-lat5A8中的任意一种或几种。在某些实施方案中，所述细胞为8E5细胞。

在某些实施方案中，待测样品选自细胞(例如，离体的体细胞或体细胞群，分离的血细胞或血细胞群)，血浆，血清，全血中的一种或多种。

在某些实施方案中，所述待测样品获自哺乳动物(例如，人)。

在某些实施方案中，第一核酸包括DNA和/或RNA。

在某些实施方案中，第二核酸包括DNA和/或RNA。

在某些实施方案中，当所述比值处于0.8至1.2的范围内时，获得的第二核酸的拷贝数即为待测样品的拷贝数。在某些实施方案中，当所述比值处于0.9至1.1的范围内时，获得的第二核酸的拷贝数即为待测样品的拷贝数。

在某些实施方案中，所述数字PCR选自微滴式数字PCR或芯片式数字PCR。

在某些实施方案中，所述HIV为HIV-1和/或HIV-2。

在某些实施方案中，其中，针对每一种核酸中的HIV基因组，还提供至少一个检测探针，所述检测探针包含特异性杂交于所述HIV基因组的核苷酸序列并且能够与所述核酸中的HIV基因组的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。

在某些实施方案中，针对第一核酸提供第一探针，针对第二核酸提供第二探针，且第一探针与第二探针不相同或者相同。

在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成。

在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团。在某些实施方案中，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离。

在某些实施方案中，所述检测探针中的报告基团各自独立地为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL Fluor Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)。

在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地不具有或者具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链不包含或者包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-O-氨基丙基修饰，2'-O-烷基修饰，2'-O-烯丙基修饰，2'-O-丁基修饰，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰。

在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地是线性的，或者具有发夹结构。

在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团。在某些实施方案中，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在。

在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地具有3'-OH末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。

在某些实施方案中，所述检测探针的序列如SEQ ID NO:3所示。

在某些实施方案中，其中，针对每一种核酸中的HIV基因组，还提供至少一对能够扩增所述HIV基因组的引物组。

在某些实施方案中，所述引物组包含至少一条正向引物和/或至少一条反向引物。

在某些实施方案中，针对第一核酸提供第一引物组，针对第二核酸提供第二引物组，且第一引物组与第二引物组不相同或者相同。

在某些实施方案中，所述正向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

在某些实施方案中，所述反向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

在某些实施方案中，所述引物组的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

在第三方面，本申请提供了一种试剂盒，其包括：含有单拷贝HIV-1基因组的细胞，以及用于数字PCR的试剂。

在某些实施方案中，所述细胞选自8E5，J-lat6.3，J-lat8.4，J-lat9.2，J-lat15.4，J-lat5A8中的一种或几种。

在某些实施方案中，所述试剂盒还含有选自用于细胞计数的试剂，用于实时荧光定量PCR的试剂，用于进行核酸扩增的试剂中的一种或几种。

在某些实施方案中，所述用于数字PCR的试剂选自包括选自下列的一种或多种组分：用于制备微液滴样本的试剂，用于进行核酸扩增的试剂，核酸聚合酶，用于检测微液滴样本的试剂，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述用于实时荧光定量PCR选自包括选自下列的一种或多种组分：用于进行核酸扩增的试剂，核酸聚合酶，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述用于细胞计数的试剂选自细胞染色的试剂，还原剂，缓冲液，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs(标记或未标记的)、水、包含离子(例如Mg²⁺)的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于检测待测样品中HIV基因组拷贝数，或者，用于数字PCR检测结果的评价。

在某些实施方案中，所述HIV为HIV-1和/或HIV-2。

在某些实施方案中，其中，针对每一种核酸中的HIV基因组，还提供至少一个检测探针，所述检测探针包含特异性杂交于所述HIV基因组的核苷酸序列并且能够与所述核酸中的HIV基因组的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

在某些实施方案中，所述检测探针的序列如SEQ ID NO:3所示。

在某些实施方案中，在进行数字PCR反应时，在退火或延伸过程中，所述第一探针将与所述靶核酸中的HIV基因组形成双链体，并在扩增期间被核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)所降解，释放报告基团(例如荧光基团)。由此，在数字PCR扩增反应结束后，通过微滴检测仪对各微滴的终点荧光进行检测，根据游离的第一报告基团(例如第一荧光基团)的信号(例如第一荧光信号)强度，即可确定阳性微滴和阴性微滴数，从而确定样品中具有的HIV基因组的量。

在本申请的方法中，HIV基因组的拷贝数量可根据泊松分布原理，由数字PCR平台检测并通过软件直接输出，其相关原理及计算方法可参见例如，Milbury CA,Zhong Q,LinJ,et al.Determining lower limits of detection of digital PCR assays forcancer-related gene mutations.Biomol Detect Quantif.2014；1(1):8-22.Published2014Aug 20.doi:10.1016/j.bdq.2014.08.001。

在某些实施方案中所述反向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。

(4)所述引物组的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

在第三方面，本申请提供了细胞组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测待测样品中HIV基因组拷贝数，或者，用于数字PCR检测结果的评价。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于实施如前任一项所描述的方法。

在某些实施方案中，所述细胞组合选自8E5，J-lat6.3，J-lat8.4，J-lat9.2，J-lat15.4，J-lat5A8中的任意两种或几种。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“人免疫缺陷病毒(HIV)”为慢病毒属的成员，慢病毒属为逆转录病毒科的组成部分。HIV的两个种感染人类：HIV-1和HIV-2。HIV-1为最常见的HIV病毒株，并且已知比HIV-2更具致病性。如本文所用，术语“HIV”是指HIV-1和HIV-2，但不限于此。

如本文中所使用的，术语“单拷贝”是指某一基因或基因组在细胞或待测样本中的数目为1。如本文中所使用的，术语“单拷贝HIV基因组”是指HIV基因组的拷贝数为1。

如本文中所使用的，并且如本领域技术人员通常理解的，术语“正向”和“反向”仅仅是为了便于描述和区分一个引物对中的两条引物；它们是相对而言的，并不具有特别的含义。

如本文中所使用的，检测探针中能够与所述核酸分子的指定区域特异性杂交的序列也称为“靶向序列”或“靶特异性序列”，术语“靶向序列”和“靶特异性序列”是指，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，能够与靶核酸序列选择性/特异性杂交或退火的序列，其包含与靶核酸序列互补的序列。在本申请中，术语“靶向序列”和“靶特异性序列”具有相同的含义，并且可互换使用。易于理解的是，靶向序列或靶特异性序列对于靶核酸序列是特异性的。换言之，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，靶向序列或靶特异性序列仅与特定的靶核酸序列杂交或退火，而不与其他的核酸序列杂交或退火。

如本文中所使用的，术语“杂交”和“退火”意指，互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。通常，完全互补或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件，特别是温度。

如本文中所使用的，术语“协作标定”是指在多个具有同等能力的实验室间，使用一个或多个法定方法，各实验室所得实验数据按统计程序处理后，得到药品标准物质的特性值。

如本文中所使用的，术语“数字PCR”是用于检测和定量核酸的生物学方法。与常规的qPCR相比，其能够精确地定量分析和高灵敏度地检测靶核酸分子。数字PCR基本原理是将一个样本分成几十到几万份，然后再将其分配到不同的反应单元中，使每个微滴单元包含一个或多个拷贝的核酸分子(即DNA模板)，每个单元都会对目标分子进行扩增，然后再对每个单元进行荧光信号的统计并计算。相对而言，传统PCR或qPCR反应都是发生于同一体系当中，这也是数字PCR与其最大的区别。数字PCR采用直接计数的方法进行定量分析，即在PCR扩增结束后有荧光信号的反应单元记为1，无荧光信号记为0，有荧光信号的单元说明至少含有一个拷贝的目标分子。如果没目标DNA浓度极低的情况下，理论上可以认为有荧光的单元数目就等于DNA分子的拷贝数，但通常情况下，数字PCR的反应单元中可能会包含两个甚至以上的目标分子，因此需要采用泊松概率分布公式来进行计算。根据泊松分布的原理，目标分子的拷贝数可以通过公式C＝-ln[(N-F)/N]*M计算，可解决多个目标分子存在于单个液滴中的可能性。泊松概率分布公式为P(X＝k)＝(λ^k/k！)^-λ，k＝0，1，2，3，4，5…。公式中λ为每个反应单元中所含目标DNA的平均拷贝数(浓度)；λ由样本的稀释倍数M决定，样本的原始拷贝数(浓度)为C，有C＝λM；P为在一定的条件(λ条件)下，每个反应单元中所含k个拷贝目标分子的概率；因此当k＝0时，以上公式可简化为：P＝e–λ＝e-C/M；P可以看做是无荧光信号的反应单元数(N-F)与反应单元数N的比值(F为有荧光信号的反应单元数)：(N-F)/N＝e-C/M；两边去对数In得到：C＝-In[(N-F)/N]*M。

发明的有益效果

与现有技术相比，本申请利用含有单拷贝的HIV基因组的细胞(例如，8E5细胞)作为数字PCR的标准品，由此提供了利用数字PCR准确测定HIV拷贝数的方法，并且，该方法解决了数字PCR一直存在的结果不稳定的问题，能够对数字PCR进行质量控制。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了细胞标准品的稳定性测试结果。其中，图1A为标准品于4℃保存0h，8h，16h和24h之后的细胞数量；图1B为标准品于-20℃保存0d和90d之后的细胞数量；图1C为标准品反复冻融2次前后的细胞数量。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的生物化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:A PRACTICALAPPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))。

另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

使用的材料：细胞8E5(ATCC Number:CRL-8993)由中国食品药品检定研究院细胞室提供；FBS购自PANSERATECH；DMSO购自Sigma；DMEM完全培养基与PBS缓冲液购自Hyclone；细胞培养瓶与冻存管购自Corning。

使用的仪器设备：二氧化碳培养箱(NuAire,NU+5180E)；细胞计数仪(Roche,CedexXS)。

实施例1.8E5细胞标准品的制备以及测试

1.实验步骤

1.1标准品制备

取1支冻存的8E5细胞，37℃水浴解冻，待细胞完全化开后室温，1000rpm离心5分钟，弃掉冻存液，用1640+10％FBS培养基重悬转移至T25细胞培养瓶并补培养基至5ml置于二氧化碳培养箱37℃培养。扩增细胞至10个T225培养瓶后按上述条件离心，之后用30mlPBS+10％DMSO溶液重悬，吸取一点细胞悬液利用细胞计数仪计数进行含量分析。

1.2标准品分装

用PBS+10％DMSO溶液将8E5细胞稀释至1.00×10⁷个/ml，用分装误差小于1‰的分装器分装至进口冻存管，每管1ml，于-20℃保存。

1.3HIV-1前病毒细胞定量检测标准品协作标定

1.3.1HIV-1前病毒细胞定量检测标准品标定方法：对标准品进行细胞计数测定标准品的细胞含量。从-20℃取出标准品并解冻，上下颠倒混匀后取出一部分，用PBS稀释十倍后进行细胞计数。每次测定取一支标准品，记录10次结果。进行5次独立实验，并记录下每次计数结果并取均值。

1.3.2协作标定及统计分析：协作标定由中国食品药品检定研究院、北京民海生物科技有限公司、北京科兴生物制品有限公司3个相互独立的实验室按上述方法分别进行，对每次独立实验的结果取均数进行单因素方差分析，对标准品进行赋值。

1.4均匀性实验

均匀性是标准品的一个基本属性，我们按照《生物制品标准物质稳定性、均匀性检验操作规程》(SOP编号：NIFDC-SOP-S-5104)进行分装均匀性考察。随机抽取5个标准品，每个样品进行细胞计数3次。采用单因素方差分析进行均匀性检验的评价。

1.5稳定性实验

稳定性也是标准品的另一个基本属性，依照中检院《生物制品标准物质稳定性、均匀性检查标准操作规程》(SOP编号：NIFDC-SOP-S-M-5104)中规定：标准物质应在规定的存储或使用条件下，定期进行待定特性量值的稳定性检测，可以通过不同温度的加速稳定性试验、实时稳定性试验和冻融稳定性试验进行。随机抽取10支标准品，5支一组分为两组。一组放置于4℃下24h；另一组放置于-20℃下90d。观察样品中8E5细胞数量的稳定性。使用细胞计数的方法测定。采用t检验法对稳定性检验进行评价。

观察反复冻融处理对样品细胞含量检测的影响时，随机抽取5个样品，分别在室温和-20℃两个条件下放置，模拟冻融实验，反复冻融2次。分别检测冻融前、冻融后的细胞数量。采用t检验进行稳定性评价。

2.实验结果

2.1HIV-1前病毒细胞定量检测标准品的协作标定

本次协作标定，三家实验室测定总数为150次。对各组独立实验数据均值进行检验，经单因素方差分析显示，在0.05显著水平时，样品中8E5细胞数是均匀的。最终为标准品进行了赋值，标准品浓度为：1.03×10⁷个/ml±0.14×10⁷个/ml。见表1和表2。

表1.各实验室协作标定数据

表2.检测结果统计量汇总表

2.2HIV-1前病毒细胞定量检测标准品的均匀性

经单因素方差分析显示，在0.05显著水平时，标准品中8E5细胞数是均匀的，见表3和表4。

表3.均匀性检验结果

表4.样品的均匀性检验方差分析结果

2.3HIV-1前病毒细胞定量检测标准品的稳定性

t检验结果表明，对于-20℃存放90d的标准品进行分析，标准品的细胞数量差异未发生显著变化；4℃放置24h，标准品的细胞数量差异无统计学意义，表明标准品存放于-20℃长期保存或短暂于4℃保存，稳定性良好(参见图1A和图1B)。反复冻融前后，标准品细胞数量差异无统计学意义，稳定性好(参见图1C)。

实施例2.数字PCR方法

本实施例通过建立灵敏度好，特异性强的HIV前病毒DNA数字PCR检测方法，对数字PCR检测到的HIV基因拷贝数与8E5细胞计数的相关性进行分析。通过对不同浓度的8E5细胞同时进行细胞计数，并将结果与HIV基因拷贝数的数字PCR检测结果相比较，测定两种结果的数值比值接近1，证明了两种方法的相关性非常好。

由于数字PCR容易出现假阳性使结果不准确的特点，引入8E5细胞可作为质量控制，若细胞数量以及相关性良好，则可以证明数字PCR实验系统没有问题。必要时也可赋值消除重复实验间的误差。

1、数字PCR实验方法

(1)DNA提取

按照实施例1所描述的方法，将验证过均匀性和稳定性的8E5细胞平衡至室温，梯度系列稀释细胞，依照试剂盒说明书用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒对感染者血样及梯度稀释标准品进行DNA提取，细胞用量200ul，DNA溶于40ul TE缓冲液中，-20℃冻存备用。

(2)数字PCR扩增

使用NaicaTM Crystal Digital PCR System进行数字PCR扩增。

表5.引物及探针的具体序列

名称	序列(5‘-3’)	3’端	5’端	SEQ ID NO:
					HIV1-F	TTGCCTTGAGTGCTTCA	/	/	1
HIV1-R	GGGTCTGAGGGATCTCT	/	/	2
					HIV1-P	CACAACAGACGGGCACACAC	HEX	BHQ-1	3

(3)相关系数计算公式

血样中HIV-1基因拷贝数等于数字PCR测出拷贝数/系数(本实验室约为0.9)。

(4)结果有效性判定

同一批次实验结果中，HIV-1阴性对照扩增结果为阴性，而内参基因扩增结果为阳性；细胞提取后的阳性样本HIV-1基因和扩增均为阳性且空白水对照二者扩增均为阴性；梯度稀释标准品拷贝数线性关系良好且血样拷贝数落在曲线范围内；同时满足上述条件确定为本次结果有效。

2、细胞计数实验方法

本科室细胞计数仪型号为Roche Cedex XS。

(1)启动Cedex XS系统

打开仪器，再打开Cedex XS控制软件，拉出样板支架后点击HWM键，再点击WHITEBALANCE键调节白平衡，关闭对话框。

(2)细胞计数与活性测定

用培养基或PBS将样品稀释至细胞数不高于5×10⁶/ml，使用0.2％台盼蓝染色(加入10ul，与细胞1：1混匀后加入样品板，每槽10ul。将样品放到支架上推入计数仪，有少许卡扣感表示已就位。打开测定界面设置样品参数:样品量、台盼蓝用量和稀释剂用量。设置完成后点击START MEARSUREMENT键开始测量，在测定界面获得结果。

3、实验结果

(1)数字PCR的质量评估

对不同浓度的细胞同时进行细胞计数，并和相应的数字PCR结果进行比较分析，结果如表6所示。

表6.细胞计数结果与数字PCR结果

由于8E5细胞携带单拷贝的HIV-1缺陷基因组，并且，上述两种检测结果的比值接近1，证明了两种方法的相关性非常好。因此，证实了该数字PCR检测结果准确且稳定。

由于数字PCR不稳定的特点，引入标准品可作为质量控制，若标准曲线相关性良好，则实验系统没有问题。也可以根据系数把拷贝数反应到细胞水平。

(2)待测样本的拷贝数

通过上述方法所测得的待测样本的拷贝数结果如表7所示。

表7.通过数字PCR测得血液样本中的HIV-1整合基因拷贝数

样品	上样(ul)	总微滴数	HIV-1-HEX(copies/ul)
				样品1	2	26865	172.5
样品2	2	29474	167.5
				样品3	2	23631	52.4
样品4	2	26488	75
				样品5	2	28745	41.6
样品6	2	27722	26.1
				样品7	2	28855	62.3
样品8	2	28726	46.1

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国食品药品检定研究院

<120> 一种检测HIV基因组拷贝数的方法

<130> IDC210004

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 1

ttgccttgag tgcttca 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物

<400> 2

gggtctgagg gatctct 17

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 探针

<400> 3

cacaacagac gggcacacac 20

Claims

1.一种检测待测样品中HIV基因组拷贝数的方法：

(b)通过数字PCR检测第一核酸和第二核酸的拷贝数；

(c)对所述细胞进行计数；

2.一种数字PCR检测结果的评价方法：

(b)通过数字PCR检测第一核酸和第二核酸的拷贝数；

(c)对所述细胞进行计数；

(d)计算细胞计数的数值与第一核酸的拷贝数的数值的比值；当所述比值处于0.7至1.3的范围内时，表明该数字PCR检测结果准确，获得的第二核酸的拷贝数即为靶核酸的拷贝数。

3.权利要求1或2的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述细胞选自8E5，J-lat6.3，J-lat8.4，J-lat9.2，J-lat15.4，J-lat5A8中的任意一种或几种；优选地，所述细胞为8E5细胞；

(2)待测样品选自细胞(例如，离体的体细胞或体细胞群，分离的血细胞或血细胞群)，血浆，血清，全血中的一种或多种；

(3)所述待测样品获自哺乳动物(例如，人)；

(4)第一核酸包括DNA和/或RNA；

(5)第二核酸包括DNA和/或RNA；

(6)当所述比值处于0.8至1.2的范围内时，获得的第二核酸的拷贝数即为待测样品的拷贝数；优选地，当所述比值处于0.9至1.1的范围内时，获得的第二核酸的拷贝数即为待测样品的拷贝数；

(7)所述数字PCR选自微滴式数字PCR或芯片式数字PCR；

(8)所述HIV为HIV-1和/或HIV-2。

4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中，针对每一种核酸中的HIV基因组，还提供至少一个检测探针，所述检测探针包含特异性杂交于所述HIV基因组的核苷酸序列并且能够与所述核酸中的HIV基因组的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)针对第一核酸提供第一探针，针对第二核酸提供第二探针，且第一探针与第二探针不相同或者相同；

(2)所述检测探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成；

(3)所述检测探针各自独立地为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离；

(4)所述检测探针中的报告基团各自独立地为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL Fluor Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL Fluor Red610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；

(5)所述检测探针各自独立地不具有或者具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链不包含或者包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'-O-氨基丙基修饰，2'-O-烷基修饰，2'-O-烯丙基修饰，2'-O-丁基修饰，和1-(4'-硫代-PD-呋喃核糖基)修饰；

(6)所述检测探针各自独立地是线性的，或者具有发夹结构；

(7)所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团；优选地，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；

(8)所述检测探针各自独立地具有3'-OH末端；或者，所述检测探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端；

(9)所述检测探针的序列如SEQ ID NO:3所示。

5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，针对每一种核酸中的HIV基因组，还提供至少一对能够扩增所述HIV基因组的引物组；

优选地，所述引物组包含至少一条正向引物和/或至少一条反向引物；

更优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)针对第一核酸提供第一引物组，针对第二核酸提供第二引物组，且第一引物组与第二引物组不相同或者相同；

(2)所述正向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(3)所述反向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(4)所述引物组的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

6.一种试剂盒，其包括：含有单拷贝HIV-1基因组的细胞，以及用于数字PCR的试剂；

优选地，所述细胞选自8E5，J-lat6.3，J-lat8.4，J-lat9.2，J-lat15.4，J-lat5A8中的一种或几种；

优选地，所述试剂盒还含有选自用于细胞计数的试剂，用于实时荧光定量PCR的试剂，用于进行核酸扩增的试剂中的一种或几种；

优选地，所述试剂盒具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述用于数字PCR的试剂选自包括选自下列的一种或多种组分：用于制备微液滴样本的试剂，用于进行核酸扩增的试剂，核酸聚合酶，用于检测微液滴样本的试剂，或其任何组合；

(2)所述用于实时荧光定量PCR选自包括选自下列的一种或多种组分：用于进行核酸扩增的试剂，核酸聚合酶，或其任何组合；

(3)所述用于细胞计数的试剂选自细胞染色的试剂，还原剂，缓冲液，或其任何组合；

优选地，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs(标记或未标记的)、水、包含离子(例如Mg²⁺)的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合；

优选地，所述试剂盒用于检测待测样品中HIV基因组拷贝数，或者，用于数字PCR检测结果的评价；

优选地，所述数字PCR选自微滴式数字PCR或芯片式数字PCR；

优选地，所述HIV为HIV-1和/或HIV-2。

7.权利要求6所述的试剂盒，其中，针对每一种核酸中的HIV基因组，还提供至少一个检测探针，所述检测探针包含特异性杂交于所述HIV基因组的核苷酸序列并且能够与所述核酸中的HIV基因组的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；

优选地，所述试剂盒具有选自下列的一个或多个技术特征：

(6)所述检测探针各自独立地是线性的，或者具有发夹结构；

(9)所述检测探针的序列如SEQ ID NO:3所示。

8.权利要求6或7所述的试剂盒，其中，针对每一种核酸中的HIV基因组，还提供至少一对能够扩增所述HIV基因组的引物组；

更优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(4)所述引物组的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

9.细胞组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测待测样品中HIV基因组拷贝数，或者，用于数字PCR检测结果的评价；

优选地，所述试剂盒用于实施权利要求1-5任一项所描述的方法；

优选地，所述细胞组合选自8E5，J-lat6.3，J-lat8.4，J-lat9.2，J-lat15.4，J-lat5A8中的任意两种或几种。