CA2236842A1 - Procede et kit pour la quantification et la detection des micro-organismes - Google Patents
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Abstract
Dans le procédé selon l'invention, on utilise en tant qu'étalon externe des quantités données du micro-organisme concerné ou de l'ADN ou ARN de ce microorganisme; et après extraction, révélation au moyen d'une méthode spécifique ou rétrotranscription et/ou amplification d'une fraction du génome dudit microorganisme, on effectue une comparaison des concentrations d'ADN ou d'ARN des micro-organismes étalon et cible ou des produits d'amplification des microorganismes cible avec ceux de l'étalon externe, pour en déduire les valeurs de la concentration d'ADN ou d'ARN ou de la concentration en micro-organisme totale dans chaque échantillon de micro-organisme cible. Application à la quantification et la détection de tous les micro-organismes.
Description
CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 PROCEDE ET KIT POUR LA QUANTIFICATION ET LA DETECTION DES
MICRO-ORGANISMES
La présente invention concerne la quantification et la détection des micro-organismes. Elle concerne plus particulièrement le dosage quantitatif et/ou la détection des micro-organismes porteurs d'un génome à ADN ou à ARN.
L~invention s'applique à tous les micro-organismes connus, tels que des virus, bactéries, bacilles, protozoaires, hématozoaires, porteurs d'un génome à ADN ou à ARN, touchant l'homme, l'animal ou les végétaux, ainsi qu'aux micro-organismes tels ~u'ils existent chez l'homme, les animaux et les végétaux, en état pathologique ou normal; elle s'appli~ue également à la quantification et la détection de ces memes micro-organismes dans les produits issus des animaux, y compris l'homme, et des végétaux, de meme que de ceux susceptibles d'exister dans l'eau.
La méthode selon l'invention est décrite plus loin pour la quantification de l'infection par le virus à ARN
de l'immunodéficience humaine (VIH) et de l'infection par le virus de l'hépatite B à ADN humain (VHB).
L'étude de l'épidémiologie, le traitement et la prophylaxie des pathologies humaines, animales et végétales sont de nos jours un objectif prioritaire de la médecine humaine et vétérinaire et de l'agronomie ou de l'industrie phytosanitaire. L'identification et la quantification des micro-organismes dans des milieux tels que par exemple les tissus, les fluides biologiques et les préparations in vitro sont des étapes indispensables à la bonne conduite de tels projets. Compte tenu de la taille de la plupart des micro-organismes, notamment des virus, et de leur concentration dans les milieux biologiques (en général de l~ordre de lol à 1012 micro-organismes/ml), CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 seuls les outils technologi~ues actuels faisant appel à
l'amplification de fragments de génomes permettent à la fois l'identification moléculaire et une évaluation quantitative. La méthode d'amplification génomi~ue la plus utilisée actuellement est dénommée amplification en chaîne par polymérase ou ACP (en anglais polymerase chain reaction ou PCR). Grâce à une enzyme, la polymérase, il est ainsi possible d'amplifier un fragment de génome à
ADN. De même, on peut réaliser une rétrotranscription (ou transcription réverse) d'ARN en ADN et une amplification grâce au couple transcriptase réverse + polymérase ou à
une enzyme réalisant les deux opérations. Une fois amplifié, ce morceau de génome ou amplificat est spécifi~uement identifié par différentes méthodes (sonde radioactive ou colorée, taille du fragment).
Des méthodes de quantification de VIH par ACP sont par exemple décrites par Holodniy M. et al., dans J.
Infect. Dis. 163, 862-866 (1991); Aoki-Sei S. et al., dans J. AIDS Res. Hum. Retrovirus 8, 1263-1270 (1992);
Bagnarelli P. et al., dans J. Virol. 66, 7328-7335 (1992);
Piatak Jr. M. et al., dans Science 259, 1749-1755 (1993);
Bruisten S.M. et al., dans AIDS 7 (suppl. 2), S15-S20 (1993).
Des méthodes de quanti~ication d'ARN du virus de l'hépatite C ont été décrites par exemple par Kumar U. et al., dans J. Virol. Methods 47(1-2), 95-102 (1994); Manzin A. et al., dans J. Clin. Microbiol. 32(8), 1939-44 (1994);
Ravaggi A. et al., J. Clin. Microbiol. 33(2), 265-9 (1995); Young K.K. et al., J. Clin. Microbiol. 33(3), 654-7 (1995).
Des méthodes de quanti~ication d'ADN du virus del'hépatite B ont été décrites par exemple par Lehtovaara P. et al., dans PCR Methods Appl. 3(3), 169-75 (1993); Wu J. et al., dans J. Virol. Methods g9(3), 331-41 (1994);
Zaaijer H.L. et al., dans J. Clin. Microbiol. 32(9), 2088-CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 91 (1994); Kaneko S. et al., dans J. Clin. Microbiol.
27(9), 1930-33 (198g).
Cependant, la relation entre le produit amplifié et l'ADN ou l'ARN initial n'est réellement pas vraiment constante d'une expérience à l'autre, d'où la nécessité de se préoccuper du problème de la mesure d'un étalon dont les concentrations sont connues par ailleurs.
Les capacités d'amplification de l'ACP ont pu être évaluées jusqu'ici grâce à des cellules n'ayant le génome à doser qu'en un nombre constant d'exemplaires ou à des plasmides comportant chacun un unique morceau de gène. Il a ainsi pu être établi que même un seul fragment de gène peut, grâce à l'ACP, être spécifiquement identifié. On a également établi qu'il existait un rapport de proportionnalité entre des concentrations d'ADN d'un plasmide soumises à amplification et les concentrations d'ADN mesurées après amplification. Cependant ce rapport de proportionnalité s'est avéré changer d'une expérience à
l'autre, car l'amplification par ACP est un processus biologique, résultant de l'action de la polymérase, qui n'est pas maîtrisé de façon aussi complète que le serait une technique purement physique.
Cela a conduit les chercheurs et les ingénieurs des firmes de biotechnologie à introduire un étalonnage dans chaque expérience de quantification virale. Jusqu'à
présent, l'étalon est constitué d'une série de concentrations (trois à cinq en général) d'un plasmide étalon dont le fragment d'ADN à ampli~ier a les mêmes amorces et est selon les technologies de séquence partiellement différente ou de séquence identique. Le rapport dlamplification de l'ADN de concentrations égales de deux plasmides à amorces identiques, mais de longueur et donc de séquences différentes: 1) peut être différent d'un cas à l'autre et 2) n~est pas nécessairement CA 02236842 l998-o~-o~
identique à celui de l'ADN issu de concentrations identiques de virus natifs au sein de la même expérience.
Le problème est plus complexe encore si l'on cherche à quanti~ier ou à identi~ier des virus à ARN, tels que par exemple celui du SIDA (VIH). En e~~et, l'étape d'ampli~ication par ACP doit, pour les virus à ARN, être associée à une étape de rétrotranscription souvent réalisée soit gr~ce à une autre enzyme, la transcriptase réverse ou transcriptase inverse (en abrégé TR), soit grâce à une enzyme ayant les deux actions (de rétrotranscription et d'ampli~ication de l'ADN). Dans l'un et l'autre cas, les enzymes actuellement disponibles sur le marché permettent d'obtenir des rapports de rétrotranscription pouvant varier d'une expérience à
l'autre de 10 : 1 (c'est-à-dire que 10 copies d'ARN
donnent 1 copie d'ADN) à 100 : 1 (100 copies d'ARN donnent 1 copie d'ADN). Le problème qui en résulte, à savoir la non-comparabilité des résultats d'expériences sucessives, a jusqu'à présent été résolu par incubation simultanée d'une gamme de concentrations d'un ~ragment d'ARN étalon (transcrit étalon) utilisant les mêmes amorces, mais dont la partie ampli~iée est soit identique si on l'utilise en étalon externe, soit di~~érente, en séquence ou en longueur, si on l'utilise en coampli~ication, le transcrit étant alors incubé dans le même tube que l'ARN du micro-organisme cible à doser.
C'est ainsi que le document FR-A-2691162 décrit une méthode de dosage quantitati~, applicable spéci~iquement aux rétrovirus, comprenant l'utilisation comme étalon externe de concentrations de cultures de cellules in~ectées par des quantités déterminées dudit rétrovirus, titrées en leur protéine virale de ré~érence ou "protéine de core", notamment la protéine P24/25 ou P27 pour les virus VIHl ou VIH2.
F~UlL~F M¢DIF~EE
. . CA 02236842 1998-o~-o~
.
. 4a Il apparait malheureusement que les concentrations d'ampli~icats issus des mêmes concentrations de deux transcrits peuvent être dif~érentes et de même di~érentes de celles issues d'ARN provenant de ConcentratiQns identiques de virus.
En conclusion, - les techniques connues de rétrotranscription et/ou dlampli~ication ne donnent pas des résultats identiques d'une expérience à l'autre pour un même échantillon;
F~ L ~ C~ .L~
CA 02236842 1998-0~-0~
Wog7/1746s PCT~R96/01736 - un étalon s'impose, qui peut être soit interne, soit externe;
- un étalon externe composé soit d'un plasmide pour un micro-organisme à ADN, soit d'un ARN transcrit pour un micro-organisme à ARN, ne permet qu'une quantification relative, car le rapport d'amplification n'est pas nécessairement identique à celui de l'ADN ou de l'ARN du micro-organisme completi - un étalon interne coamplifié fait de plus intervenir des longueurs ou des séquences différentes du plasmide ou du transcrit et a les memes inconvénients qu'un étalon externe utilisant un plasmide ou un transcrit.
Dans l'état de la technique actuelle, l'amplification de l'ADN d'un plasmide n'est pas vraiment proportionnelle à celle subie par l'ADN viral. Quant à llétalon actuellement utilisé pour les virus à ARN, il s'agit d'un transcrit, qui a les memes inconvénients qu'un plamside et y ajoute la possibilité de dégradation d'ARN libre.
Il y avait donc un besoin pour des tests de quanti~ication et de détection de micro-organismes procurant des valeurs absolues du nombre de micro-organismes cible.
On a maintenant trouvé que l~on peut quantifier ou détecter de façon absolue et directe n'importe quel micro-organisme à ADN ou à ARN, à la condition:
(l) que l'on connaisse ou que l'on puisse déterminer parailleurs une concentration étalon du micro-organisme ou la concentration de l'ADN ou de l'ARN porté par ce micro-organisme, appelé micro-organisme étalon, et
WO97/17465 PCT~R96/01736 PROCEDE ET KIT POUR LA QUANTIFICATION ET LA DETECTION DES
MICRO-ORGANISMES
La présente invention concerne la quantification et la détection des micro-organismes. Elle concerne plus particulièrement le dosage quantitatif et/ou la détection des micro-organismes porteurs d'un génome à ADN ou à ARN.
L~invention s'applique à tous les micro-organismes connus, tels que des virus, bactéries, bacilles, protozoaires, hématozoaires, porteurs d'un génome à ADN ou à ARN, touchant l'homme, l'animal ou les végétaux, ainsi qu'aux micro-organismes tels ~u'ils existent chez l'homme, les animaux et les végétaux, en état pathologique ou normal; elle s'appli~ue également à la quantification et la détection de ces memes micro-organismes dans les produits issus des animaux, y compris l'homme, et des végétaux, de meme que de ceux susceptibles d'exister dans l'eau.
La méthode selon l'invention est décrite plus loin pour la quantification de l'infection par le virus à ARN
de l'immunodéficience humaine (VIH) et de l'infection par le virus de l'hépatite B à ADN humain (VHB).
L'étude de l'épidémiologie, le traitement et la prophylaxie des pathologies humaines, animales et végétales sont de nos jours un objectif prioritaire de la médecine humaine et vétérinaire et de l'agronomie ou de l'industrie phytosanitaire. L'identification et la quantification des micro-organismes dans des milieux tels que par exemple les tissus, les fluides biologiques et les préparations in vitro sont des étapes indispensables à la bonne conduite de tels projets. Compte tenu de la taille de la plupart des micro-organismes, notamment des virus, et de leur concentration dans les milieux biologiques (en général de l~ordre de lol à 1012 micro-organismes/ml), CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 seuls les outils technologi~ues actuels faisant appel à
l'amplification de fragments de génomes permettent à la fois l'identification moléculaire et une évaluation quantitative. La méthode d'amplification génomi~ue la plus utilisée actuellement est dénommée amplification en chaîne par polymérase ou ACP (en anglais polymerase chain reaction ou PCR). Grâce à une enzyme, la polymérase, il est ainsi possible d'amplifier un fragment de génome à
ADN. De même, on peut réaliser une rétrotranscription (ou transcription réverse) d'ARN en ADN et une amplification grâce au couple transcriptase réverse + polymérase ou à
une enzyme réalisant les deux opérations. Une fois amplifié, ce morceau de génome ou amplificat est spécifi~uement identifié par différentes méthodes (sonde radioactive ou colorée, taille du fragment).
Des méthodes de quantification de VIH par ACP sont par exemple décrites par Holodniy M. et al., dans J.
Infect. Dis. 163, 862-866 (1991); Aoki-Sei S. et al., dans J. AIDS Res. Hum. Retrovirus 8, 1263-1270 (1992);
Bagnarelli P. et al., dans J. Virol. 66, 7328-7335 (1992);
Piatak Jr. M. et al., dans Science 259, 1749-1755 (1993);
Bruisten S.M. et al., dans AIDS 7 (suppl. 2), S15-S20 (1993).
Des méthodes de quanti~ication d'ARN du virus de l'hépatite C ont été décrites par exemple par Kumar U. et al., dans J. Virol. Methods 47(1-2), 95-102 (1994); Manzin A. et al., dans J. Clin. Microbiol. 32(8), 1939-44 (1994);
Ravaggi A. et al., J. Clin. Microbiol. 33(2), 265-9 (1995); Young K.K. et al., J. Clin. Microbiol. 33(3), 654-7 (1995).
Des méthodes de quanti~ication d'ADN du virus del'hépatite B ont été décrites par exemple par Lehtovaara P. et al., dans PCR Methods Appl. 3(3), 169-75 (1993); Wu J. et al., dans J. Virol. Methods g9(3), 331-41 (1994);
Zaaijer H.L. et al., dans J. Clin. Microbiol. 32(9), 2088-CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 91 (1994); Kaneko S. et al., dans J. Clin. Microbiol.
27(9), 1930-33 (198g).
Cependant, la relation entre le produit amplifié et l'ADN ou l'ARN initial n'est réellement pas vraiment constante d'une expérience à l'autre, d'où la nécessité de se préoccuper du problème de la mesure d'un étalon dont les concentrations sont connues par ailleurs.
Les capacités d'amplification de l'ACP ont pu être évaluées jusqu'ici grâce à des cellules n'ayant le génome à doser qu'en un nombre constant d'exemplaires ou à des plasmides comportant chacun un unique morceau de gène. Il a ainsi pu être établi que même un seul fragment de gène peut, grâce à l'ACP, être spécifiquement identifié. On a également établi qu'il existait un rapport de proportionnalité entre des concentrations d'ADN d'un plasmide soumises à amplification et les concentrations d'ADN mesurées après amplification. Cependant ce rapport de proportionnalité s'est avéré changer d'une expérience à
l'autre, car l'amplification par ACP est un processus biologique, résultant de l'action de la polymérase, qui n'est pas maîtrisé de façon aussi complète que le serait une technique purement physique.
Cela a conduit les chercheurs et les ingénieurs des firmes de biotechnologie à introduire un étalonnage dans chaque expérience de quantification virale. Jusqu'à
présent, l'étalon est constitué d'une série de concentrations (trois à cinq en général) d'un plasmide étalon dont le fragment d'ADN à ampli~ier a les mêmes amorces et est selon les technologies de séquence partiellement différente ou de séquence identique. Le rapport dlamplification de l'ADN de concentrations égales de deux plasmides à amorces identiques, mais de longueur et donc de séquences différentes: 1) peut être différent d'un cas à l'autre et 2) n~est pas nécessairement CA 02236842 l998-o~-o~
identique à celui de l'ADN issu de concentrations identiques de virus natifs au sein de la même expérience.
Le problème est plus complexe encore si l'on cherche à quanti~ier ou à identi~ier des virus à ARN, tels que par exemple celui du SIDA (VIH). En e~~et, l'étape d'ampli~ication par ACP doit, pour les virus à ARN, être associée à une étape de rétrotranscription souvent réalisée soit gr~ce à une autre enzyme, la transcriptase réverse ou transcriptase inverse (en abrégé TR), soit grâce à une enzyme ayant les deux actions (de rétrotranscription et d'ampli~ication de l'ADN). Dans l'un et l'autre cas, les enzymes actuellement disponibles sur le marché permettent d'obtenir des rapports de rétrotranscription pouvant varier d'une expérience à
l'autre de 10 : 1 (c'est-à-dire que 10 copies d'ARN
donnent 1 copie d'ADN) à 100 : 1 (100 copies d'ARN donnent 1 copie d'ADN). Le problème qui en résulte, à savoir la non-comparabilité des résultats d'expériences sucessives, a jusqu'à présent été résolu par incubation simultanée d'une gamme de concentrations d'un ~ragment d'ARN étalon (transcrit étalon) utilisant les mêmes amorces, mais dont la partie ampli~iée est soit identique si on l'utilise en étalon externe, soit di~~érente, en séquence ou en longueur, si on l'utilise en coampli~ication, le transcrit étant alors incubé dans le même tube que l'ARN du micro-organisme cible à doser.
C'est ainsi que le document FR-A-2691162 décrit une méthode de dosage quantitati~, applicable spéci~iquement aux rétrovirus, comprenant l'utilisation comme étalon externe de concentrations de cultures de cellules in~ectées par des quantités déterminées dudit rétrovirus, titrées en leur protéine virale de ré~érence ou "protéine de core", notamment la protéine P24/25 ou P27 pour les virus VIHl ou VIH2.
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. 4a Il apparait malheureusement que les concentrations d'ampli~icats issus des mêmes concentrations de deux transcrits peuvent être dif~érentes et de même di~érentes de celles issues d'ARN provenant de ConcentratiQns identiques de virus.
En conclusion, - les techniques connues de rétrotranscription et/ou dlampli~ication ne donnent pas des résultats identiques d'une expérience à l'autre pour un même échantillon;
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CA 02236842 1998-0~-0~
Wog7/1746s PCT~R96/01736 - un étalon s'impose, qui peut être soit interne, soit externe;
- un étalon externe composé soit d'un plasmide pour un micro-organisme à ADN, soit d'un ARN transcrit pour un micro-organisme à ARN, ne permet qu'une quantification relative, car le rapport d'amplification n'est pas nécessairement identique à celui de l'ADN ou de l'ARN du micro-organisme completi - un étalon interne coamplifié fait de plus intervenir des longueurs ou des séquences différentes du plasmide ou du transcrit et a les memes inconvénients qu'un étalon externe utilisant un plasmide ou un transcrit.
Dans l'état de la technique actuelle, l'amplification de l'ADN d'un plasmide n'est pas vraiment proportionnelle à celle subie par l'ADN viral. Quant à llétalon actuellement utilisé pour les virus à ARN, il s'agit d'un transcrit, qui a les memes inconvénients qu'un plamside et y ajoute la possibilité de dégradation d'ARN libre.
Il y avait donc un besoin pour des tests de quanti~ication et de détection de micro-organismes procurant des valeurs absolues du nombre de micro-organismes cible.
On a maintenant trouvé que l~on peut quantifier ou détecter de façon absolue et directe n'importe quel micro-organisme à ADN ou à ARN, à la condition:
(l) que l'on connaisse ou que l'on puisse déterminer parailleurs une concentration étalon du micro-organisme ou la concentration de l'ADN ou de l'ARN porté par ce micro-organisme, appelé micro-organisme étalon, et
(2) que l'on compare la quantité du produit de la transcription réverse et/ou de l'amplification de l'ARN ou de l'ADN issu d'une concentration inconnue du micro-organisme avec des quantités d'amplificat issues de l'ARN
ou de l'ADN de plusieurs concentrations connues du dit micro-organisme.
CA 02236842 1998-o~-o~
wo97/l746s PCT~R96/01736 Un tel procédé constitue le premier objet de la présente invention.
Selon une variante de ce procédé, l'étape (2) peut consister essentiellement en une révélation comparative fondée sur la comparaison des concentrations de l'étalon avec les concentrations du micro-organisme cible telles que détectées de préférence au moyen de la méthode dite de 1 'ADN branché ou de toute autre méthode de révélation qui n'amplifie pas les ADM ou les ARN de l'étalon ou du micro-organisme cible.
Pour préparer des concentrations connues de micro-organisme, on procède selon l'une quelconque des techniques connues de l'homme du métier, de préférence en centrifugeant et purifiant (à partir d'échantillons humains, animaux ou végétaux du milieu à tester, ou à
partir de cultures cellulaires) des quantités quelconques du micro-organisme à doser, puis en extrayant l'ADN ou 1 'ARN de ces préparations centrifugées purifiées, par des moyens classiques. Les quantités à mettre en oeuvre dans la suite du procédé sont des quantités quelconques, qui doivent seulement être su~fisantes pour ~ue l'on obtienne finalement des quantités d' ADN ou d' ARN du micro-organisme étalon mesurables par les méthodes microbiologiques directes, n~utilisant pas l'amplification de type ACP et qui sont à la portée de l'homme du métier. Dans la pratique et compte tenu de la précision des matériels actuellement disponibles dans les laboratoires pour ces mesures, des quantités de l'ordre de plusieurs centaines de nanogrammes ou de quelques microgrammes conviennent.
Le procédé selon l'invention comporte avantageusement les étapes selon lesquelles:
1) on prélève et on purifie une quantité quelconque du micro-organisme à doser, à partir d'échantillons de prélèvement humains, animaux ou végétaux, ou à partir de cultures cellulaires, la quantité de micro-organisme étant CA 02236842 1998-0~-0~
wo97/l746s PCT~R96/01736 avantageusement suffisante pour que les concentrations en ADN ou ARN cible soient mesurables par des méthodes directes;
2) on extrait l'ADN ou l'ARN et on en mesure la quantité
texprimée en ng ou en ~g) recueillie;
ou de l'ADN de plusieurs concentrations connues du dit micro-organisme.
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wo97/l746s PCT~R96/01736 Un tel procédé constitue le premier objet de la présente invention.
Selon une variante de ce procédé, l'étape (2) peut consister essentiellement en une révélation comparative fondée sur la comparaison des concentrations de l'étalon avec les concentrations du micro-organisme cible telles que détectées de préférence au moyen de la méthode dite de 1 'ADN branché ou de toute autre méthode de révélation qui n'amplifie pas les ADM ou les ARN de l'étalon ou du micro-organisme cible.
Pour préparer des concentrations connues de micro-organisme, on procède selon l'une quelconque des techniques connues de l'homme du métier, de préférence en centrifugeant et purifiant (à partir d'échantillons humains, animaux ou végétaux du milieu à tester, ou à
partir de cultures cellulaires) des quantités quelconques du micro-organisme à doser, puis en extrayant l'ADN ou 1 'ARN de ces préparations centrifugées purifiées, par des moyens classiques. Les quantités à mettre en oeuvre dans la suite du procédé sont des quantités quelconques, qui doivent seulement être su~fisantes pour ~ue l'on obtienne finalement des quantités d' ADN ou d' ARN du micro-organisme étalon mesurables par les méthodes microbiologiques directes, n~utilisant pas l'amplification de type ACP et qui sont à la portée de l'homme du métier. Dans la pratique et compte tenu de la précision des matériels actuellement disponibles dans les laboratoires pour ces mesures, des quantités de l'ordre de plusieurs centaines de nanogrammes ou de quelques microgrammes conviennent.
Le procédé selon l'invention comporte avantageusement les étapes selon lesquelles:
1) on prélève et on purifie une quantité quelconque du micro-organisme à doser, à partir d'échantillons de prélèvement humains, animaux ou végétaux, ou à partir de cultures cellulaires, la quantité de micro-organisme étant CA 02236842 1998-0~-0~
wo97/l746s PCT~R96/01736 avantageusement suffisante pour que les concentrations en ADN ou ARN cible soient mesurables par des méthodes directes;
2) on extrait l'ADN ou l'ARN et on en mesure la quantité
texprimée en ng ou en ~g) recueillie;
3) on utilise par ailleurs le nombre de bases nucléotidiques du micro-organisme concerné, ce nombre étant connu, par exemple d'après des banques de données, ou déterminable par des méthodes classiques;
4) on calcule à partir de ce nombre de bases nucléotidiques la masse moléculaire totale de l'ADN ou de l'ARN du dit micro-organisme, en tenant compte de la masse moléculaire moyenne d'un nucléotide, elle aussi connue (environ 330 daltons);
5) on calcule ainsi, en utilisant le nombre d'Avogadro (soit 6,02 x 1023), la quantité d'ADN ou d'ARN portée par chaque micro-organisme;
6) on prépare et/ou utilise une gamme de concentrations de micro-organisme étalon obtenue à partir des dilutions successives du micro-organisme préalablement étalonné
selon ses concentrations d'ADN ou d'ARN, pour former un étalon externe, dont on connaît ainsi pour chaque dilution (a) la concentration d'ADN ou d'ARN et (b) la concentra-tion en micro-organismes;
selon ses concentrations d'ADN ou d'ARN, pour former un étalon externe, dont on connaît ainsi pour chaque dilution (a) la concentration d'ADN ou d'ARN et (b) la concentra-tion en micro-organismes;
7) on extrait l'ADN ou l'ARN des micro-organismes étalon et cible et on soumet les extraits en parallèle à une révélation au moyen de la méthode dite à l'ADN branché ou de toute autre méthode de révélation qui n'amplifie pas les ADN ou les ARN du micro-organisme étalon ou cible etJou à une rétrotranscription et/ou à au moins une amplification et on enregistre les valeurs obtenuesi et
8) on compare les concentrations d'ADN ou d'ARN des micro-organismes étalon et cible ou les produits d'amplification des micro-organismes cible avec ceux de l'étalon externe, de ~açon à en déduire les valeurs de concentration en ADN
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 Ou.ARN ou en micro-organisme total dans chaque échantillon de micro-organisme cible.
A titre d'exemples de sources bibliographiques dans lesquelles on peut trouver des indications ou les références de banques de données concernant le nombre de bases nucléotidiques des micro-organismes, on peut citer:
Virus Res. 23, 39-53 (1992); Gene 81, 275-284 (1989);
Virology 177, 305-311 (1990) et J. Gen. Virol. 69, 2575-2583 (1988).
Selon une variante avantageuse pouvant être mise en oeuvre si les micro-organismes sont assez gros pour pouvoir être détectés et comptés directement, notamment par des moyens optiques et/ou électror.iques, les étapes 2) à 5) susdites du procédé selon l'invention sont remplacées par la simple mesure directe du nombre de micro-organlsmes.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré le procédéselon la présente invention peut comprendre en option l'addition d'un contrôle interne, de préférence sous la forme d~un ADN de plasmide hétérologue ou d'un ARN de transcrit hétérologue, et dont la séquence et les amorces n'ont pas de rapport avec les ADN ou les ARN de la cible.
Ledit contrôle interne est avantageusement ajouté à chacun des échantillons à examiner et sert de contrôle interne (ci-après en abrégé "CI"), c'est-à-dire pour le contrôle de l'efficacité d'amplification ou de l'efficacité de l'amplification liée à la transcription réverse (ci-après "TR").
En variante, on peut remplacer dans le procédé selon l~invention la préparation de concentrations connues de micro-organisme par la préparation de concentrations connues:
. du même micro-organisme inactivé, dont l~ADN ou l'ARN
demeure apte à la détection ou la quantification au moyen d'une méthode de révélation telle que la méthode de CA 02236842 l998-o~-o~
W097/17465 PCT~R96/01736 révélation dite à l'ADN branché et/ou la ~ rétrotranscription et/ou à l'amplification de façon identique à l'ADN ou l'ARN du virus natif, . d~une séquence nucléotidique complète, extraite du meme micro-organisme, ou . d~une séquence nucléotidique complète, fabri~uée par synthèse.
Selon une variante particulièrement avantageuse du procédé selon l'invention, on prépare et on stocke jusqu'à
leur mise à la disposition de l'utilisateur des préparations de concentrations connues étalonnées du micro-organisme complet à ADN ou à ARN du type à
quantifier ou à détecter, ou des préparations de concentrations d' ADN ou d' ARN du génome du dit micro-organisme correspondant à des concentrations connues de cemicro-organisme.
Pour simplifier l'exposé, il est fait référence dans la suite, à titre de simple exemple illustratif, à une détection accomplie par une amplification, plus précisé-ment au moyen d~une ACP ou d~une TR-ACP, mais d~autres méthodes d'amplification peuvent également etre employées, comme par exemple la méthode dite NASBA (c' est-à-dire la méthode par ~nucleic acid sequence based assay~
Une quantification moléculaire et une détection selon l'invention présentent un intéret marqué aussi bien pour de petits micro-organismes ~ue pour de plus gros micro-organismes, mais en faible concentration ou dont les techniques empiriques traditionnelles d'évaluation ne sont plus systématiquement maitrisées dans les pays développés L'invention a également pour objet un kit ou ensemble de moyens pour la quantification et la détection de micro-organismes à ADN ou à ARN, comprenant essentiellement, dans des récipients appropriés et/ou sous la forme de dispositifs appropriés:
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 - une série de concentrations connues étalonnées du micro-organisme complet à ADN ou à ARN du type à quantifier ou à
détecter, ou de concentrations d'ADN ou d'ARN
correspondant à des concentrations connues du dit micro-organisme, - des moyens d'extraction, de révélation et/ou de rétrotranscription et/ou d'amplification, notamment par ACP, TR-ACP ou NASBA de l~ADN ou de l'ARN du micro-organisme cible et étalon, - des moyens pour l'analyse de l~ADN ou de l'ARN du micro-organisme cible et étalon ou des produits de révélation ou d'amplification.
Ledit kit ou ensemble de mmoyens peut également comprendre en option un contrôle interne, par exemple sous la forme d'approximativement 103 copies/~l d'un ADN de plasmide hétérologue ou d'ARN de transcrit hétérologue, en tant que contrôle pour l'e~ficacité d'amplification ou de l~efficacité de l'amplification liée à la TR.
Il convient de noter que les moyens d'analyse des produits d'ACP ou de TR-ACP peuvent consister en des moyens extérieurs au kit et destinés à être utilisés en combinaison avec celui-ci. Ces moyens peuvent par exemple comprendre des dispositifs et/ou des produits pour la détermination par életrophorèse, par colorimétrie, par radiométrie ou par tout autre moyen analytique approprié.
Le procédé et les moyens susdits procurent de manière originale une quantification absolue des micro-organismes à ADN ou à ARN, car le micro-organisme cible ou son génome à doser, est identique au micro-organisme étalon ou son génome traité en parallèle. De plus, ce procédé et ces moyens se sont avérés procurer une technique universelle de quantification et d'identification, car ils permettent la quantification de tous les micro-organismes.
En dehors même des préoccupations de quanti~ication, le procédé et les moyens selon l'invention peuvent être CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 employés pour une détection de la quantité minimale de micro-organisme mesurable avec les méthodes actuelles de transcription réverse et/ou d'amplification des micro-organismes à ARN ou à ADN. En pratique, la quantité
minimale mesurable est de l'ordre de un à cinq micro-organismes pour les micro-organismes à ADN, tandis qu'elle est de l'ordre de 10 à 100 micro-organismes pour les micro-organismes à ARN.
L'invention est décrite plus concrètement ci-après en référence aux dessins annexés, qui ne la limitent aucune-ment et dans lesquels:
- Fig. 1 représente graphiquement la variation de la sensibilité de détection et de l'efficacité
d'amplification de différentes expériences d'ACP
effectuées avec plusieurs concentrations différentes d'ADN étalon du même virus;
- Fig. 2 représente graphiquement la variation de la sensibilité de détection et de l'efficacité
d~amplification de différentes expériences de TR-ACP
effectuées avec plusieurs concentrations d'ARN du même virus;
- Fig. 3 représente graphiquement la variation de l'efficacité d'amplification dans des expériences d'ACP effectuées avec plusieurs concentrations d'ADN
issues de préparations de virus provenant de di~férents patients, au sein de la même expérience;
- Fig. 4 représente graphiquement la variation de l'efficacité d'amplification dans des expériences d'ACP effectuées respectivement avec plusieurs concentrations d'ADN isues de plusieurs préparations ~ du même virus et avec plusieurs concentrations d~ADN
issues de deux plasmides différents;
- Fig. 5 représente graphiquement la variation de l'efficacité d'amplification dans des expériences de TR-ACP effectuées avec plusieurs concentrations d~ARN
CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 issues de préparations de virus provenant de dif~érents patients;
- Fig. 6 représente graphiquement la variation de l'efficacité d'amplification dans des expériences de TR-ACP effectuées respectivement avec plusieurs concentrations d'ARN issues de préparations de virus provenant de différents patients et avec deux ARN de transcrits dif~érents.
Ainsi, à titre indicatif, on a concentré, purifié et extrait l~ARN de VIH issu d'une culture de façon à en obtenir 300 ng; sachant que le nombre total de nucléotides du VIH est de l9000 et que la masse moléculaire d'un nucléotide est de 330 daltons, on en a=déduit que la masse moléculaire globale d'un ARN de VIH est de 6.300.000 daltons. On a alors obtenu, par un calcul utilisant le nombre d'Avogadro, le nombre exact de génomes viraux et donc de virus d'où émane la quantité de 300 ng d'ARN, soit approximativement 3xl0l~ virus. Connaissant la concentra-tion de virus d'une partie aliquote de la préparation virale purifiée, on peut alors préparer une gamme étalon de ce virus et l'utiliser dans le procédé selon la présente invention.
Le procédé selon l'invention permet une identi~ication fiable et/ou une quantification absolue, car le micro-organisme cible (à doser) est identique au micro-organisme étalon. La méthode que ce procédé met en oeuvre est en outre universelle, car elle permet la quantification de tous les micro-organismes dont la quantité est mesurable parallèlement.
Ce procédé et le kit pour sa mise en oeuvre peuvent être utilisés non seulement pour la quantification des micro-organismes dans tous milieux ou spécimens, mais également pour la détection de la quantité minimale de micro-organisme mesurable avec les méthodes actuelles de CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 transcription réverse et/ou d'amplification des micro-organismes à ARN ou à ADN.
Pour les micro-organismes à ADN la quantité minimale mesurable est de l'ordre de 1 à 5 micro-organismes, tandis gu'elle est d'environ 10 à 100 micro-organismes pour ceux à ARN.
La présente invention apporte un progrès décisif aux moyens et aux méthodes de dosage quantitatif de micro-organismes in vitro en procurant un moyen et une technique simples et efficaces pour la standardisation des dosages.
L'invention est décrite plus en détails dans les exemples ci-après, qui ne la limitent aucunement et dans lesquels les proportions et les pourcentages sont en poids/poids, sauf indication contraire.
ExemDle 1: Démonstration de l'intérêt d'un étalon universel pour la détection et la quantification d'ADN
cible par ACP (en anglais PCR).
On a étudié la variation de la sensibilité de détection et de llefficacité d'amplification de l'ACP sur l'ADN issu de dif~érentes concentrations du même VHB. Les plasmas ont été obtenus à partir de porteurs de VHB
chroniques par plasmaphérèse avec des titres en HBsAg élevés. Du virion à ADN de VHB a été purifié par centrifugation (pendant une nuit à 25.000 tours/min et à
4~C dans une centrifugeuse Spinco 25) à travers un lit à
30 % (en poids/volume) de saccharose dans du milieu TEBM
(Tris-HCl 0,01 M, pH 7,6, NaEDTA 0,001 M, 1 ~ d'albumine sérique bovine et 0,3 % de 2-mercapto-éthanol). La pureté
des virions de VHB fractionnés a été suivie par microscopie électronique. L'ADN associé aux virions a été
extrait par l'intermédiaire d'un kit de purification d'ADN
du commerce. L'ADN viral obtenu a été quantifié par spectrophotométrie. Le nombre de copies d'ADN viral a été
calculé au moyen de la masse moléculaire du génome viral CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/1746~ PCT~R96/01736 de l'ADN de VHB. En variante le nombre de virions peut également être quantifié par microscopie électronique. Des dilutions en série (l0, l00, l000, 10.000 copies) de l'ADN
de VHB ont été soumises à une succession de cycles d'ACP
identiques (94~C pendant 60 s, 56~C pendant 60 s et 72~C
pendant 90 s), avec l00 pmol de paires d'amorce de VHB
spécifi~ues pour le gène C: (GCTTTGGGGCATGGACATTGCC/
GACTACTAGATCCCTGGATGCTGG). Les produits d'ACP spécifiques ont été analysés par une hybridation dot-blot avec une sonde marquée à l'extrémité par ~_3 2 p (TCAGCTCTGTATCGAGAAGCC) et les comptages par minute (cpm) de chaque signal d'ACP ont été relevés par l'intermédiaire d'un compteur de rayonnement bêta.
Les résultats ont été enregistrés et reportés sous ~orme graphique sur la figure l. Il apparaît clairement ~ue l'étalon donnerait des résultats différents et doit donc être mis en oeuvre dans cha~ue expérience en parallèle avec l'échantillon cible.
Ainsi, pour chaque input d'ADN de matrice constante (nombre de copies), il existe d'après les courbes de la ~igure l un large intervalle de concentrations de produit d'ACP d'une expérience à l'autre.
Exem~le 2: Démonstration de l'intérêt d'un étalon universel pour la détection et la quantification d'ARN
cible par TR-ACP (en anglais RT-PCR).
On a étudié la variation de la sensibilité de détection et de l'efficacité de la transcription réverse/amplification de l'ACP sur l'ARN issu de différentes concentrations du même VIH-l. Du virion à ARN
de VIH-l a été purifié par passage du surnageant de culture de blastes de cellules mononuclées du sang infectés par un isolat primaire sur une colonne de sépharose. La pureté des virions de VIH-l ~ractionnés a été suivie par microscopie électronique. L'ARN associé aux CA 02236842 1998-0~-0~
virions a été extrait par l'intermédiaire d'un kit d'isolation d'ARN du commerce. L'ARN viral obtenu a été
quantifié par spectrophotométrie. Le nombre de copies d'ARN viral a été calculé au moyen de la masse moléculaire 5 du génome viral de l'ARN de VIH-l. Après addition de microgramme d'ARNt, des dilutions en série (l.000.000, lO0.000, lO.000, lO00 copies) de l'échantillon d'ARN ont été pastillées et remises en suspension dans lO ~Ll. Une partie aliquote de lO ~ll d'ARN et l ~g d'ARNt de référence lO (exempt de VIH) ont été ajoutés immédiatement à chacun des mélanges réactionnels (90 ~ll) de TR-ACP contenant lO
unités de transcriptase réverse de virus de leucémie murine de Moloney recornbinant et 3 unités d'ADN polymérase ampliTaq pour l'amplification du gène gag du VIH. La TR-15 ACP a été mise en oeuvre pendant 25 minutes à 42~C, puispendant 5 min à 94~C et ensuite sur 40 cycles (94~C
peandnt 60 s, 56~C pendant 60 s et 72~C pendant 90 s) d'ACP utilisant lO0 pmol de chacune des paires d'amorce de VIH spécifiques du gène gag (GGAACATCAAGCAGCCATGC/
20 TCCTTTGGTCCTTGTCTTATGTC). Les produits d'ACP spécifiques ont été analysés par hybridation par dot-blot avec une sonde marquée à 1 'extrémité par ~y_ 3 2 p (ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC) et les comptages par minute (cpm) de chaque signal d'ACP ont été
25 relevés par l'intermédiaire d'un compteur de rayonnement bêta.
Les résultats ont été enregistrés et reportés sous forme graphique sur la figure 2. Il apparaît que la variabilité des résultats est très importante d'une 30 expérience à l'autre. Là encore, il apparaît clairement que l'étalon donnerait des résultats différents et doit donc être mis en oeuvre dans chaque expérience en parallèle avec l'échantillon cible.
Ainsi, pour chaque input d'ARN constant (nombre de 35 copies), il existe d~après les courbes de la figure 2 un CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 la~ge intervalle de concentrations de produit d'ACP d'une expérience à l'autre.
Exem~le 3: Validation d'un étalon d'ADM de virion.
Cet exemple illustre l'identité d'efficacité de l'amplification par des cycles d'ACP identiques d'ADN de virion de VHB natif provenant de sérums de différents patients infectés par VHB. Des dilutions en série dléchantillons de différents ADN de virion de VHB préparés comme indiqué dans l'exemple 1 ont été soumises à un même nombre de cycles d'ACP dans la même expérience. Le produit d'ACP (output) a été quantifié par dot blot et comptage de cpm.
Les résultats reportés sous ~orme graphique sur la figure 3 montrent que l'efficacité diamplification par ACP
est identique quelle que soit la source du virion VHB (ici pour quatre sources différentes).
Exem~le 4: Validation d'un étalon d'ADN de virion.
En procédant comme indiqué dans l'exemple 3, mais en mettant en oeuvre à chaque fois dans les mêmes cycles d'ACP un ADN de virion nati~ et des ADN issus de deux plasmides VHB (input), on a pu établir les efficacités comparées de l'amplification par ACP (voir figure 4).
Des fragments d'ADN de la séquence de gène C de VHB
ont été produits par ACP à partir de sérums de HBVsAg+ et ligaturés dans des plasmides pGEM-3Z (Promega) et pCT~
(Invitrogen) (respectivement plasmide ADN1 et ADN2 de VHB). Tous les construits ont été confirmés par séquençage d'ADN au moyen d'un kit commercial approprié.
Les résultats reportés sous forme graphique sur la figure 4 montrent ~u'un nombre connu de copies peut avoir ou non une efficacité d'amplification comparable à celle d'un nombre de copies identique d'ADN viral natif issu de plusieurs échantillons.
CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 Il ressort ainsi des exemples 3 et 4 que des concentrations connues d'ADN de virion VHB de différentes provenances constituent un étalon universel idéal, alors que des fragments d'ADN viral intégrés dans des plasmides différents ont des comportements différents entre eux et différents des ADN natifs.
~xem~le 5: Validation d'un étalon d'ARN de virion.
Cet exemple illustre l'identité d'efficacité de l'amplification par des cycles de TR-ACP identiques d'ARN
de virion de VIH natif provenant de sérums de différents patients infectés par du VIH. Des dilutions en série d'échantillons de différents ARN de virion de VIH préparés comme indiqué dans l'exemple 2 ont été soumises à un cycle de TR-ACP dans la même expérience. Le produit d'ACP
(output) a été quantifié par dot blot et comptage de cpm.
Les résultats reportés sous forme graphique sur la figure 5 montrent que l'efficacité d'amplification par TR-ACP est identique quelle ~ue soit la source du virion VIH
Exem~le 6: Validation d'un étalon d'ARN de virion.
En procédant comme indiqué dans l'exemple 5, mais en mettant en oeuvre à chaque fois dans les mêmes cycles de TR-ACP un ARN de virion natif et un ARN de transcrit avec un nombre connu de copies (input), on a pu établir les ef~icacités comparées de l'amplification par TR-ACP (voir figure 6).
Des fragments d'ARN de séquence gag de VIH-l ont été
produits par transcription de matrices d'ADN de VIH-l (respectivement plasmide pBR322 d'ADN de VIH-Z6 et plasmide pBHlO-R3 d'ADN de VIHIIIg) avec de l'ARN
polymérase de T7 (respectivement transcrits ARNl et ARN2 - de VIH).
Les résultats reportés sous forme graphique sur la figure 6 montrent qu'un ARN de transcrit ayant un nombre CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/1746s PCT~96/01736 connu de copies a une e~icacité d'amplification par TR-ACP différente de celle d'un ARN d'échantillon.
Il ressort ainsi des exemples 5 et 6 que des concentrations connues d'ARN de virion VIH de différentes provenances constituent un étalon universel idéal, alors que des fragments d'ARN viral intégrés dans des plasmides différents ont des comportements différents entre eux et différents des ARN natifs.
Ainsi:
- l'utilisation selon l'invention d'ADN de virion comme étalon externe est de loin plu5 précise et commode que celle d'un ADN de plasmide servant d'étalon externe ou interne pour le suivi de l'efficacité de l'amplification dans un essai d'ACP quantitative;
- l'utiIisation selon l'invention d'ARN de virion comme étalon externe est de loin plus précïse et commode que celle d'un ARN de transcrit servant d'étalon externe ou interne pour le suivi de l'e~ficacité de 1'amplification dans un essai de TR-ACP ~uantitative.
Exem~le 7: Kit de quantification du génome du virus de l'immunodé~icience humaine (VIH) pour détection par visualisation 7.l. INTRODUCTION
Un kit de quantification du génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) selon la présente invention a été concu pour la détection et la quantification d'ARN génomique de VIH (y compris tous les génotypes VIH-0, VIH-l et VIH-2) dans tous fluides biologiques exempts de cellules (tels que plasma, sérum, liquide séminal, fluide de lavage broncho-alvéolaire, etc.), ainsi que les surnageants de culture. On y a inclus des réactifs pour permettre d'isoler l'ARN viral par une méthode rapide - la transcription réverse de l'ARN de CA 02236842 l998-0~-0~
W097/17465 PCT~R96/01736 virion VIH en ADNc au moyen de transcriptase réverse du virus de leucémie murine de Moloney cloné - l'amplifica-tion utilisant alors de la Taq ADN polymérase - et finalement la détection quantitative par une procédure simple de visualisation sur gel d'agarose, qui permettait une limite de détection de 1000 copies d'ARN viral et une gamme de quantification de plus de 4 ordres de grandeur en un seul test en 8 heures. Suffisamment de réactifs étaient fournis pour 100 réactions (40 ~l chacune) dans un protocole avec volume final de 50 ~l.
Le kit contenait un ensemble d'étalons de virion VIH
(ci-après "VirionStandard") comme expliqué plus haut (104, 103, 102 et 10 copies/~l, fournis pour 4 séries de tests), qui permettaient une mesure précise de la concentration d~ARN de virion VIH du plasma/sérum. Le kit contenait également un ADN de VIH de plasmide (102 copies par réaction, pour 4 séries de tests), qui servait de contrôle de signal d'amplification positif, ainsi qu'en option un ARN de tanscrit hétérologue, ajouté à chacun des échantillons à examiner et servant de contrôle interne (ci-après "CI") (103 copies par réaction, fourni pour 100 réactions).
7.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT
Le kit de quantification de génome de VIH doit de préférence être conservé à -20~C dans un congélateur à
température constante ou à 4~C avec utilisation d'une solution de conservation d'enzyme appropriée. S'il est stocké dans des conditions appropriées, le produit reste stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une étiquette.
No. Réactif Volume Quantité Commentaires VirionStandard de VIH
la VirionStandard 1 (104 copies/lll) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'échantillon Ib VirionStandard 2 (103 copies/,ul) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'échantillon Ic VirionStandard 3 (102 copies/lll) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'él~han~illon Id VirionStandard4(10 copies/lll) 0,4ml I Calibrel'ARNd'échantillon le VirionStandard 5 (serum négatif auVlH) 0,4 ml I Contrôle de spécificité (négatif) O
2 ARNt (0,1 mg/ml) I ml I Sert d'ARN support pour l'ARN d'échantillon 3 Tampon de reserve d'ARN 250 111 4 Dissout Ies echantillons d'ARN
4 Mélange d'amplification de VIH, avec arnorces I ml 4 S'llybride à l'ARN de VIH et aux génomes de VIH et amorces de Cl, ~ventuellement d'ADNc Mélange enzymatique 28 111 4 Retrotranscrit l'ARN de cible et amplifie l'ADNc 6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/Ill) 40 ~l I Contrôle de signal (positif) d'ADNc de VIH
7 Cl optimal (103 copies/lll) 1 ml I Contrôle interne d'efficacite d'amplification lice à la TR
8 Eau passée à l'autoclave 40 111 ] Contrôle de signal (négatif) de fond ~ .
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 7.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS
7.3.l. REACTIFS
- Chloroforme (pur pour analyses) - Isopropanol (pur pour analyses) - Ethanol à 75 % (pur pour analyses) - Agarose (exempt de DNase) - Bromure d'éthidium - Solution d'isolement d'ARN
7.3.2. EQUIPEMENTS
- Centrifugeuse à microtube (4~C) - Installation de mise sous vide - Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant - Générateur et bain pour électrophorèse 7.4. PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR
AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE
7.4.l. EXTRACTION D'ARN
l00 ~l d'échantillons de VirionStandard de VIH et de plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 ~l de solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations dans un homogénéiseur. 60 ~l de chloroforme ont été
ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes et laissé reposer sur de la glace pendant l0 minutes. La suspension a été centrifugée à 12.000 g à 4~C pendant 15 minutes.
Après addition de chloroforme et centrifugation, il se formait deux phases: la phase phénol-chloroformi~ue inférieure (~240 ~l) et la phase aqueuse supérieure (~320 ~l). Les ARN restaient exclusivement dans la phase aqueuse, tandis ~ue les ADN et les protéines étaient dans l'interphase et dans la phase organique.
La phase aqeuse (300 ~l) a été transférée dans de nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté
~ et les échantillons ont été conservés à -20~C pendant l heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant l0 minutes à 12.000 g (4~C) et le pellet (pastille) a été
CA 02236842 1998-0~-0~
brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet d'ARN a eté lavé une fois avec de l'éthanol à 75% (500 ,~Ll) sous l'effet d'un vortex, et finalement le pellet d'ARN a été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans ll ,Ul de tampon de réserve d'ARN.
Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune (visible seulement en grande ~uantité) au fond du tube. Il est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher complètement, car le séchage diminue fortement sa l0 solubilité.
7.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION D'ADNc 10 ,ul d'échantillons diARN et de contrôles positif/-négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 ,ul).
40 ~ul de mélange de transcription réverse/amplification (MTRA) (38,9 ,ul de mélange d~amplification de VIH + l,l ~ll de mélange enzymatique) ont été placés dans cha~ue tube.
Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant un cycle thermis~ue (dénommé commercialement Thermal Cycler), à couvercle chauffant.
- 42~C pendant 25 minutes;
- 94~C pendant 5 minutes;
- 35 cycles (94~C pendant 35 s, 55~C pendant 45 s et 72~C pendant 60 s);
- puis 55~C pendant 5 minutes et ensuite 72~C pendant 5 minutes.
7.5. VISUALISATION ET QUANTIFICATION
10 ,ul du mélange post-réactionnel ont été distribués sur du gel d'agarose à 1,596 contenant 0,5 ,ug/ml de bromure d'éthidium et on a effectué une électrophorèse sous 150 V
30 pendant l0 minutes.
Les séquences de VIH spécifi~uement amplifiées pouvaient être visualisées aisément par différences de taille. Les gammes de copies d'ARN de viron VIH dans l00 ,ul d'échantillons de plasma/sérum pouvaient être estimées CA 02236842 1998-o~-o~
WO97/17465 PCT~R96/01736 par comparaison de leurs bandes d'amplification avec celles du VirionStandard de VIH (semi-quantification).
~ xem~le 8: Kit de quantification de génome de virus d'immunodéficience humaine (VIH) pour détection avec un lecteur de densité optique 8.l. INTRODUCTION
Un kit de quantification du génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) selon la présente invention a été conçu pour la détection et la quantification d~ ARN génomique de vIH (y compris tous les génotypes VIH-0, VIH-l et VIH-2) dans tous fluides biologiques exempts de cellules (tels que plasma, sérum, lS liquide séminal, fluide de lavage broncho-alvéolaire, etc.), ainsi que les surnageants de culture. On y a inclus des réactifs pour permettre d'isoler l'ARN viral par une méthode rapide - la transcription réverse de l' ARN de virion VIH en ADNc au moyen de transcriptase réverse du virus de leucémie murine de Moloney cloné - l'amplifica-tion utilisant alors de la Taq ADN polymérase - et finalement la détection quantitative par une procédure d'hybridation liquide liée à la DIG (digoxigénine), qui permettait une limite de détection de l00 copies d' ARN
viral et une gamme de quantification d~environ 2 ordres de grandeur en un seul test en 8 heures. Suffisamment de réactifs étaient fournis pour l00 réactions (40 ~l chacune) dans un protocole avec volume final de 50 ~l.
Le kit contenait un ensemble d'étalons de virion VIH
~VirionStandard" (103, l02, l0 et l copies/~l, fournis pour 4 séries de tests), qui permettaient une mesure précise de la concentration d' ARN de virion VIH du - plasma/sérum. Le kit contenait également un ADN de VIH de plasmide (102 copies par réaction pour 4 séries de tests), qui servait de contrôle de signal d'amplification positif, CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 ainsi qu'en option un ARN de tanscrit hétérologue, ajouté
à chacun des échantillons à examiner et servant de contr81e interne "CI" (103 copies par réaction, fourni pour lO0 réactions).
8.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT
Le kit de quantification de génome de VIH doit de préférence etre conservé à -20~C dans un congélateur à
température constante ou à 4~C avec utilisation d'une solution de conservation d'enzyme appropri~e. S'il est stocké dans des conditions appropriées, le produit reste stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une étiquette.
No. Réactif Volume Quantité Commentaires I Amplification de génome de VIH liée à une ll dnS~ utiOn réverse (TR) et Illdl ~ludge par DIG
VirionStandard de VIH
la Vi-iooJtdl-dard 1 (103 copies/lll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon lb VirionStandard 2 (102 copies/lll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'~h~ntill()n Ic Vi-;ollJl~llddl-l 3 (10 copies/~,ll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon ld VirionStandard 4 (1 copie/lll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'e- h~n~illon D
le VirionStandard 5 (sérum négatif auVlH) 0,4 ml 1 Contrôle de spécificité (négatif) o 2 ARNt (0,1 mg/ml) 1 ml 1 Scrt d'ARN support pour l'ARN d'échantillon 3 Tampon de réserve d'ARN 250 111 4 Dissout les échantillons d'ARN ~, 4 Mélange d'amplification de VIH, avec amorces 1 ml 4 S'hybride à l'ARN de VIH et aux génomes 'J' ~, de VIH et Cl, (5% de DlG-dUTP) d'ADNc Mélange enzymatique 28 ~,11 4 Rétrotranscrit l'ARN de cible et amplifie l'ADNc 6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/~ll) 40 111 1 Contrôle de signal (positif) d'ADNc de VIH
7 ADN de transcrit hétérologue (103 copies/!ll) 1 ml 1 Contrôle interne d'efficacité d'amplification liée à TR
8 Eau passée à l'autoclave 40 1,11 I Contrôle de signal (négatif) de fond Il Hybridation liquidc et détection par DIG
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 Ou.ARN ou en micro-organisme total dans chaque échantillon de micro-organisme cible.
A titre d'exemples de sources bibliographiques dans lesquelles on peut trouver des indications ou les références de banques de données concernant le nombre de bases nucléotidiques des micro-organismes, on peut citer:
Virus Res. 23, 39-53 (1992); Gene 81, 275-284 (1989);
Virology 177, 305-311 (1990) et J. Gen. Virol. 69, 2575-2583 (1988).
Selon une variante avantageuse pouvant être mise en oeuvre si les micro-organismes sont assez gros pour pouvoir être détectés et comptés directement, notamment par des moyens optiques et/ou électror.iques, les étapes 2) à 5) susdites du procédé selon l'invention sont remplacées par la simple mesure directe du nombre de micro-organlsmes.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré le procédéselon la présente invention peut comprendre en option l'addition d'un contrôle interne, de préférence sous la forme d~un ADN de plasmide hétérologue ou d'un ARN de transcrit hétérologue, et dont la séquence et les amorces n'ont pas de rapport avec les ADN ou les ARN de la cible.
Ledit contrôle interne est avantageusement ajouté à chacun des échantillons à examiner et sert de contrôle interne (ci-après en abrégé "CI"), c'est-à-dire pour le contrôle de l'efficacité d'amplification ou de l'efficacité de l'amplification liée à la transcription réverse (ci-après "TR").
En variante, on peut remplacer dans le procédé selon l~invention la préparation de concentrations connues de micro-organisme par la préparation de concentrations connues:
. du même micro-organisme inactivé, dont l~ADN ou l'ARN
demeure apte à la détection ou la quantification au moyen d'une méthode de révélation telle que la méthode de CA 02236842 l998-o~-o~
W097/17465 PCT~R96/01736 révélation dite à l'ADN branché et/ou la ~ rétrotranscription et/ou à l'amplification de façon identique à l'ADN ou l'ARN du virus natif, . d~une séquence nucléotidique complète, extraite du meme micro-organisme, ou . d~une séquence nucléotidique complète, fabri~uée par synthèse.
Selon une variante particulièrement avantageuse du procédé selon l'invention, on prépare et on stocke jusqu'à
leur mise à la disposition de l'utilisateur des préparations de concentrations connues étalonnées du micro-organisme complet à ADN ou à ARN du type à
quantifier ou à détecter, ou des préparations de concentrations d' ADN ou d' ARN du génome du dit micro-organisme correspondant à des concentrations connues de cemicro-organisme.
Pour simplifier l'exposé, il est fait référence dans la suite, à titre de simple exemple illustratif, à une détection accomplie par une amplification, plus précisé-ment au moyen d~une ACP ou d~une TR-ACP, mais d~autres méthodes d'amplification peuvent également etre employées, comme par exemple la méthode dite NASBA (c' est-à-dire la méthode par ~nucleic acid sequence based assay~
Une quantification moléculaire et une détection selon l'invention présentent un intéret marqué aussi bien pour de petits micro-organismes ~ue pour de plus gros micro-organismes, mais en faible concentration ou dont les techniques empiriques traditionnelles d'évaluation ne sont plus systématiquement maitrisées dans les pays développés L'invention a également pour objet un kit ou ensemble de moyens pour la quantification et la détection de micro-organismes à ADN ou à ARN, comprenant essentiellement, dans des récipients appropriés et/ou sous la forme de dispositifs appropriés:
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 - une série de concentrations connues étalonnées du micro-organisme complet à ADN ou à ARN du type à quantifier ou à
détecter, ou de concentrations d'ADN ou d'ARN
correspondant à des concentrations connues du dit micro-organisme, - des moyens d'extraction, de révélation et/ou de rétrotranscription et/ou d'amplification, notamment par ACP, TR-ACP ou NASBA de l~ADN ou de l'ARN du micro-organisme cible et étalon, - des moyens pour l'analyse de l~ADN ou de l'ARN du micro-organisme cible et étalon ou des produits de révélation ou d'amplification.
Ledit kit ou ensemble de mmoyens peut également comprendre en option un contrôle interne, par exemple sous la forme d'approximativement 103 copies/~l d'un ADN de plasmide hétérologue ou d'ARN de transcrit hétérologue, en tant que contrôle pour l'e~ficacité d'amplification ou de l~efficacité de l'amplification liée à la TR.
Il convient de noter que les moyens d'analyse des produits d'ACP ou de TR-ACP peuvent consister en des moyens extérieurs au kit et destinés à être utilisés en combinaison avec celui-ci. Ces moyens peuvent par exemple comprendre des dispositifs et/ou des produits pour la détermination par életrophorèse, par colorimétrie, par radiométrie ou par tout autre moyen analytique approprié.
Le procédé et les moyens susdits procurent de manière originale une quantification absolue des micro-organismes à ADN ou à ARN, car le micro-organisme cible ou son génome à doser, est identique au micro-organisme étalon ou son génome traité en parallèle. De plus, ce procédé et ces moyens se sont avérés procurer une technique universelle de quantification et d'identification, car ils permettent la quantification de tous les micro-organismes.
En dehors même des préoccupations de quanti~ication, le procédé et les moyens selon l'invention peuvent être CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 employés pour une détection de la quantité minimale de micro-organisme mesurable avec les méthodes actuelles de transcription réverse et/ou d'amplification des micro-organismes à ARN ou à ADN. En pratique, la quantité
minimale mesurable est de l'ordre de un à cinq micro-organismes pour les micro-organismes à ADN, tandis qu'elle est de l'ordre de 10 à 100 micro-organismes pour les micro-organismes à ARN.
L'invention est décrite plus concrètement ci-après en référence aux dessins annexés, qui ne la limitent aucune-ment et dans lesquels:
- Fig. 1 représente graphiquement la variation de la sensibilité de détection et de l'efficacité
d'amplification de différentes expériences d'ACP
effectuées avec plusieurs concentrations différentes d'ADN étalon du même virus;
- Fig. 2 représente graphiquement la variation de la sensibilité de détection et de l'efficacité
d~amplification de différentes expériences de TR-ACP
effectuées avec plusieurs concentrations d'ARN du même virus;
- Fig. 3 représente graphiquement la variation de l'efficacité d'amplification dans des expériences d'ACP effectuées avec plusieurs concentrations d'ADN
issues de préparations de virus provenant de di~férents patients, au sein de la même expérience;
- Fig. 4 représente graphiquement la variation de l'efficacité d'amplification dans des expériences d'ACP effectuées respectivement avec plusieurs concentrations d'ADN isues de plusieurs préparations ~ du même virus et avec plusieurs concentrations d~ADN
issues de deux plasmides différents;
- Fig. 5 représente graphiquement la variation de l'efficacité d'amplification dans des expériences de TR-ACP effectuées avec plusieurs concentrations d~ARN
CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 issues de préparations de virus provenant de dif~érents patients;
- Fig. 6 représente graphiquement la variation de l'efficacité d'amplification dans des expériences de TR-ACP effectuées respectivement avec plusieurs concentrations d'ARN issues de préparations de virus provenant de différents patients et avec deux ARN de transcrits dif~érents.
Ainsi, à titre indicatif, on a concentré, purifié et extrait l~ARN de VIH issu d'une culture de façon à en obtenir 300 ng; sachant que le nombre total de nucléotides du VIH est de l9000 et que la masse moléculaire d'un nucléotide est de 330 daltons, on en a=déduit que la masse moléculaire globale d'un ARN de VIH est de 6.300.000 daltons. On a alors obtenu, par un calcul utilisant le nombre d'Avogadro, le nombre exact de génomes viraux et donc de virus d'où émane la quantité de 300 ng d'ARN, soit approximativement 3xl0l~ virus. Connaissant la concentra-tion de virus d'une partie aliquote de la préparation virale purifiée, on peut alors préparer une gamme étalon de ce virus et l'utiliser dans le procédé selon la présente invention.
Le procédé selon l'invention permet une identi~ication fiable et/ou une quantification absolue, car le micro-organisme cible (à doser) est identique au micro-organisme étalon. La méthode que ce procédé met en oeuvre est en outre universelle, car elle permet la quantification de tous les micro-organismes dont la quantité est mesurable parallèlement.
Ce procédé et le kit pour sa mise en oeuvre peuvent être utilisés non seulement pour la quantification des micro-organismes dans tous milieux ou spécimens, mais également pour la détection de la quantité minimale de micro-organisme mesurable avec les méthodes actuelles de CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 transcription réverse et/ou d'amplification des micro-organismes à ARN ou à ADN.
Pour les micro-organismes à ADN la quantité minimale mesurable est de l'ordre de 1 à 5 micro-organismes, tandis gu'elle est d'environ 10 à 100 micro-organismes pour ceux à ARN.
La présente invention apporte un progrès décisif aux moyens et aux méthodes de dosage quantitatif de micro-organismes in vitro en procurant un moyen et une technique simples et efficaces pour la standardisation des dosages.
L'invention est décrite plus en détails dans les exemples ci-après, qui ne la limitent aucunement et dans lesquels les proportions et les pourcentages sont en poids/poids, sauf indication contraire.
ExemDle 1: Démonstration de l'intérêt d'un étalon universel pour la détection et la quantification d'ADN
cible par ACP (en anglais PCR).
On a étudié la variation de la sensibilité de détection et de llefficacité d'amplification de l'ACP sur l'ADN issu de dif~érentes concentrations du même VHB. Les plasmas ont été obtenus à partir de porteurs de VHB
chroniques par plasmaphérèse avec des titres en HBsAg élevés. Du virion à ADN de VHB a été purifié par centrifugation (pendant une nuit à 25.000 tours/min et à
4~C dans une centrifugeuse Spinco 25) à travers un lit à
30 % (en poids/volume) de saccharose dans du milieu TEBM
(Tris-HCl 0,01 M, pH 7,6, NaEDTA 0,001 M, 1 ~ d'albumine sérique bovine et 0,3 % de 2-mercapto-éthanol). La pureté
des virions de VHB fractionnés a été suivie par microscopie électronique. L'ADN associé aux virions a été
extrait par l'intermédiaire d'un kit de purification d'ADN
du commerce. L'ADN viral obtenu a été quantifié par spectrophotométrie. Le nombre de copies d'ADN viral a été
calculé au moyen de la masse moléculaire du génome viral CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/1746~ PCT~R96/01736 de l'ADN de VHB. En variante le nombre de virions peut également être quantifié par microscopie électronique. Des dilutions en série (l0, l00, l000, 10.000 copies) de l'ADN
de VHB ont été soumises à une succession de cycles d'ACP
identiques (94~C pendant 60 s, 56~C pendant 60 s et 72~C
pendant 90 s), avec l00 pmol de paires d'amorce de VHB
spécifi~ues pour le gène C: (GCTTTGGGGCATGGACATTGCC/
GACTACTAGATCCCTGGATGCTGG). Les produits d'ACP spécifiques ont été analysés par une hybridation dot-blot avec une sonde marquée à l'extrémité par ~_3 2 p (TCAGCTCTGTATCGAGAAGCC) et les comptages par minute (cpm) de chaque signal d'ACP ont été relevés par l'intermédiaire d'un compteur de rayonnement bêta.
Les résultats ont été enregistrés et reportés sous ~orme graphique sur la figure l. Il apparaît clairement ~ue l'étalon donnerait des résultats différents et doit donc être mis en oeuvre dans cha~ue expérience en parallèle avec l'échantillon cible.
Ainsi, pour chaque input d'ADN de matrice constante (nombre de copies), il existe d'après les courbes de la ~igure l un large intervalle de concentrations de produit d'ACP d'une expérience à l'autre.
Exem~le 2: Démonstration de l'intérêt d'un étalon universel pour la détection et la quantification d'ARN
cible par TR-ACP (en anglais RT-PCR).
On a étudié la variation de la sensibilité de détection et de l'efficacité de la transcription réverse/amplification de l'ACP sur l'ARN issu de différentes concentrations du même VIH-l. Du virion à ARN
de VIH-l a été purifié par passage du surnageant de culture de blastes de cellules mononuclées du sang infectés par un isolat primaire sur une colonne de sépharose. La pureté des virions de VIH-l ~ractionnés a été suivie par microscopie électronique. L'ARN associé aux CA 02236842 1998-0~-0~
virions a été extrait par l'intermédiaire d'un kit d'isolation d'ARN du commerce. L'ARN viral obtenu a été
quantifié par spectrophotométrie. Le nombre de copies d'ARN viral a été calculé au moyen de la masse moléculaire 5 du génome viral de l'ARN de VIH-l. Après addition de microgramme d'ARNt, des dilutions en série (l.000.000, lO0.000, lO.000, lO00 copies) de l'échantillon d'ARN ont été pastillées et remises en suspension dans lO ~Ll. Une partie aliquote de lO ~ll d'ARN et l ~g d'ARNt de référence lO (exempt de VIH) ont été ajoutés immédiatement à chacun des mélanges réactionnels (90 ~ll) de TR-ACP contenant lO
unités de transcriptase réverse de virus de leucémie murine de Moloney recornbinant et 3 unités d'ADN polymérase ampliTaq pour l'amplification du gène gag du VIH. La TR-15 ACP a été mise en oeuvre pendant 25 minutes à 42~C, puispendant 5 min à 94~C et ensuite sur 40 cycles (94~C
peandnt 60 s, 56~C pendant 60 s et 72~C pendant 90 s) d'ACP utilisant lO0 pmol de chacune des paires d'amorce de VIH spécifiques du gène gag (GGAACATCAAGCAGCCATGC/
20 TCCTTTGGTCCTTGTCTTATGTC). Les produits d'ACP spécifiques ont été analysés par hybridation par dot-blot avec une sonde marquée à 1 'extrémité par ~y_ 3 2 p (ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC) et les comptages par minute (cpm) de chaque signal d'ACP ont été
25 relevés par l'intermédiaire d'un compteur de rayonnement bêta.
Les résultats ont été enregistrés et reportés sous forme graphique sur la figure 2. Il apparaît que la variabilité des résultats est très importante d'une 30 expérience à l'autre. Là encore, il apparaît clairement que l'étalon donnerait des résultats différents et doit donc être mis en oeuvre dans chaque expérience en parallèle avec l'échantillon cible.
Ainsi, pour chaque input d'ARN constant (nombre de 35 copies), il existe d~après les courbes de la figure 2 un CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 la~ge intervalle de concentrations de produit d'ACP d'une expérience à l'autre.
Exem~le 3: Validation d'un étalon d'ADM de virion.
Cet exemple illustre l'identité d'efficacité de l'amplification par des cycles d'ACP identiques d'ADN de virion de VHB natif provenant de sérums de différents patients infectés par VHB. Des dilutions en série dléchantillons de différents ADN de virion de VHB préparés comme indiqué dans l'exemple 1 ont été soumises à un même nombre de cycles d'ACP dans la même expérience. Le produit d'ACP (output) a été quantifié par dot blot et comptage de cpm.
Les résultats reportés sous ~orme graphique sur la figure 3 montrent que l'efficacité diamplification par ACP
est identique quelle que soit la source du virion VHB (ici pour quatre sources différentes).
Exem~le 4: Validation d'un étalon d'ADN de virion.
En procédant comme indiqué dans l'exemple 3, mais en mettant en oeuvre à chaque fois dans les mêmes cycles d'ACP un ADN de virion nati~ et des ADN issus de deux plasmides VHB (input), on a pu établir les efficacités comparées de l'amplification par ACP (voir figure 4).
Des fragments d'ADN de la séquence de gène C de VHB
ont été produits par ACP à partir de sérums de HBVsAg+ et ligaturés dans des plasmides pGEM-3Z (Promega) et pCT~
(Invitrogen) (respectivement plasmide ADN1 et ADN2 de VHB). Tous les construits ont été confirmés par séquençage d'ADN au moyen d'un kit commercial approprié.
Les résultats reportés sous forme graphique sur la figure 4 montrent ~u'un nombre connu de copies peut avoir ou non une efficacité d'amplification comparable à celle d'un nombre de copies identique d'ADN viral natif issu de plusieurs échantillons.
CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 Il ressort ainsi des exemples 3 et 4 que des concentrations connues d'ADN de virion VHB de différentes provenances constituent un étalon universel idéal, alors que des fragments d'ADN viral intégrés dans des plasmides différents ont des comportements différents entre eux et différents des ADN natifs.
~xem~le 5: Validation d'un étalon d'ARN de virion.
Cet exemple illustre l'identité d'efficacité de l'amplification par des cycles de TR-ACP identiques d'ARN
de virion de VIH natif provenant de sérums de différents patients infectés par du VIH. Des dilutions en série d'échantillons de différents ARN de virion de VIH préparés comme indiqué dans l'exemple 2 ont été soumises à un cycle de TR-ACP dans la même expérience. Le produit d'ACP
(output) a été quantifié par dot blot et comptage de cpm.
Les résultats reportés sous forme graphique sur la figure 5 montrent que l'efficacité d'amplification par TR-ACP est identique quelle ~ue soit la source du virion VIH
Exem~le 6: Validation d'un étalon d'ARN de virion.
En procédant comme indiqué dans l'exemple 5, mais en mettant en oeuvre à chaque fois dans les mêmes cycles de TR-ACP un ARN de virion natif et un ARN de transcrit avec un nombre connu de copies (input), on a pu établir les ef~icacités comparées de l'amplification par TR-ACP (voir figure 6).
Des fragments d'ARN de séquence gag de VIH-l ont été
produits par transcription de matrices d'ADN de VIH-l (respectivement plasmide pBR322 d'ADN de VIH-Z6 et plasmide pBHlO-R3 d'ADN de VIHIIIg) avec de l'ARN
polymérase de T7 (respectivement transcrits ARNl et ARN2 - de VIH).
Les résultats reportés sous forme graphique sur la figure 6 montrent qu'un ARN de transcrit ayant un nombre CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/1746s PCT~96/01736 connu de copies a une e~icacité d'amplification par TR-ACP différente de celle d'un ARN d'échantillon.
Il ressort ainsi des exemples 5 et 6 que des concentrations connues d'ARN de virion VIH de différentes provenances constituent un étalon universel idéal, alors que des fragments d'ARN viral intégrés dans des plasmides différents ont des comportements différents entre eux et différents des ARN natifs.
Ainsi:
- l'utilisation selon l'invention d'ADN de virion comme étalon externe est de loin plu5 précise et commode que celle d'un ADN de plasmide servant d'étalon externe ou interne pour le suivi de l'efficacité de l'amplification dans un essai d'ACP quantitative;
- l'utiIisation selon l'invention d'ARN de virion comme étalon externe est de loin plus précïse et commode que celle d'un ARN de transcrit servant d'étalon externe ou interne pour le suivi de l'e~ficacité de 1'amplification dans un essai de TR-ACP ~uantitative.
Exem~le 7: Kit de quantification du génome du virus de l'immunodé~icience humaine (VIH) pour détection par visualisation 7.l. INTRODUCTION
Un kit de quantification du génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) selon la présente invention a été concu pour la détection et la quantification d'ARN génomique de VIH (y compris tous les génotypes VIH-0, VIH-l et VIH-2) dans tous fluides biologiques exempts de cellules (tels que plasma, sérum, liquide séminal, fluide de lavage broncho-alvéolaire, etc.), ainsi que les surnageants de culture. On y a inclus des réactifs pour permettre d'isoler l'ARN viral par une méthode rapide - la transcription réverse de l'ARN de CA 02236842 l998-0~-0~
W097/17465 PCT~R96/01736 virion VIH en ADNc au moyen de transcriptase réverse du virus de leucémie murine de Moloney cloné - l'amplifica-tion utilisant alors de la Taq ADN polymérase - et finalement la détection quantitative par une procédure simple de visualisation sur gel d'agarose, qui permettait une limite de détection de 1000 copies d'ARN viral et une gamme de quantification de plus de 4 ordres de grandeur en un seul test en 8 heures. Suffisamment de réactifs étaient fournis pour 100 réactions (40 ~l chacune) dans un protocole avec volume final de 50 ~l.
Le kit contenait un ensemble d'étalons de virion VIH
(ci-après "VirionStandard") comme expliqué plus haut (104, 103, 102 et 10 copies/~l, fournis pour 4 séries de tests), qui permettaient une mesure précise de la concentration d~ARN de virion VIH du plasma/sérum. Le kit contenait également un ADN de VIH de plasmide (102 copies par réaction, pour 4 séries de tests), qui servait de contrôle de signal d'amplification positif, ainsi qu'en option un ARN de tanscrit hétérologue, ajouté à chacun des échantillons à examiner et servant de contrôle interne (ci-après "CI") (103 copies par réaction, fourni pour 100 réactions).
7.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT
Le kit de quantification de génome de VIH doit de préférence être conservé à -20~C dans un congélateur à
température constante ou à 4~C avec utilisation d'une solution de conservation d'enzyme appropriée. S'il est stocké dans des conditions appropriées, le produit reste stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une étiquette.
No. Réactif Volume Quantité Commentaires VirionStandard de VIH
la VirionStandard 1 (104 copies/lll) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'échantillon Ib VirionStandard 2 (103 copies/,ul) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'échantillon Ic VirionStandard 3 (102 copies/lll) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'él~han~illon Id VirionStandard4(10 copies/lll) 0,4ml I Calibrel'ARNd'échantillon le VirionStandard 5 (serum négatif auVlH) 0,4 ml I Contrôle de spécificité (négatif) O
2 ARNt (0,1 mg/ml) I ml I Sert d'ARN support pour l'ARN d'échantillon 3 Tampon de reserve d'ARN 250 111 4 Dissout Ies echantillons d'ARN
4 Mélange d'amplification de VIH, avec arnorces I ml 4 S'llybride à l'ARN de VIH et aux génomes de VIH et amorces de Cl, ~ventuellement d'ADNc Mélange enzymatique 28 111 4 Retrotranscrit l'ARN de cible et amplifie l'ADNc 6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/Ill) 40 ~l I Contrôle de signal (positif) d'ADNc de VIH
7 Cl optimal (103 copies/lll) 1 ml I Contrôle interne d'efficacite d'amplification lice à la TR
8 Eau passée à l'autoclave 40 111 ] Contrôle de signal (négatif) de fond ~ .
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 7.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS
7.3.l. REACTIFS
- Chloroforme (pur pour analyses) - Isopropanol (pur pour analyses) - Ethanol à 75 % (pur pour analyses) - Agarose (exempt de DNase) - Bromure d'éthidium - Solution d'isolement d'ARN
7.3.2. EQUIPEMENTS
- Centrifugeuse à microtube (4~C) - Installation de mise sous vide - Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant - Générateur et bain pour électrophorèse 7.4. PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR
AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE
7.4.l. EXTRACTION D'ARN
l00 ~l d'échantillons de VirionStandard de VIH et de plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 ~l de solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations dans un homogénéiseur. 60 ~l de chloroforme ont été
ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes et laissé reposer sur de la glace pendant l0 minutes. La suspension a été centrifugée à 12.000 g à 4~C pendant 15 minutes.
Après addition de chloroforme et centrifugation, il se formait deux phases: la phase phénol-chloroformi~ue inférieure (~240 ~l) et la phase aqueuse supérieure (~320 ~l). Les ARN restaient exclusivement dans la phase aqueuse, tandis ~ue les ADN et les protéines étaient dans l'interphase et dans la phase organique.
La phase aqeuse (300 ~l) a été transférée dans de nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté
~ et les échantillons ont été conservés à -20~C pendant l heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant l0 minutes à 12.000 g (4~C) et le pellet (pastille) a été
CA 02236842 1998-0~-0~
brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet d'ARN a eté lavé une fois avec de l'éthanol à 75% (500 ,~Ll) sous l'effet d'un vortex, et finalement le pellet d'ARN a été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans ll ,Ul de tampon de réserve d'ARN.
Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune (visible seulement en grande ~uantité) au fond du tube. Il est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher complètement, car le séchage diminue fortement sa l0 solubilité.
7.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION D'ADNc 10 ,ul d'échantillons diARN et de contrôles positif/-négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 ,ul).
40 ~ul de mélange de transcription réverse/amplification (MTRA) (38,9 ,ul de mélange d~amplification de VIH + l,l ~ll de mélange enzymatique) ont été placés dans cha~ue tube.
Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant un cycle thermis~ue (dénommé commercialement Thermal Cycler), à couvercle chauffant.
- 42~C pendant 25 minutes;
- 94~C pendant 5 minutes;
- 35 cycles (94~C pendant 35 s, 55~C pendant 45 s et 72~C pendant 60 s);
- puis 55~C pendant 5 minutes et ensuite 72~C pendant 5 minutes.
7.5. VISUALISATION ET QUANTIFICATION
10 ,ul du mélange post-réactionnel ont été distribués sur du gel d'agarose à 1,596 contenant 0,5 ,ug/ml de bromure d'éthidium et on a effectué une électrophorèse sous 150 V
30 pendant l0 minutes.
Les séquences de VIH spécifi~uement amplifiées pouvaient être visualisées aisément par différences de taille. Les gammes de copies d'ARN de viron VIH dans l00 ,ul d'échantillons de plasma/sérum pouvaient être estimées CA 02236842 1998-o~-o~
WO97/17465 PCT~R96/01736 par comparaison de leurs bandes d'amplification avec celles du VirionStandard de VIH (semi-quantification).
~ xem~le 8: Kit de quantification de génome de virus d'immunodéficience humaine (VIH) pour détection avec un lecteur de densité optique 8.l. INTRODUCTION
Un kit de quantification du génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) selon la présente invention a été conçu pour la détection et la quantification d~ ARN génomique de vIH (y compris tous les génotypes VIH-0, VIH-l et VIH-2) dans tous fluides biologiques exempts de cellules (tels que plasma, sérum, lS liquide séminal, fluide de lavage broncho-alvéolaire, etc.), ainsi que les surnageants de culture. On y a inclus des réactifs pour permettre d'isoler l'ARN viral par une méthode rapide - la transcription réverse de l' ARN de virion VIH en ADNc au moyen de transcriptase réverse du virus de leucémie murine de Moloney cloné - l'amplifica-tion utilisant alors de la Taq ADN polymérase - et finalement la détection quantitative par une procédure d'hybridation liquide liée à la DIG (digoxigénine), qui permettait une limite de détection de l00 copies d' ARN
viral et une gamme de quantification d~environ 2 ordres de grandeur en un seul test en 8 heures. Suffisamment de réactifs étaient fournis pour l00 réactions (40 ~l chacune) dans un protocole avec volume final de 50 ~l.
Le kit contenait un ensemble d'étalons de virion VIH
~VirionStandard" (103, l02, l0 et l copies/~l, fournis pour 4 séries de tests), qui permettaient une mesure précise de la concentration d' ARN de virion VIH du - plasma/sérum. Le kit contenait également un ADN de VIH de plasmide (102 copies par réaction pour 4 séries de tests), qui servait de contrôle de signal d'amplification positif, CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 ainsi qu'en option un ARN de tanscrit hétérologue, ajouté
à chacun des échantillons à examiner et servant de contr81e interne "CI" (103 copies par réaction, fourni pour lO0 réactions).
8.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT
Le kit de quantification de génome de VIH doit de préférence etre conservé à -20~C dans un congélateur à
température constante ou à 4~C avec utilisation d'une solution de conservation d'enzyme appropri~e. S'il est stocké dans des conditions appropriées, le produit reste stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une étiquette.
No. Réactif Volume Quantité Commentaires I Amplification de génome de VIH liée à une ll dnS~ utiOn réverse (TR) et Illdl ~ludge par DIG
VirionStandard de VIH
la Vi-iooJtdl-dard 1 (103 copies/lll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon lb VirionStandard 2 (102 copies/lll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'~h~ntill()n Ic Vi-;ollJl~llddl-l 3 (10 copies/~,ll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon ld VirionStandard 4 (1 copie/lll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'e- h~n~illon D
le VirionStandard 5 (sérum négatif auVlH) 0,4 ml 1 Contrôle de spécificité (négatif) o 2 ARNt (0,1 mg/ml) 1 ml 1 Scrt d'ARN support pour l'ARN d'échantillon 3 Tampon de réserve d'ARN 250 111 4 Dissout les échantillons d'ARN ~, 4 Mélange d'amplification de VIH, avec amorces 1 ml 4 S'hybride à l'ARN de VIH et aux génomes 'J' ~, de VIH et Cl, (5% de DlG-dUTP) d'ADNc Mélange enzymatique 28 ~,11 4 Rétrotranscrit l'ARN de cible et amplifie l'ADNc 6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/~ll) 40 111 1 Contrôle de signal (positif) d'ADNc de VIH
7 ADN de transcrit hétérologue (103 copies/!ll) 1 ml 1 Contrôle interne d'efficacité d'amplification liée à TR
8 Eau passée à l'autoclave 40 1,11 I Contrôle de signal (négatif) de fond Il Hybridation liquidc et détection par DIG
9 Sonde de VIH biotinylée 200 111 1 Capture d'ADNc dc VIH en hybridation liquide
10 Contrôle interne biotinyle, 100 111 I Capture d'ADNc de Cl en hybridation liquide Z
sonde spécifique d'ADN
sonde spécifique d'ADN
11 Tampondcdenaturation 4ml 1 Pcrmetdenaturationd'ADNdsamplifié
12 Tampon d'hybridation 40 ml 1 Permet hybridation de la sonde à l'ADN de cible
13 Tampon dc lavage (10x) 50 ml 1 Elimine l'ADN non-spécifique
14 Billes revêtues de streptavidine (ou microplaque) 200 (8 puits) 1 (24) Capture d'ADNc de VIH hybridé en hybridation liquide
15 Solution de travail anti-DIG-POD 40 ml 1 Se fixe aux molécules DIG du produit spécifiquement amplifié D
16 Solution de substrat ABTS 40 ml 1 Permet le de~lop~"~-,t de couleur en système POD o CA 02236842 1998-0~-0~
8.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS
- 8.3.l. REACTIFS
- Chloroforme (pur pour analyses) - Isopropanol (pur pour analyses) - Ethanol à 75 % (pur pour analyses) - Solution d'isolement d'ARN
- Microplaque revêtue de streptavidine 8.3.2. EQUIPEMENTS
- Centrifugeuse à microtube (4~C) - Installation de mise sous vide - Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant - Bain-marie ou incubateur pour hybridation liquide - Lecteur de densité optique automatisé
8.4. PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR
AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE
8.4.l. EXTRACTION D'ARN
100 ~Ll d'échantillons de VirionStandard de VIH et de plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 ,ul de solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations dans un homogénéiseur. 60 ~l de chloroforme ont été
ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes et laissé reposer sur de la glace pendant l0 minutes. La suspension a été centrifugée à 12.000 g à 4~C pendant 15 minutes.
Après addition de chloroforme et centrifugation, il se formait deux phases: la phase phénol-chloroformique inférieure (~240 ~l) et la phase aqueuse supérieure (-320 ~l). Les ARN restaient exclusivement dans la phase aqueuse, tandis que les ADN et les protéines étaient dans l~interphase et dans la phase organique.
La phase aqeuse (300 ~l) a été transférée dans des nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté
et les échantillons ont été conservés à -20~C pendant heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant l0 minutes à 12.000 g (4~C) et le pellet (pastille) a été
CA 02236842 l998-0~-0~
brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet d'ARN a été lavé une fois avec de l'éthanol a 7596 (500 ,ul) sous l'effet d'un vortex, et ~inalement le pellet d'ARN a été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans 11 ,Ul de tampon de réserve d'ARN.
Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune (visible seulement en grande ~uantité) au fond du tube. Il est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher complètement, car le séchage diminue fortement sa 10 solubilité.
8.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION D'ADNc 10 ~11 d'échantillons d'ARN et de contrôles positif/-négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 ~
40 ~Ll de mélange de transcription réverse/amplification 15 (MTRA) (38,7 ,ul de mélange d'ampli~ication de VIH + 1,1 ,~Ll de mélange enzymati~ue + 0,2 ~Ll de DIG-dUTP) ont été
placés dans chaque tube. Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant un cycle thermis~ue, à couvercle chauffant.
- 42~C pendant 25 minutes;
- 94~C pendant 5 minutes;
- 36 cycles (94~C pendant 35 s, 55~C pendant 45 s et 72~C pendant 60 s);
- puis 55~C pendant 5 minutes et ensuite 72~C pendant 5 minutes.
8.5. DETECTION ET QUANTIFICATION
2 ,ul de produit amplifié (x2) et une dilution par 10 fois (x2) ont été ajoutés dans de nouveaux tubes et mélangés avec 18 ~Ll de solution de dénaturation à
30 température ambiante pendant 10 minutes. Après addition jus~u'à 180 ~Ll de solution d'hybridation ~x4) contenant une sonde de VIH et une sonde de CI, vortex, puis transfert à la pipette dans un puits d'une microplasIue revêtue de streptavidine, puis 2 heures d'incubation à
35 37~C sur une secoueuse, la solution a été jetée et chacrue CA 02236842 l998-o~-o~
wo97/l746s PCT~R96/01736 puits ou alvéole a été lavé 3 fois avec 200 ~l de tampon - de lavage, 200 ~l de solution de substrat ABTS ont été
ajoutés dans chaque puits, suivis d'une incubation de 30 - minutes à 37~C avec agitation. La plaque a été maintenue dans l'obscurité pendant l'incubation. On a lu 1'absorbance à 405 nm. Les nombres de particules de VIH
par ml de chaque échantillon de plasma/sérum peuvent être enregistrés par un système automatique informatisé
utilisant une courbe étalon générée à partir du VirionStandard de VIH (quantification absolue).
~xem~le 9: Kit de quantification de génome de virus d'immunodéficience humaine (VIH) pour détection par fluorescence 9.1. INTRODUCTION
Un kit de quantification du génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) selon la présente invention a été conçu et mis en oeuvre sensiblement comme décrit dans l'exemple 8, sauf que la gamme de quantification était de plus de 4 ordres de grandeur en un seul test en 7 heures.
9.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT
Le kit de quantification de génome de VIH doit de préférence être conservé à -20~C dans un congélateur à
température constante ou à 4~C avec utilisation d'une solution de conservation d~enzyme appropriée. S'il est stocké dans des conditions appropriées, le produit reste stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une étiquette.
No. Réactif Volume Quantité Co~ l,tdiles I A,l.plifi~dlion de génomc de VIH liée à une ll dns~ lion réverse (TR) VirionStandard de VIH
la VirionStandard I (103 copies/!ll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'erh~ntillon Ib VirionStandard 2 (102 copies/~,ll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon Ic Viliul,Stdndard3(10copies/~ul) 0,4ml 1 Calibrel'ARNd'échantillon ~
1d Vil;vllStdndard4(1copie/,ul) 0,4ml I CalibrellARNd'échantillon D
le VirionStandard 5 (sérum négatif au VIH) 0,4 ml 1 Contrale de spécificité (négatif) 2 ARNt (0,1 mg/ml) 1 ml I Sert d'ARN support pour l'ARN d'échantillon 3 Tampon de réserve d'ARN 250 ~,ll 4 Dissout les échantillons d'ARN 1-4 Mélange d'amplification de VIH, avec amorces 1 ml 4 S'hybride à l'ARN de VIH et aux génomes O
de VIH et amorces de Cl d'ADNc ~~n Mélange enzymatique 28 111 4 Rétrotranscrit l'ARN de cible et amplifie l'ADNc 6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/Ill) 40 111 I Contrale de signal (positif) d'ADNc de VIH
7 ADN de transcrit hétérologue (103 copies/lll) 1 ml I ContrBle interne d'efficacité d'amplification liée à TR
8 Eau passée à l'autoclave 40 ,ul I Contrale de signal (négatif) de fond II Hybridation liquide et comptage de fluorescence 9 Microplaque revêtue de sondes de VIH (souches + & -) 8 puits 12 Capture d'ADNc de VIH en hy~l i.;ldlion liquide 10 Mi.:lo~ld.lue revêtue de sonde de CI 8 puits 12 Capture d'ADNc de CI en hybridation liquide 5 11 Tampon de dénaturation 2 ml 1 Permet dénaturation d'ADNds amplifié
12 Tampon d hybridetion 20 ml 1 Permet hybridahon de la sonde à l'ADN de cible 13 Tampon de lavage 100 ml I Retient spécifiquement l ADN amplifié
dans la microplaque 14 rlilo,~l,-o",e 10 ml 1 Permet la détection d ADNds post-amplification CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 9.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS
9.3.1. REACTIFS
- Chloroforme (pur pour analyses) - Isopropanol (pur pour analyses) - Ethanol à 75 % (pur pour analyses) - Solution d'isolement d'ARN
9.3.2. EQUIPEMENTS
- Centrifugeuse à microtube (4~C) - Installation de mise sous vide ou pompe centrifuge - Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant - Bain-marie ou incubateur pour hybridation liquide - Fluorimètre sensible 9.4. PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR
AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE
9.4.1. EXTRACTION D'ARN
100 ~l dléchantillons de VirionStandard de VIH et de plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 ~l de solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations dans un homogénéiseur. 60 ~l de chloro~orme ont été
ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes et laissé reposer sur de la glace pendant 10 minutes. La suspension a été centrifugée à 12.000 g à 4~C pendant 15 minutes.
Après addition de chloroforme et centrifugation, il se ~ormait deux phases: la phase phénol-chloroformi~ue inférieure (~240 ~l) et la phase aqueuse supérieure (~320 ~l). Les ARN restaient exclusivement dans la phase aqueuse, tandis que les ADN et les protéines étaient dans l'interphase et dans la phase organique.
La phase aqeuse (300 ~l) a été transférée dans de nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté
et les échantillons ont été conservés à -20~C pendant 1 heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant 10 minutes à 12.000 g (4~C) et le pellet (pastille) a été
brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet CA 02236842 l998-0~-0~
WO 97/17465 PCTtFR96/01736 d'ARN a été lavé une fois avec de l'éthanol à 75% (500 ~11) ~ sous l'effet d'un vortex, et finalement le pellet d'ARN a été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans 11 - ,~Ll de tampon de réserve d'ARN.
Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune ~visible seulement en grande quantité) au fond du tube. Il est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher complètement, car le séchage diminue fortement sa solubilité.
9.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION D'ADNc 10 ~Ll d'échantillons d'ARN et de contrôles positif/-négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 ~l).
40 ~Ll de mélange de transcription réverse/amplification (MTRA) (38,9 ,ul de mélange d'amplification de VIH + 1,1 ~Ll de mélange enzymatique) ont été placés dans chaque tube.
Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant un cycle thermique, à couvercle chauffant.
- 42~C pendant 25 minutes;
- 94~C pendant 5 minutes;
- 35 cycles (94~C pendant 35 s, 55~C pendant 45 s et 72~C pendant 60 s);
- puis 55~C pendant 5 minutes et ensuite 72~C pendant 5 minutes.
9.5. DETECTION ET QUANTIFICATION
5 ~Ll (x2) du mélange post-réactionnel ont été ajoutés dans de nouveaux tubes et mélangés avec 15 ~Ll de solution de dénaturation à température ambiante pendant 10 minutes.
Après addition jusqu'à 180 ,ul (x2) de solution d'hybridation, vortex, puis trans~ert à la pipette dans un puits d'une microplaS~ue revêtue de sondes de VIH, puis 2 heures d'incubation à 37~C sur une secoueuse, la solution a été jetée et chaque puits ou alvéole a été lavé 3 fois avec 200 ,ul de tampon de lavage. 100 ,ul de solution de fluorochrome ont été ajoutés, suivis par le transfert de CA 02236842 1998-o~-o~
WO97/17465 PCT~R96/01736 la microplaque sur un fluorimètre automatisé pour comptage de fluorescence et édition des résultats.
~ xem~le lO: Kit de quantification de génome de virus d'immunodéficience humaine (VIH) pour détection par chimioluminescence 10.1. INTRODUCTION
Un kit de quantification du génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) selon la présente invention a été concu et mis en oeuvre sensiblement comme décrit dans l'exemple 8, sauf que la gamme de quantification était de plus de 4 ordres de grandeur en un seul test en 7 heures.
10.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT
Le kit de quanti~ication de genome de VIH doit de préférence être conservé à -20~C dans un congélateur à
température constante ou à 4~C avec utilisation d'une solution de conservation d'enzyme appropriée. S'il est stocké dans des conditions appropriées, le produit reste stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une étiquette.
No. Réactif Volume Quantité Co~ lailes . u, I Amplification de génome de VIH liée à une ll àlls~ I iplil)ll réverse (TR) VirionStandard de VIH
la VirionStandard I (103 copies/~ll) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'échantillon Ib Vil ;onSldl~dard 2 (102 copies/lll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon Ic VirionStandard 3 (10 copies/lll) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'échantillon Id VirionStandard 4 (I copie/~Ll) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'échantillon D
le VirionStandard 5 (sérum négatif auVlH) 0,4 ml I Contrôle de s~ificilé (négatifl 2 ARNt (0,1 mg/ml) I ml I Scrt d'ARN support pour l'ARN d'échantillon ,0 3 Tampon de réserve d'ARN 250 ,ul 4 Dissout les échantillons d'ARN
4 Mélange d'amplification de VIH, avcc amorces I ml 4 S'hybride à l'ARN de VIH et aux génomes de VIH et amorces de CI biotinylées d'ADNc O
Melange enzymatique 28 ~,ll 4 Rétrotranscrit l'ARN de cible et o amplifie l'ADNc 6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/Ill) 40 ~,ll I Contrôle de signal (positif) d'ADNc dc VIH
7 ADN de transcrit hétérologue (103 copies/lll) I ml I Contrôle interne d'efficacite d'amplification liée à TR
8 Eau passée à l'autoclave 40 ,ul I Contrôle de signal (négatif) de fond Il Hybridation liquide et Illal~ludge par chimiolulllillescence 9 Sonde sy~;c~ ue pour VIH 100 ~l I S'hybride spécifiquement à l'ADNc de VIH
10 Sonde ~I,éciQ.lue de l'ADNc de CI 100 111 I S'hybride spécifiquement à l'ADNc de Cl Il Tampon de dénaturation 5 ml I Permet d~llaluldlion d'ADNds amplifié
12 Tampon d'hybridation 50 ml 1 Permet hybridation de la sonde à l'ADN de cible ~,, 13 Tampon de lavage (x10) 50 ml 1 Elimine l'ADN non-s~eciri-lue dans la ~ o~ld~ e 14 Billes revêtues de streptavidine (ou .n;c,.",la.lue)200 (8 puits) 1 (24) Capture d'ADNc de VIH hybridé en hyb, iddlioll liquide 15 Solution de travail anti-ADNds-PAL 10 ml 1 Marquage d'ADN cible hybridé
16 Solution de substrat de chimiol~ .oe 10 ml I Permet détection par ll l " ,;"(x~,~ce et q~~an~ifir~tion D
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 10.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS
10.3.1. REACTIFS
- Chloroforme (pur pour analyses) - Isopropanol (pur pour analyses) - Ethanol à 75 ~ (pur pour analyses) - Solution d'isolement d'ARN
10.3.2. EQUIPEMENTS
- Centrifugeuse à microtube (4~C) - Installation de mise sous vide ou pompe centrifuge - Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant - Bain-marie ou incubateur pour hybridation li~uide - Luminomètre 10.4. PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR
AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE
10 4.1. EXTRACTION D'ARN
100 ~1 d'échantillons de VirionStandard de VIH et de plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 ~l de solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations dans un homogénéiseur. 60 ~l de chloroforme ont été
ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes et laissé reposer sur de la glace pendant 10 minutes. La suspension a été centrifugée à 12.000 g à 4~C pendant 15 minutes.
Après addition de chloro~orme et centrifugation, il se formait deux phases: la phase phénol-chloroformique inférieure (-240 ~1) et la phase aqueuse supérieure (-320 ~1). Les ARN restaient exclusivement dans la phase aqueuse, tandis que les ADN et les protéines étaient dans l'interphase et dans la phase organique.
La phase aqeuse (300 ~1) a été transférée dans de nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté
et les échantillons ont été conservés à -20~C pendant 1 heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant 10 minutes à 12.000 g (4~C) et le pellet (pastille) a été
brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet CA 02236842 1998-0~-0~
d'ARN a été lavé une fois avec de l'éthanol à 75% (500 ~l) sous l'effet d'un vortex, et finalement le pellet d'ARN a été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans ll ~1 de tampon de réserve d'ARN.
Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune (visible seulement en grande quantité) au fond du tube. Il est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher complètement, car le séchage diminue fortement sa solubilité.
l0 l0.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION
D'ADNc 10 ~Ll d'échantillons d'ARN et de contrôles positif/-négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 ~l).
40 ~ll de mélange de transcription réverse/amplification (MTRA) (38,9 ~Ll de mélange d'amplification de VIH + l,l ,ul de mélange enzymatique) ont été placés dans chaque tube.
Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant un cycle thermique, à couvercle chauffant.
- 42~C pendant 25 minutes;
- 94~C pendant 5 minutes;
- 35 cycles (94~C pendant 35 s, 55~C pendant 45 s et 72~C pendant 60 s);
- puis 55~C pendant 5 minutes et ensuite 72~C pendant 5 minutes.
25 l0.5. DETECTION ET QUANTIFICATION
5 ,ul (x2) du mélange post-réactionnel ont été ajoutés dans 2 tubes frais et mélangés avec 15 ~l de solution de dénaturation à température ambiante pendant l0 minutes.
Après addition jusqu'à 180 !ll (x2) de solution 30 d'hybridation contenant une sonde spécifique pour VIH ou une sonde spécifique pour l'ADN du contrôle interne (CI), vortex, puis transfert à la pipette dans le tube de billes revêtues de streptavidine ou transfert dans le puits d'une microplaque revêtue de streptavidine, puis 2 heures 35 d'incubation à 37~C sur une secoueuse, la solution a été
-CA 02236842 1998-o~-o~
W097/17465 PCT~R96/01736 jetée et chaque puits ou alvéole a été lavé 3 fois avec 200 ~1 de tampon de lavage. 200 ~1 des anticorps anti-ADNds conjugués avec de la phosphatase alcaline (PAL) ont été ajoutés, suivis d'une incubation pendant 30 minutes à
37~C sur une secoueuse. Après lavage 3 fois avec 200 ~1 de tampon de lavage, 100 ~1 de solution de substrat de chimioluminescence ont été ajoutés. Ensuite, la microplaque a été immédiatement transférée sur un luminomètre pour comptage de chimioluminescence et édition des résultats. Les nombres de particules de VIH par ml de chaque échantillon de plasma/sérum peuvent être enregistrés par un système automatique informatisé
utilisant la courbe étalon générée à partir du VirionStandard de VIH (quantification absolue).
~xem~le 11: Kit de quantification de génome de virus de l'hépatite B humaine (VHB) pour détection par chimioluminescence 11.1. INTRODUCTIOM
Un kit de quantification du génome du virus de l'hépatite B humaine (VHB) selon la présente invention a été conçu pour la détection et la quantification d'ADN
génomique de VHB dans tous fluides biologiques exempts de cellules (tels que plasma, sérum, liquide séminal, fluide de lavage broncho-alvéolaire, etc.). On y a inclus des réactifs pour permettre d~isoler l'ADN viral par une méthode rapide, l'amplification de l'ADN du virion VHB
avec de la Taq ADN polymérase et la détection quantitative par une procédure d'hybridation liquide liée à la chimioluminescence, ~ui permettait une limite de détection de 50 copies d'ADN viral et une gamme de quantification de ~ plus de 4 ordres de grandeur en un seul test en 5 heures.
Suffisamment de réactifs étaient fournis pour 100 CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 réactions (40 ~l chacune) dans un protocole avec volume final de 50 ~
Le kit contenait un ensemble dletalons de virion VHB
"VirionStandard" (104, 103, 102 et 10 copies/~l, fournis pour 4 séries de tests), ~ui permettaient une mesure précise de la concentration d'ADN de virion VHB du plasma/sérum. Le kit contenait également un ADN de VHB de plasmide (103 copies par réaction, pour 4 séries de tests), qui servait de contrôle de si~nal d'amplification positif, ainsi ~u'en option un ADN de plasmide hétérologue, ajouté à chacun des échantillons à examiner et servant de contrôle interne "CI" (103 copies par réaction, fourni pour 100 réactions).
11. 2 . LISTE DES COMPOSANTS DU KIT
Le kit de quantification de génome de VHB doit de préférence être conservé à -20~C dans un congélateur à
température constante ou à 4~C avec utilisation d'une solution de conservation d'enzyme appropriée. S'il est stocké dans des conditions appropriées, le produit reste stable jus~u'à une date de contrôle imprimée sur une étiquette.
No. Reactif Volume Quantite Commentaires l Amplification de ~énome de VHB
VirionStandard de VHB tn la VirionStandard I (104 copies/lll) 0,2 ml I Calibre l'ADN d'echantillon Ib VirionStandard 2 (103 copies/lll) 0,2 ml I Calibre l'ADN d'echantillon Ic VirionStandard 3 (102 copies/lll) 0,2 ml I Calibre l'ADN d'~clIantillon ld VirionStandard 4 (10 copies/!ll) 0,2 ml I Calibre l'ADN d'echalItillon Ie VirionStandard 5 (serum negatif au VHB) 0,2 ml I Contrôle de spe~cificite (negatif) 2 Melange d'amplification de VHB, avec amorces 1,1 ml 4 S'llybride au g~nome d'ADN de VHB O
3 ADN polymérase Taq 25 Ill 1 Amplifie l'ADN de cible 4 ADN de VHB de plasmide (102 copies d'ADN/Ill) 50 ~ll I Contrôle de si~nal (positif) d'ADNc de VHB
ADN de plasmide hetérologue (102 copie~s d'ADN/Ill) I ml 1 Contr(31e interne d'efficacite d'amplification ~ ~, 6 Eau pass~ à l'autoclave 100 Ill I Contrôle de signal (négatif) de fond 7 Tampon de decllarge ou liberation d'ADN
Il Hybridation liquide et marquage par chimioluminescellce 8 Sonde spécifique pour VHB 100 !ll I S'hybride specifiquement à l'ADNc de VHB
9 Sonde spécifique de l'ADN de Cl 100 Ill I S'hybride specifiquement à l'ADN de Cl 10 Tampon de dCnaturation 5 ml I Permet denaturatiolI d'ADNds amplifie~
Il Tampon d'hybridation 50 ml I Permet hybridatioll de la sonde à l'ADN de cible 12 Tampondelavage (x10) 50ml I Eliminel'ADNnon-specifique 13 Billes revetues de streptavidine (ou microplaque)200 (8 puits) I (24) Capture d'ADNc de VHB hybride en hybridatiolI liquide 1~ Solution de tMvail anti-ADNds-PAL 10 ml I Marquage d'ADN cible hybride 15 Solution de substrat de chimiol-"ni-,e~c "ce 10 ml I Permet detection par lulllillescell~e et quantification CA 02236842 l998-0~-0~
11-.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS
- Centrifugeuse à microtube - Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant - Bain-marie pour hybridation liquide - Luminomètre 11.4. PROTOCOLE POUR PREPARATION D'ECHANTILLON ET
AMPLIFICATION
11.4.1. PREPARATION D'ECHANTILLON
50 ,ul d'échantillons de VirionStandard de VHB et de 10 plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 50 ,ul de tampon de décharge ou libération d'ADN, et on a ensuite laissé reposer à 98~C pendant 10 minutes.
Après centrifugation, les ADN restaient exclusivement dans la phase liquide (10-15 ,ul), tandis que les protéines 15 étaient dans le pellet.
11.4.2. AMPLIFICATION D'ADNc 10 ~l de la phase liquide ont été transférés dans de nouveaux tubes (200 ,ul). 40 ,ul de mélange d'amplification de VHB + 5 ,ul de Taq ADN polymérase) ont été placés dans 20 chaque tube. Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant un cycle thermique, à couvercle chauffant.
- 94~C pendant 5 minutes;
- 35 cycles (94~C pendant 35 s, 60~C pendant 45 s et 72~C pendant 60 s);
- puis encore 72~C pendant 5 minutes.
11.5. VISUALISATION ET QUANTIFICATION
5 ~l (x2) du mélange post-réactionnel ont été ajoutés dans 2 nouveaux tubes en parallèle et mélangés avec 15 ,Ul de solution de dénaturation à température ambiante pendant 30 10 minutes. Après addition jusqu'à 180 ~l (x2) de solution d'hybridation contenant une sonde spécifique pour VHB ou une sonde spécifique pour l'ADN du contr81e interne (CI), vortex, puis transfert à la pipette dans le tube de billes revetues de streptavidine ou transfert dans le puits d'une 35 microplaque revetue de streptavidine, puis 2 heures CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 d'incubation à 37~C sur une secoueuse, la solution a été
jetée et chaque puits ou alvéole a été lave 3 fois avec 200 ~1 de tampon de lavage. 200 ~1 des anticorps anti-ADNds conjugués avec de la phosphatase alcaline (PAL) ont été ajoutés, suivis d'une incubation pendant 30 minutes à
37~C sur une secoueuse. Après lavage 3 fois avec 200 ~1 de tampon de lavage, 100 ~1 de solution de substrat de chimioluminescence ont été ajoutés. Ensuite, la microplaque a été immédiatement transférée sur un luminomètre pour comptage de chimioluminescence et édition des résultats. Les nombres de particules de VHB par ml de chaque échantillon de plasma/sérum peuvent être enregistrés par un système automati~ue informatisé
utilisant la courbe étalon générée à partir du VirionStandard de VHB (quantification absolue).
8.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS
- 8.3.l. REACTIFS
- Chloroforme (pur pour analyses) - Isopropanol (pur pour analyses) - Ethanol à 75 % (pur pour analyses) - Solution d'isolement d'ARN
- Microplaque revêtue de streptavidine 8.3.2. EQUIPEMENTS
- Centrifugeuse à microtube (4~C) - Installation de mise sous vide - Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant - Bain-marie ou incubateur pour hybridation liquide - Lecteur de densité optique automatisé
8.4. PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR
AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE
8.4.l. EXTRACTION D'ARN
100 ~Ll d'échantillons de VirionStandard de VIH et de plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 ,ul de solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations dans un homogénéiseur. 60 ~l de chloroforme ont été
ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes et laissé reposer sur de la glace pendant l0 minutes. La suspension a été centrifugée à 12.000 g à 4~C pendant 15 minutes.
Après addition de chloroforme et centrifugation, il se formait deux phases: la phase phénol-chloroformique inférieure (~240 ~l) et la phase aqueuse supérieure (-320 ~l). Les ARN restaient exclusivement dans la phase aqueuse, tandis que les ADN et les protéines étaient dans l~interphase et dans la phase organique.
La phase aqeuse (300 ~l) a été transférée dans des nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté
et les échantillons ont été conservés à -20~C pendant heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant l0 minutes à 12.000 g (4~C) et le pellet (pastille) a été
CA 02236842 l998-0~-0~
brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet d'ARN a été lavé une fois avec de l'éthanol a 7596 (500 ,ul) sous l'effet d'un vortex, et ~inalement le pellet d'ARN a été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans 11 ,Ul de tampon de réserve d'ARN.
Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune (visible seulement en grande ~uantité) au fond du tube. Il est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher complètement, car le séchage diminue fortement sa 10 solubilité.
8.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION D'ADNc 10 ~11 d'échantillons d'ARN et de contrôles positif/-négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 ~
40 ~Ll de mélange de transcription réverse/amplification 15 (MTRA) (38,7 ,ul de mélange d'ampli~ication de VIH + 1,1 ,~Ll de mélange enzymati~ue + 0,2 ~Ll de DIG-dUTP) ont été
placés dans chaque tube. Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant un cycle thermis~ue, à couvercle chauffant.
- 42~C pendant 25 minutes;
- 94~C pendant 5 minutes;
- 36 cycles (94~C pendant 35 s, 55~C pendant 45 s et 72~C pendant 60 s);
- puis 55~C pendant 5 minutes et ensuite 72~C pendant 5 minutes.
8.5. DETECTION ET QUANTIFICATION
2 ,ul de produit amplifié (x2) et une dilution par 10 fois (x2) ont été ajoutés dans de nouveaux tubes et mélangés avec 18 ~Ll de solution de dénaturation à
30 température ambiante pendant 10 minutes. Après addition jus~u'à 180 ~Ll de solution d'hybridation ~x4) contenant une sonde de VIH et une sonde de CI, vortex, puis transfert à la pipette dans un puits d'une microplasIue revêtue de streptavidine, puis 2 heures d'incubation à
35 37~C sur une secoueuse, la solution a été jetée et chacrue CA 02236842 l998-o~-o~
wo97/l746s PCT~R96/01736 puits ou alvéole a été lavé 3 fois avec 200 ~l de tampon - de lavage, 200 ~l de solution de substrat ABTS ont été
ajoutés dans chaque puits, suivis d'une incubation de 30 - minutes à 37~C avec agitation. La plaque a été maintenue dans l'obscurité pendant l'incubation. On a lu 1'absorbance à 405 nm. Les nombres de particules de VIH
par ml de chaque échantillon de plasma/sérum peuvent être enregistrés par un système automatique informatisé
utilisant une courbe étalon générée à partir du VirionStandard de VIH (quantification absolue).
~xem~le 9: Kit de quantification de génome de virus d'immunodéficience humaine (VIH) pour détection par fluorescence 9.1. INTRODUCTION
Un kit de quantification du génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) selon la présente invention a été conçu et mis en oeuvre sensiblement comme décrit dans l'exemple 8, sauf que la gamme de quantification était de plus de 4 ordres de grandeur en un seul test en 7 heures.
9.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT
Le kit de quantification de génome de VIH doit de préférence être conservé à -20~C dans un congélateur à
température constante ou à 4~C avec utilisation d'une solution de conservation d~enzyme appropriée. S'il est stocké dans des conditions appropriées, le produit reste stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une étiquette.
No. Réactif Volume Quantité Co~ l,tdiles I A,l.plifi~dlion de génomc de VIH liée à une ll dns~ lion réverse (TR) VirionStandard de VIH
la VirionStandard I (103 copies/!ll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'erh~ntillon Ib VirionStandard 2 (102 copies/~,ll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon Ic Viliul,Stdndard3(10copies/~ul) 0,4ml 1 Calibrel'ARNd'échantillon ~
1d Vil;vllStdndard4(1copie/,ul) 0,4ml I CalibrellARNd'échantillon D
le VirionStandard 5 (sérum négatif au VIH) 0,4 ml 1 Contrale de spécificité (négatif) 2 ARNt (0,1 mg/ml) 1 ml I Sert d'ARN support pour l'ARN d'échantillon 3 Tampon de réserve d'ARN 250 ~,ll 4 Dissout les échantillons d'ARN 1-4 Mélange d'amplification de VIH, avec amorces 1 ml 4 S'hybride à l'ARN de VIH et aux génomes O
de VIH et amorces de Cl d'ADNc ~~n Mélange enzymatique 28 111 4 Rétrotranscrit l'ARN de cible et amplifie l'ADNc 6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/Ill) 40 111 I Contrale de signal (positif) d'ADNc de VIH
7 ADN de transcrit hétérologue (103 copies/lll) 1 ml I ContrBle interne d'efficacité d'amplification liée à TR
8 Eau passée à l'autoclave 40 ,ul I Contrale de signal (négatif) de fond II Hybridation liquide et comptage de fluorescence 9 Microplaque revêtue de sondes de VIH (souches + & -) 8 puits 12 Capture d'ADNc de VIH en hy~l i.;ldlion liquide 10 Mi.:lo~ld.lue revêtue de sonde de CI 8 puits 12 Capture d'ADNc de CI en hybridation liquide 5 11 Tampon de dénaturation 2 ml 1 Permet dénaturation d'ADNds amplifié
12 Tampon d hybridetion 20 ml 1 Permet hybridahon de la sonde à l'ADN de cible 13 Tampon de lavage 100 ml I Retient spécifiquement l ADN amplifié
dans la microplaque 14 rlilo,~l,-o",e 10 ml 1 Permet la détection d ADNds post-amplification CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 9.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS
9.3.1. REACTIFS
- Chloroforme (pur pour analyses) - Isopropanol (pur pour analyses) - Ethanol à 75 % (pur pour analyses) - Solution d'isolement d'ARN
9.3.2. EQUIPEMENTS
- Centrifugeuse à microtube (4~C) - Installation de mise sous vide ou pompe centrifuge - Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant - Bain-marie ou incubateur pour hybridation liquide - Fluorimètre sensible 9.4. PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR
AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE
9.4.1. EXTRACTION D'ARN
100 ~l dléchantillons de VirionStandard de VIH et de plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 ~l de solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations dans un homogénéiseur. 60 ~l de chloro~orme ont été
ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes et laissé reposer sur de la glace pendant 10 minutes. La suspension a été centrifugée à 12.000 g à 4~C pendant 15 minutes.
Après addition de chloroforme et centrifugation, il se ~ormait deux phases: la phase phénol-chloroformi~ue inférieure (~240 ~l) et la phase aqueuse supérieure (~320 ~l). Les ARN restaient exclusivement dans la phase aqueuse, tandis que les ADN et les protéines étaient dans l'interphase et dans la phase organique.
La phase aqeuse (300 ~l) a été transférée dans de nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté
et les échantillons ont été conservés à -20~C pendant 1 heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant 10 minutes à 12.000 g (4~C) et le pellet (pastille) a été
brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet CA 02236842 l998-0~-0~
WO 97/17465 PCTtFR96/01736 d'ARN a été lavé une fois avec de l'éthanol à 75% (500 ~11) ~ sous l'effet d'un vortex, et finalement le pellet d'ARN a été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans 11 - ,~Ll de tampon de réserve d'ARN.
Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune ~visible seulement en grande quantité) au fond du tube. Il est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher complètement, car le séchage diminue fortement sa solubilité.
9.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION D'ADNc 10 ~Ll d'échantillons d'ARN et de contrôles positif/-négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 ~l).
40 ~Ll de mélange de transcription réverse/amplification (MTRA) (38,9 ,ul de mélange d'amplification de VIH + 1,1 ~Ll de mélange enzymatique) ont été placés dans chaque tube.
Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant un cycle thermique, à couvercle chauffant.
- 42~C pendant 25 minutes;
- 94~C pendant 5 minutes;
- 35 cycles (94~C pendant 35 s, 55~C pendant 45 s et 72~C pendant 60 s);
- puis 55~C pendant 5 minutes et ensuite 72~C pendant 5 minutes.
9.5. DETECTION ET QUANTIFICATION
5 ~Ll (x2) du mélange post-réactionnel ont été ajoutés dans de nouveaux tubes et mélangés avec 15 ~Ll de solution de dénaturation à température ambiante pendant 10 minutes.
Après addition jusqu'à 180 ,ul (x2) de solution d'hybridation, vortex, puis trans~ert à la pipette dans un puits d'une microplaS~ue revêtue de sondes de VIH, puis 2 heures d'incubation à 37~C sur une secoueuse, la solution a été jetée et chaque puits ou alvéole a été lavé 3 fois avec 200 ,ul de tampon de lavage. 100 ,ul de solution de fluorochrome ont été ajoutés, suivis par le transfert de CA 02236842 1998-o~-o~
WO97/17465 PCT~R96/01736 la microplaque sur un fluorimètre automatisé pour comptage de fluorescence et édition des résultats.
~ xem~le lO: Kit de quantification de génome de virus d'immunodéficience humaine (VIH) pour détection par chimioluminescence 10.1. INTRODUCTION
Un kit de quantification du génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) selon la présente invention a été concu et mis en oeuvre sensiblement comme décrit dans l'exemple 8, sauf que la gamme de quantification était de plus de 4 ordres de grandeur en un seul test en 7 heures.
10.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT
Le kit de quanti~ication de genome de VIH doit de préférence être conservé à -20~C dans un congélateur à
température constante ou à 4~C avec utilisation d'une solution de conservation d'enzyme appropriée. S'il est stocké dans des conditions appropriées, le produit reste stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une étiquette.
No. Réactif Volume Quantité Co~ lailes . u, I Amplification de génome de VIH liée à une ll àlls~ I iplil)ll réverse (TR) VirionStandard de VIH
la VirionStandard I (103 copies/~ll) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'échantillon Ib Vil ;onSldl~dard 2 (102 copies/lll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon Ic VirionStandard 3 (10 copies/lll) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'échantillon Id VirionStandard 4 (I copie/~Ll) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'échantillon D
le VirionStandard 5 (sérum négatif auVlH) 0,4 ml I Contrôle de s~ificilé (négatifl 2 ARNt (0,1 mg/ml) I ml I Scrt d'ARN support pour l'ARN d'échantillon ,0 3 Tampon de réserve d'ARN 250 ,ul 4 Dissout les échantillons d'ARN
4 Mélange d'amplification de VIH, avcc amorces I ml 4 S'hybride à l'ARN de VIH et aux génomes de VIH et amorces de CI biotinylées d'ADNc O
Melange enzymatique 28 ~,ll 4 Rétrotranscrit l'ARN de cible et o amplifie l'ADNc 6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/Ill) 40 ~,ll I Contrôle de signal (positif) d'ADNc dc VIH
7 ADN de transcrit hétérologue (103 copies/lll) I ml I Contrôle interne d'efficacite d'amplification liée à TR
8 Eau passée à l'autoclave 40 ,ul I Contrôle de signal (négatif) de fond Il Hybridation liquide et Illal~ludge par chimiolulllillescence 9 Sonde sy~;c~ ue pour VIH 100 ~l I S'hybride spécifiquement à l'ADNc de VIH
10 Sonde ~I,éciQ.lue de l'ADNc de CI 100 111 I S'hybride spécifiquement à l'ADNc de Cl Il Tampon de dénaturation 5 ml I Permet d~llaluldlion d'ADNds amplifié
12 Tampon d'hybridation 50 ml 1 Permet hybridation de la sonde à l'ADN de cible ~,, 13 Tampon de lavage (x10) 50 ml 1 Elimine l'ADN non-s~eciri-lue dans la ~ o~ld~ e 14 Billes revêtues de streptavidine (ou .n;c,.",la.lue)200 (8 puits) 1 (24) Capture d'ADNc de VIH hybridé en hyb, iddlioll liquide 15 Solution de travail anti-ADNds-PAL 10 ml 1 Marquage d'ADN cible hybridé
16 Solution de substrat de chimiol~ .oe 10 ml I Permet détection par ll l " ,;"(x~,~ce et q~~an~ifir~tion D
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 10.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS
10.3.1. REACTIFS
- Chloroforme (pur pour analyses) - Isopropanol (pur pour analyses) - Ethanol à 75 ~ (pur pour analyses) - Solution d'isolement d'ARN
10.3.2. EQUIPEMENTS
- Centrifugeuse à microtube (4~C) - Installation de mise sous vide ou pompe centrifuge - Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant - Bain-marie ou incubateur pour hybridation li~uide - Luminomètre 10.4. PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR
AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE
10 4.1. EXTRACTION D'ARN
100 ~1 d'échantillons de VirionStandard de VIH et de plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 ~l de solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations dans un homogénéiseur. 60 ~l de chloroforme ont été
ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes et laissé reposer sur de la glace pendant 10 minutes. La suspension a été centrifugée à 12.000 g à 4~C pendant 15 minutes.
Après addition de chloro~orme et centrifugation, il se formait deux phases: la phase phénol-chloroformique inférieure (-240 ~1) et la phase aqueuse supérieure (-320 ~1). Les ARN restaient exclusivement dans la phase aqueuse, tandis que les ADN et les protéines étaient dans l'interphase et dans la phase organique.
La phase aqeuse (300 ~1) a été transférée dans de nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté
et les échantillons ont été conservés à -20~C pendant 1 heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant 10 minutes à 12.000 g (4~C) et le pellet (pastille) a été
brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet CA 02236842 1998-0~-0~
d'ARN a été lavé une fois avec de l'éthanol à 75% (500 ~l) sous l'effet d'un vortex, et finalement le pellet d'ARN a été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans ll ~1 de tampon de réserve d'ARN.
Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune (visible seulement en grande quantité) au fond du tube. Il est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher complètement, car le séchage diminue fortement sa solubilité.
l0 l0.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION
D'ADNc 10 ~Ll d'échantillons d'ARN et de contrôles positif/-négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 ~l).
40 ~ll de mélange de transcription réverse/amplification (MTRA) (38,9 ~Ll de mélange d'amplification de VIH + l,l ,ul de mélange enzymatique) ont été placés dans chaque tube.
Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant un cycle thermique, à couvercle chauffant.
- 42~C pendant 25 minutes;
- 94~C pendant 5 minutes;
- 35 cycles (94~C pendant 35 s, 55~C pendant 45 s et 72~C pendant 60 s);
- puis 55~C pendant 5 minutes et ensuite 72~C pendant 5 minutes.
25 l0.5. DETECTION ET QUANTIFICATION
5 ,ul (x2) du mélange post-réactionnel ont été ajoutés dans 2 tubes frais et mélangés avec 15 ~l de solution de dénaturation à température ambiante pendant l0 minutes.
Après addition jusqu'à 180 !ll (x2) de solution 30 d'hybridation contenant une sonde spécifique pour VIH ou une sonde spécifique pour l'ADN du contrôle interne (CI), vortex, puis transfert à la pipette dans le tube de billes revêtues de streptavidine ou transfert dans le puits d'une microplaque revêtue de streptavidine, puis 2 heures 35 d'incubation à 37~C sur une secoueuse, la solution a été
-CA 02236842 1998-o~-o~
W097/17465 PCT~R96/01736 jetée et chaque puits ou alvéole a été lavé 3 fois avec 200 ~1 de tampon de lavage. 200 ~1 des anticorps anti-ADNds conjugués avec de la phosphatase alcaline (PAL) ont été ajoutés, suivis d'une incubation pendant 30 minutes à
37~C sur une secoueuse. Après lavage 3 fois avec 200 ~1 de tampon de lavage, 100 ~1 de solution de substrat de chimioluminescence ont été ajoutés. Ensuite, la microplaque a été immédiatement transférée sur un luminomètre pour comptage de chimioluminescence et édition des résultats. Les nombres de particules de VIH par ml de chaque échantillon de plasma/sérum peuvent être enregistrés par un système automatique informatisé
utilisant la courbe étalon générée à partir du VirionStandard de VIH (quantification absolue).
~xem~le 11: Kit de quantification de génome de virus de l'hépatite B humaine (VHB) pour détection par chimioluminescence 11.1. INTRODUCTIOM
Un kit de quantification du génome du virus de l'hépatite B humaine (VHB) selon la présente invention a été conçu pour la détection et la quantification d'ADN
génomique de VHB dans tous fluides biologiques exempts de cellules (tels que plasma, sérum, liquide séminal, fluide de lavage broncho-alvéolaire, etc.). On y a inclus des réactifs pour permettre d~isoler l'ADN viral par une méthode rapide, l'amplification de l'ADN du virion VHB
avec de la Taq ADN polymérase et la détection quantitative par une procédure d'hybridation liquide liée à la chimioluminescence, ~ui permettait une limite de détection de 50 copies d'ADN viral et une gamme de quantification de ~ plus de 4 ordres de grandeur en un seul test en 5 heures.
Suffisamment de réactifs étaient fournis pour 100 CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 réactions (40 ~l chacune) dans un protocole avec volume final de 50 ~
Le kit contenait un ensemble dletalons de virion VHB
"VirionStandard" (104, 103, 102 et 10 copies/~l, fournis pour 4 séries de tests), ~ui permettaient une mesure précise de la concentration d'ADN de virion VHB du plasma/sérum. Le kit contenait également un ADN de VHB de plasmide (103 copies par réaction, pour 4 séries de tests), qui servait de contrôle de si~nal d'amplification positif, ainsi ~u'en option un ADN de plasmide hétérologue, ajouté à chacun des échantillons à examiner et servant de contrôle interne "CI" (103 copies par réaction, fourni pour 100 réactions).
11. 2 . LISTE DES COMPOSANTS DU KIT
Le kit de quantification de génome de VHB doit de préférence être conservé à -20~C dans un congélateur à
température constante ou à 4~C avec utilisation d'une solution de conservation d'enzyme appropriée. S'il est stocké dans des conditions appropriées, le produit reste stable jus~u'à une date de contrôle imprimée sur une étiquette.
No. Reactif Volume Quantite Commentaires l Amplification de ~énome de VHB
VirionStandard de VHB tn la VirionStandard I (104 copies/lll) 0,2 ml I Calibre l'ADN d'echantillon Ib VirionStandard 2 (103 copies/lll) 0,2 ml I Calibre l'ADN d'echantillon Ic VirionStandard 3 (102 copies/lll) 0,2 ml I Calibre l'ADN d'~clIantillon ld VirionStandard 4 (10 copies/!ll) 0,2 ml I Calibre l'ADN d'echalItillon Ie VirionStandard 5 (serum negatif au VHB) 0,2 ml I Contrôle de spe~cificite (negatif) 2 Melange d'amplification de VHB, avec amorces 1,1 ml 4 S'llybride au g~nome d'ADN de VHB O
3 ADN polymérase Taq 25 Ill 1 Amplifie l'ADN de cible 4 ADN de VHB de plasmide (102 copies d'ADN/Ill) 50 ~ll I Contrôle de si~nal (positif) d'ADNc de VHB
ADN de plasmide hetérologue (102 copie~s d'ADN/Ill) I ml 1 Contr(31e interne d'efficacite d'amplification ~ ~, 6 Eau pass~ à l'autoclave 100 Ill I Contrôle de signal (négatif) de fond 7 Tampon de decllarge ou liberation d'ADN
Il Hybridation liquide et marquage par chimioluminescellce 8 Sonde spécifique pour VHB 100 !ll I S'hybride specifiquement à l'ADNc de VHB
9 Sonde spécifique de l'ADN de Cl 100 Ill I S'hybride specifiquement à l'ADN de Cl 10 Tampon de dCnaturation 5 ml I Permet denaturatiolI d'ADNds amplifie~
Il Tampon d'hybridation 50 ml I Permet hybridatioll de la sonde à l'ADN de cible 12 Tampondelavage (x10) 50ml I Eliminel'ADNnon-specifique 13 Billes revetues de streptavidine (ou microplaque)200 (8 puits) I (24) Capture d'ADNc de VHB hybride en hybridatiolI liquide 1~ Solution de tMvail anti-ADNds-PAL 10 ml I Marquage d'ADN cible hybride 15 Solution de substrat de chimiol-"ni-,e~c "ce 10 ml I Permet detection par lulllillescell~e et quantification CA 02236842 l998-0~-0~
11-.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS
- Centrifugeuse à microtube - Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant - Bain-marie pour hybridation liquide - Luminomètre 11.4. PROTOCOLE POUR PREPARATION D'ECHANTILLON ET
AMPLIFICATION
11.4.1. PREPARATION D'ECHANTILLON
50 ,ul d'échantillons de VirionStandard de VHB et de 10 plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 50 ,ul de tampon de décharge ou libération d'ADN, et on a ensuite laissé reposer à 98~C pendant 10 minutes.
Après centrifugation, les ADN restaient exclusivement dans la phase liquide (10-15 ,ul), tandis que les protéines 15 étaient dans le pellet.
11.4.2. AMPLIFICATION D'ADNc 10 ~l de la phase liquide ont été transférés dans de nouveaux tubes (200 ,ul). 40 ,ul de mélange d'amplification de VHB + 5 ,ul de Taq ADN polymérase) ont été placés dans 20 chaque tube. Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant un cycle thermique, à couvercle chauffant.
- 94~C pendant 5 minutes;
- 35 cycles (94~C pendant 35 s, 60~C pendant 45 s et 72~C pendant 60 s);
- puis encore 72~C pendant 5 minutes.
11.5. VISUALISATION ET QUANTIFICATION
5 ~l (x2) du mélange post-réactionnel ont été ajoutés dans 2 nouveaux tubes en parallèle et mélangés avec 15 ,Ul de solution de dénaturation à température ambiante pendant 30 10 minutes. Après addition jusqu'à 180 ~l (x2) de solution d'hybridation contenant une sonde spécifique pour VHB ou une sonde spécifique pour l'ADN du contr81e interne (CI), vortex, puis transfert à la pipette dans le tube de billes revetues de streptavidine ou transfert dans le puits d'une 35 microplaque revetue de streptavidine, puis 2 heures CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736 d'incubation à 37~C sur une secoueuse, la solution a été
jetée et chaque puits ou alvéole a été lave 3 fois avec 200 ~1 de tampon de lavage. 200 ~1 des anticorps anti-ADNds conjugués avec de la phosphatase alcaline (PAL) ont été ajoutés, suivis d'une incubation pendant 30 minutes à
37~C sur une secoueuse. Après lavage 3 fois avec 200 ~1 de tampon de lavage, 100 ~1 de solution de substrat de chimioluminescence ont été ajoutés. Ensuite, la microplaque a été immédiatement transférée sur un luminomètre pour comptage de chimioluminescence et édition des résultats. Les nombres de particules de VHB par ml de chaque échantillon de plasma/sérum peuvent être enregistrés par un système automati~ue informatisé
utilisant la courbe étalon générée à partir du VirionStandard de VHB (quantification absolue).
Claims (12)
1. Procédé utilisant un étalon externe pour la quantification et la détection de n'importe quel micro-organisme à ADN ou à ARN, caractérisé en ce qu'il comprend:
(1) l'utilisation ou la détermination d'une concentration étalon du micro-organisme ou de la concentration de l'ADN
ou de l'ARN porté par ce micro-organisme, appelé
micro-organisme étalon, sous la forme d'une gamme de concentrations de micro-organisme étalon obtenue à partir de dilutions successives du micro-organisme préalablement étalonné selon ses concentrations d'ADN ou d'ARN, de façon à former l'étalon externe, ainsi que (2) la comparaison de la quantité du produit de la transcription réverse et/ou de l'amplification de l'ARN ou de l'ADN issu d'une concentration inconnue du micro-organisme avec des quantités d'amplificat issues de l'ARN
ou de l'ADN de concentrations connues du dit micro-organisme, le micro-organisme cible ou son génome à doser étant identique au micro-organisme étalon ou à son génome, traité en parallèle, ledit procédé comprenant également l'addition d'un contrôle interne pour le contrôle de l'efficacité
d'amplification ou de l'efficacité de la TR.
(1) l'utilisation ou la détermination d'une concentration étalon du micro-organisme ou de la concentration de l'ADN
ou de l'ARN porté par ce micro-organisme, appelé
micro-organisme étalon, sous la forme d'une gamme de concentrations de micro-organisme étalon obtenue à partir de dilutions successives du micro-organisme préalablement étalonné selon ses concentrations d'ADN ou d'ARN, de façon à former l'étalon externe, ainsi que (2) la comparaison de la quantité du produit de la transcription réverse et/ou de l'amplification de l'ARN ou de l'ADN issu d'une concentration inconnue du micro-organisme avec des quantités d'amplificat issues de l'ARN
ou de l'ADN de concentrations connues du dit micro-organisme, le micro-organisme cible ou son génome à doser étant identique au micro-organisme étalon ou à son génome, traité en parallèle, ledit procédé comprenant également l'addition d'un contrôle interne pour le contrôle de l'efficacité
d'amplification ou de l'efficacité de la TR.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (2) consiste essentiellement en une révélation comparative fondée sur la comparaison des concentrations de l'étalon avec les concentrations du micro-organisme cible telles que détectées de préférence au moyen de la méthode dite à l'ADN branché ou de toute autre méthode de révélation qui n'amplifie pas les ADN ou les ARN de l'étalon ou du micro-organisme cible.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes selon lesquelles:
1) on prélève et on purifie une quantité quelconque du micro-organisme à doser, à partir d'échantillons de prélèvement humains, animaux ou végétaux, ou à partir de cultures cellulaires, la quantité de micro-organisme étant suffisante pour que les concentrations en ADN ou ARN cible soient mesurables par des méthodes directes;
2) on extrait l'ADN ou l'ARN et on en mesure la quantité
recueillie;
3) on utilise par ailleurs le nombre de bases nucléotidiques du micro-organisme concerné;
4) on calcule à partir de ce nombre de bases nucléotidiques la masse moléculaire totale de l'ADN ou de l'ARN du dit micro-organisme, en tenant compte de la masse moléculaire moyenne d'un nucléotide, elle aussi connue;
5) on calcule ainsi, en utilisant le nombre d'Avogadro, la quantité d'ADN ou d'ARN portée par chaque micro-organisme;
6) on prépare et/ou utilise une gamme de concentrations de micro-organisme étalon obtenue à partir des dilutions successives du micro-organisme préalablement étalonné
selon ses concentrations d'ADN ou d'ARN, pour former un étalon externe, dont on connaît ainsi pour chaque dilution (a) la concentration d'ADN ou d'ARN et (b) la concentration en micro-organismes;
7) on extrait l'ADN ou l'ARN des micro-organismes étalon et cible, on y ajoute un contrôle interne, et on soumet les extraits en parallèle à une révélation au moyen de la méthode dite à l'ADN branché ou de toute autre méthode de révélation qui n'amplifie pas les ADN ou les ARN de l'étalon ou du micro-organisme cible et/ou à une rétrotranscription et/ou à au moins une amplification, et on enregistre les valeurs obtenues; et 8) on compare les concentrations d'ADN ou d'ARN des micro-organismes étalon et cible ou les produits d'amplification des micro-organismes cible avec ceux de l'étalon externe, de façon à en déduire les valeurs de concentration en ADN
ou ARN ou en micro-organisme total dans chaque échantillon de micro-organisme cible.
1) on prélève et on purifie une quantité quelconque du micro-organisme à doser, à partir d'échantillons de prélèvement humains, animaux ou végétaux, ou à partir de cultures cellulaires, la quantité de micro-organisme étant suffisante pour que les concentrations en ADN ou ARN cible soient mesurables par des méthodes directes;
2) on extrait l'ADN ou l'ARN et on en mesure la quantité
recueillie;
3) on utilise par ailleurs le nombre de bases nucléotidiques du micro-organisme concerné;
4) on calcule à partir de ce nombre de bases nucléotidiques la masse moléculaire totale de l'ADN ou de l'ARN du dit micro-organisme, en tenant compte de la masse moléculaire moyenne d'un nucléotide, elle aussi connue;
5) on calcule ainsi, en utilisant le nombre d'Avogadro, la quantité d'ADN ou d'ARN portée par chaque micro-organisme;
6) on prépare et/ou utilise une gamme de concentrations de micro-organisme étalon obtenue à partir des dilutions successives du micro-organisme préalablement étalonné
selon ses concentrations d'ADN ou d'ARN, pour former un étalon externe, dont on connaît ainsi pour chaque dilution (a) la concentration d'ADN ou d'ARN et (b) la concentration en micro-organismes;
7) on extrait l'ADN ou l'ARN des micro-organismes étalon et cible, on y ajoute un contrôle interne, et on soumet les extraits en parallèle à une révélation au moyen de la méthode dite à l'ADN branché ou de toute autre méthode de révélation qui n'amplifie pas les ADN ou les ARN de l'étalon ou du micro-organisme cible et/ou à une rétrotranscription et/ou à au moins une amplification, et on enregistre les valeurs obtenues; et 8) on compare les concentrations d'ADN ou d'ARN des micro-organismes étalon et cible ou les produits d'amplification des micro-organismes cible avec ceux de l'étalon externe, de façon à en déduire les valeurs de concentration en ADN
ou ARN ou en micro-organisme total dans chaque échantillon de micro-organisme cible.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les étapes 2) à 5) sont remplacées par la simple mesure directe du nombre de micro-organismes.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, qui comprend l'addition d'un contrôle interne sous la forme d'un ADN de plasmide hétérologue ou d'un ARN de transcrit hétérologue, et dont la séquence et les amorces n'ont pas de rapport avec les ADN ou ARN cible, pour le contrôle de l'efficacité d'amplification ou de l'efficacité de l'amplification liée à la TR.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on remplace la préparation de concentrations connues de micro-organisme par la préparation de concentrations connues:
~ du même micro-organisme inactivé, dont l'ADN ou l'ARN
demeure apte à une détection ou à une quantification au moyen d'une méthode de révélation telle que la méthode de révélation dite à l'ADN branché et/ou la rétrotranscription et/ou à l'amplification de façon identique à l'ADN ou l'ARN du virus natif, ~ d'une séquence nucléotidique complète, extraite du même micro-organisme, ou ~ d'une séquence nucléotidique complète, fabriquée par synthèse.
~ du même micro-organisme inactivé, dont l'ADN ou l'ARN
demeure apte à une détection ou à une quantification au moyen d'une méthode de révélation telle que la méthode de révélation dite à l'ADN branché et/ou la rétrotranscription et/ou à l'amplification de façon identique à l'ADN ou l'ARN du virus natif, ~ d'une séquence nucléotidique complète, extraite du même micro-organisme, ou ~ d'une séquence nucléotidique complète, fabriquée par synthèse.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on prépare et on stocke jusqu'à leur mise à la disposition de l'utilisateur des préparations de concentrations connues étalonnées du micro-organisme complet à ADN ou à ARN du type à
quantifier ou à détecter, ou des préparations de concentrations d' ADN ou d' ARN du génome du dit micro-organisme correspondant à des concentrations connues de ce micro-organisme.
quantifier ou à détecter, ou des préparations de concentrations d' ADN ou d' ARN du génome du dit micro-organisme correspondant à des concentrations connues de ce micro-organisme.
8. Kit ou ensemble de moyen pour la quantification et la détection de micro-organismes à ADN ou à ARN, comprenant essentiellement, dans des récipients appropriés et/ou sous la forme de dispositifs appropriés:
- une série de concentrations connues du micro-organisme complet à ADN ou à ARN type à quantifier ou à détecter préalablement étalonné selon ses concentrations d'ADN ou d'ARN, ou de concentrations d'ADN ou d'ARN correspondant à
des concentrations connues du dit micro-organisme, - des moyens d'extraction, de révélation et/ou de rétrotranscription et/ou d'amplification de l'ADN ou de l'ARN du micro-organisme cible et étalon, - des moyens pour l'analyse de l'ADN ou de l'ARN du micro-organisme cible et étalon ou des produits de révélation ou d'amplification, et - un contrôle interne.
- une série de concentrations connues du micro-organisme complet à ADN ou à ARN type à quantifier ou à détecter préalablement étalonné selon ses concentrations d'ADN ou d'ARN, ou de concentrations d'ADN ou d'ARN correspondant à
des concentrations connues du dit micro-organisme, - des moyens d'extraction, de révélation et/ou de rétrotranscription et/ou d'amplification de l'ADN ou de l'ARN du micro-organisme cible et étalon, - des moyens pour l'analyse de l'ADN ou de l'ARN du micro-organisme cible et étalon ou des produits de révélation ou d'amplification, et - un contrôle interne.
9. Kit ou ensamble de moyens selon la revendications 8, qui comprend des moyens pour la simple mesure directe du nombre de microorganismes.
10. Kit ou ensemble de moyens selon l'une des revendications 8 au 9, qui comprend un contrôle interne, de préférence sous la dorme d'un ADN de plasmide hétérologue ou d'un ARN de transcrit hétérologue, et dont la séquence et les amorces ne sont pas en rapport avec les ADN ou -ARN de la cible, pour le contrôle de l'efficacité
d'amplification ou do l'efficacité de l'amplification liée à la TR.
d'amplification ou do l'efficacité de l'amplification liée à la TR.
11. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la quantification des micro-organismes dans tous les milieux ou spécimens ou pour la détection de la quantité minimale mesurable ou d'une quantité supérieure de micro-organisme.
12. Utilisation d'un kit ou ensemble selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 pour la quantification des micro-organismes dans tous les milieux ou spécimens ou pour la détection de la quantité minimale mesurable ou d'une quantité supérieure de micro-organisme.
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