EP1735471A2 - Methode d"etude de la variabilite genique et fonctionnelle du vih et kit pour sa mise en oeuvre - Google Patents

Methode d"etude de la variabilite genique et fonctionnelle du vih et kit pour sa mise en oeuvre

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Publication number
EP1735471A2
EP1735471A2 EP05757257A EP05757257A EP1735471A2 EP 1735471 A2 EP1735471 A2 EP 1735471A2 EP 05757257 A EP05757257 A EP 05757257A EP 05757257 A EP05757257 A EP 05757257A EP 1735471 A2 EP1735471 A2 EP 1735471A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
primers
pair
seq
codon
genome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05757257A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Sophie Lebel-Binay
Elisabeth Dam
Luc Boblet
Dominique Costantini
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eurofins Viralliance Inc
Original Assignee
Eurofins Viralliance Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eurofins Viralliance Inc filed Critical Eurofins Viralliance Inc
Publication of EP1735471A2 publication Critical patent/EP1735471A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS

Definitions

  • the present invention relates to the field of analysis of the Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1). More particularly, the invention relates to a method and its means of implementation for the investigation of the genetic and functional variability of HIV.
  • the Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) is an enveloped retrovirus whose genome codes in particular for three distinct enzymes: Reverse Transcriptase which transcribes viral RNA into double stranded DNA, the integrase which allows integration of viral DNA into the genome of the target cell and the protease which is necessary for the maturation of virions.
  • the viral enzymes, Reverse Transcriptase (RT) and protease (PR) will be the main targets of anti-retroviral drugs.
  • HIV Human Immunodeficiency Virus
  • RT and PR mutant viruses resistant to antiviral treatments which appear when the suppression of viral replication is incomplete. Escape from drug pressure causes mutations in enzymes and viral proteins (RT and PR) which play an important role in replication and viral infectivity (Fitness). Resistant viruses can exhibit reduced infectivity compared to "wild" viruses.
  • Genotypic resistance tests In genotypic resistance tests, the viral RNA, derived from the plasma, is extracted and the regions coding for reverse transcriptase and protease are analyzed. Today, their analysis method is based on the position of the mutated amino acid preceded and followed by a letter indicating the “wild” amino acid and the mutant respectively. For example, for the resistance mutation to lamivudine M184V, Valine replaces Methionine at position 184 of the RT. Current tests mainly use automatic sequencing techniques for target genes. These tests detect all the mutations present in the sequenced region but cannot interpret them all. In fact, only known mutations are interpreted according to algorithms which are updated regularly by committees of international experts.
  • Phenotypic Resistance tests The principle of phenotypic resistance tests is based on the in vitro measurement of the growth of a patient's virus in the presence of drugs.
  • the viral RNA, derived from the plasma is extracted then the regions coding for the reverse transcriptase and / or the protease are amplified by PCR.
  • the amplicons are recombined in vitro in a defective vector to form a viral particle.
  • This virus particle is cultured in the presence of increasing concentrations of drugs.
  • the results are expressed as a “fold change” ratio of the IC 50 (or IC90) vis-à-vis a control virus, which corresponds to the concentration of the drug which inhibits 50% (or 90%) of replication.
  • the resistance level is defined according to sensitivity thresholds (eut off).
  • PhenoSense TM (Virology, USA)
  • Antivirogram TM (Virco, Belgium)
  • Phenoscript TM (VIRalliance, France). These tests give information on the susceptibility of the drugs towards their target but do not prejudge the impact of sentinel mutations on the evolution of the resistance of the virus.
  • genotype and phenotype could be combined to validate the technique, but in this case the methodology includes a step comprising the construction of a recombination vector by ligation (Parkin et al 2004, Antimicrob. Agents Chemother.
  • the replicative capacity is then evaluated over a given period, corresponding to a single cycle or several replication cycles depending on the methodology used.
  • the replicative capacity of a mutated variant is generally expressed compared to that of a wild variant.
  • the qualification of a highly infectious virus is today disconnected from its genetic and functional variability from the same patient sample.
  • PCT patent application 00233638 describes the possibility of producing a phenotype and a genotype from the same amplification product.
  • the phenotyping technique used does not describe a single cycle of viral replication. Firstly, it requires viral production in permissive cells, secondly allowing the reinfection of indicator cells to measure IC50 (PCT patent application WO9727480). These stages are not very representative of the patient's initial viral populations due to multiple cycles infection without the pressure of drug selection with the risk of evolution of the initial virus.
  • PCT patent application WO2004003513 proposes a method of genotyping, phenotyping and moreover of replicative capacity, centered on the construction by ligation of a recombination vector containing a reporter gene and the sequence studied. This method is also less representative of the reality of the behavior of the virus during the patient's infection. Cloning by ligation is interesting for the recombination yield, but can introduce biases in the selection of the patient's initial viral populations. The tests described in PCT patent application W00238792 make it possible to measure the infectivity (replicative capacity) and the phenotype from the same recombination vector.
  • the large fragment (> 2800 bp) coding for part of the gag gene and regions of the reading frame of the pol gene coding for the protease and reverse transcriptase can be used to determine the replicative capacity of the virus.
  • this large fragment in current practice, does not make it possible to obtain an amplification success rate and a replication rate sufficient to allow the measurement of infectivity. The following steps are therefore not feasible, which limits the use of this large fragment.
  • the methods of studying the HIV virus described in the prior art are limited by the difficulty in achieving both a good representativeness of the behavior of the virus (homologous recombination), a sufficient level of amplification and replication including for viruses very mutated.
  • the method of 1 invention now allows to inform and better interpret the virus data and the patient treatment data from the same sample. There is indeed today an important need for a strategy allowing, starting from the same biological sample of a patient reached by the
  • the purpose of the present invention is precisely to offer a new strategy making it possible, from the same biological sample of a patient infected with HIV, to obtain a measurement of the genotypic, phenotypic resistance and the replicative capacity of the virus. , so as to have a better understanding of the patient's situation and therefore to achieve better therapeutic orientation.
  • This object is achieved according to the invention thanks to a method of analysis of a sample capable of containing an HIV virus, comprising the following steps: a) the extraction of viral RNA from a biological sample capable of containing a virus
  • step (b) reverse transcription of the RNA obtained in step (a) and amplification with a first pair of primers making it possible to obtain an amplified reverse transcription product comprising all or part of at least two genes successive genomes of an HIV virus; said method further comprising: - step (c), and / or - the following steps (d), (e), (f) and (g), below: c) sequencing the amplified product reverse transcription obtained in step (b) so as to establish a genotype of the HIV virus present in said sample and identify the mutations possibly present in said amplified reverse transcription product; d) amplification of the reverse transcription product obtained in step (b) with a second pair of primers, complementary to the first pair used in step b, and capable of generating an amplification product capable of to be inserted by homologous recombination into a defective retroviral vector in the region corresponding to the amplified reverse transcription product prepared in step (b); e) homologous recombination of said amplification product prepared in step (d
  • the method of the invention is remarkable in that it offers the possibility of measuring the impact of anti-retroviral treatments, judged both on: gene variation recording known mutations, associated mutations and unknown mutations; - the functional variation recording the infectivity or replicative capacity of the virus in the presence or absence of anti-retrovirals; It makes it possible to study both on the same biological sample from a patient the impact of an antiviral agent on the genetic and functional variability on its initial target, for example the viral enzyme for which the anti-retroviral was designed, but also the tool will provide information in parallel on the same data, gene and functional variability, on one or more targets of interest.
  • the method of the invention also makes it possible to be very representative of the behavior of the patient's virus, it is also representative for evaluating the genetic and functional variability of one or more targets of HIV-1 virus belonging to subtypes B and not -B.
  • Each parameter, genotype, phenotype, replicative capacity, taken individually, provides information on resistance, and according to the invention, the virus tested is the closest to its natural behavior.
  • the invention makes it possible, from the same biological sample, to measure the 3 key parameters of resistance: genotype, phenotype and replication capacity. It ensures efficiency in the isolation of viral populations, allows the normalization of reconstituted viruses and a quantitative analysis of the results. The 3 components allow better clinical interpretation and mutual understanding of these items to make them a combined tool of clinical utility.
  • the method of the invention relates more particularly to a method of analyzing samples capable of containing HIV viruses belonging to subtypes B and not B.
  • the RNA is that of an HIV virus belonging to subtypes B and not B.
  • the method of the invention is more particularly interested in samples derived from a sample from a patient. It can be a blood or serum sample, but it can also come from a biological fluid or a biopsy or any other tissue preparation.
  • the biological sample can also come from a viral culture.
  • a biological sample corresponds to all types of samples containing one or more variants of HIV, in particular HIV-1.
  • HIV-1 virus is meant, as indicated above, any viral strain belonging to subtype B and not B.
  • step (b) the method of the invention is more particularly interested in a first pair of primers allowing the production of an amplified reverse transcription product, also referred to below as amplicon, comprising all or part of at least two genes useful in the study of resistance to anti-retrovirals.
  • step (b) implements a pair of primers which makes it possible to prepare an amplicon characterized by: - The presence at each of its ends of areas preserved to allow the amplification of the viral populations, the potential presence of mutations of interest.
  • a preferred embodiment of the invention comprises, in step (b), the implementation of a first pair of primers allowing the obtaining of an amplicon, comprising all or part of the gag gene and of pol gene encoding the protease and reverse transcriptase involved in the replicative capacity of the virus, and capable of conferring on the virus a therapeutic resistance.
  • this involves obtaining an amplicon having, in addition to the above characteristics: - part of the nucleic acid sequence coding for gag and including the cleavage sites, - all of the sequence coding for the protease, - the sequence coding for the reverse transcriptase going at least up to codon 340.
  • the amplicon as defined above has a size less than 2800bp, preferably between 2200 and 2700bp and most preferably between 2300 and 2600 bp.
  • the amplification of step (b) of the method of the invention implements a pair of primers framing a nucleic sequence, complementary in 5 ′ to the phylogenetically conserved region of the gag gene including the sites of cleavage, containing the entire nucleic acid sequence coding for the protease, complementary to 3 'of the phylogenetically conserved region of the gene coding for reverse transcriptase.
  • the pair of primers used in step (b) frames a nucleic acid sequence: complementary in 5 ′ to the phylogenetically conserved region of the gag gene comprised between the codon 102 of the protein pl7 (position 1093 on the genome) and codon 76 of the p24 protein (position
  • the pair of primers used in step (b) frames a nucleic acid sequence: complementary in 5 'to the phylogenetically conserved region of the gag gene comprised between codon 126 (position 1165 on the genome) of the protein pl7 and codon 21 of the protein p24
  • the amplification of step (b) of the method of the invention is carried out with a pair of primers having a size between 10 and 50 nucleotides, preferably between 20 and 30 nucleotides.
  • the amplification of step (b) is carried out with a pair of primers chosen from the group comprising: - as sense primer, that represented by one of the sequences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 and SEQ ID NO. 5 (Table 1) - as antisense primer, that represented by one of the sequences SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 and
  • SEQ ID NO. 6 (Table 1) fragments or analogs of these sequences.
  • analogues is meant either sequences carrying one or more mutations without affecting its hybridization capacities under stringency conditions generally encountered during PCR, or sequences which are situated from 1 to 10, 1 to 5 or 1 to 3 nucleotides upstream or downstream of said primer sequences.
  • the invention relates to the implementation in step (b) of a pair of primer chosen from the group comprising: - the pair of primers Ri of sequences SEQ ID NO.l and SEQ ID NO. 2 of table 1 - the pair of primers R2 of sequences SEQ ID NO.3 and SEQ ID NO.4 of table 1 - the pair of primers R3 of sequences SEQ ID NO.5 and SEQ ID NO.6 of table 1 .
  • the sequencing step (c) of the method of the invention makes it possible to identify the known, unknown and associated mutations from the data available in the literature.
  • step (d) the amplification of the amplified reverse transcription product obtained in step (b) uses a pair of primers which makes it possible to prepare an amplicon characterized by: - the presence at each of its ends of areas conserved to allow recombination with the retroviral vector, the potential presence of mutations of interest.
  • step (d) the amplification of the amplified reverse transcription product obtained in step (b) comprising all or part of the gag gene and of the pol gene coding for the protease and the reverse transcriptase is advantageously carried out with a second pair of primers, complementary to the first pair used in step (b), making it possible to obtain an amplicon further comprising: part of the nucleic acid sequence coding for gag and including the cleavage sites, - the entire sequence coding for the protease, - the sequence coding for the reverse transcriptase going at least up to codon 340.
  • the amplicon as defined above has a size less than 2800bp, preferably between 2200 and 2700 bp and most preferably between 2300 and 2600 bp.
  • step (d) of the method of the invention implements a pair of primers framing a sequence of nucleic acids, complementary in 5 ′ to the phylogenetically conserved region of the gag gene including cleavage sites, containing the entire nucleic acid sequence encoding the protease, 3 'complementary to the phylogenetically conserved region of the gene encoding reverse transcriptase.
  • the pair of primers implemented in step (d) frames a nucleic acid sequence: complementary in 5 ′ to the phylogenetically conserved region of the gag gene comprised between the codon 102 of the protein pl7 (position 1093 on the genome) and codon 76 of the p24 protein (position
  • the pair of primers used in step (d) frames a nucleic acid sequence: complementary in 5 ′ to the phylogenetically conserved region of the gag gene comprised between codon 126 (position 1165 on the genome) of the protein pl7 and codon 21 of the protein p24
  • step (d) of the method of the invention is carried out with a pair of primers having a size of between 10 and 50 nucleotides, preferably between 20 and 30 nucleotides.
  • the amplification of step (d) is carried out with a pair of primers chosen from the group comprising: - as sense primer, that represented by one of the sequences SEQ ID NO. 7 and SEQ ID NO. 9 (Table 4) - as antisense primer, that represented by one of the sequences SEQ ID NO. 8 and SEQ ID NO. 10
  • the invention relates to the implementation in step (d) of a pair of primers chosen from the group comprising: - the pair of primers Ni of sequences SEQ ID NO.7 and SEQ ID NO. 8 of table 4 - the pair of primers N2 of sequences SEQ ID NO.9 and SEQ ID NO.10 of table 4.
  • step (f) of the method of the invention consists more particularly in infecting HIV target cells with the recombinant viruses produced in step (e) in the presence or absence of one or more drugs.
  • the infection of HIV target cells in the presence or absence of one or more drugs, containing an indicator gene, independent of the retroviral vector, the expression of which is linked to the infection viral.
  • the measurement of the replicative capacity in step (g) of the method of the invention consists more particularly in measuring the expression of an indicator gene in response to infection by the recombinant virus produced in step (e ) compared to a reference virus.
  • the method of the invention comprises, in the case where steps (c) and (f) and (g) have been carried out: h) the processing of data relating to: - the possible presence of mutations determined in step (c), and - in the functional analysis of the viral proteins in step (f), and - in the replicative capacity of step (g), to obtain the characteristics of the virus and / or of treatment.
  • steps (c) and (f) and (g) have been carried out: h) the processing of data relating to: - the possible presence of mutations determined in step (c), and - in the functional analysis of the viral proteins in step (f), and - in the replicative capacity of step (g), to obtain the characteristics of the virus and / or of treatment.
  • the invention also relates to primers and combinations thereof for the amplification of HIV nucleic acid sequences as defined above.
  • the method of the invention makes it possible to have a new test capable, from the same biological sample of an HIV patient, of obtaining a measurement of the genotypic, phenotypic resistance and the replicative capacity of the virus, that is ie the gene variation recording the known mutations, the associated mutations and the unknown mutations and the functional variation recording the infectivity or replicative capacity of the virus in the presence or absence of anti-retrovirals (FIG. 2).
  • the invention therefore also relates to a kit for implementing a method as described, comprising one or more primers defined above.
  • Such a kit also includes a method for analyzing the 3 data obtained using the method of the invention: genotype, phenotype and replicative capacity, etc.
  • FIG. 1 represents the main stages of the analyzes of the genotype, of the phenotype and of the replicative capacity.
  • FIG. 2 represents the compatibility of the analyzes of the genotype, of the phenotype and of the replicative capacity according to the method of the invention.
  • FIG. 3 shows a better efficiency of amplification of the viral populations: The RNA originating from 4 patients (A, B, C, D) were retrotrancrits and amplified under the conditions described in the PCT patent application WO 0238792 (test 1) or under the conditions defined by the present invention in its example 1 (test 2).
  • FIG. 1 represents the main stages of the analyzes of the genotype, of the phenotype and of the replicative capacity.
  • FIG. 2 represents the compatibility of the analyzes of the genotype, of the phenotype and of the replicative capacity according to the method of the invention.
  • FIG. 3 shows a better efficiency of amplification of the viral populations: The RNA originating from 4 patients (A, B, C, D) were
  • FIG. 4 represents the DO / P24 curve obtained in a replicative capacity test for a patient virus (virus 1) and a reference virus.
  • FIG. 5 represents the position of the primer pairs of the invention on the HIV genome.
  • the figure shows the organization of the gag and pol genes of HIV-1: - Gag gene:.
  • Matrix pl7.
  • Capside (core) p24.
  • RNAse H pl5: RNAse H activity.
  • Integrase (Int) p31: Proviral DNA integration Figure 6 shows the regions amplified by the various commercial genotyping and phenotyping tests described in Example 3.
  • Example l_j Gene and functional analysis of the protease and reverse transcriptase.
  • the method according to the present invention is characterized in the first place by the generation of a specific nucleic acid compatible with both the genotyping techniques and the phenotyping techniques. To generate this first specific amplicon, we proceed as follows:
  • the viral RNA contained in a biological sample is extracted.
  • the biological sample can be derived from a patient sample. It can be a blood or serum sample, but it can also come from a biological fluid or a biopsy or any other tissue preparation.
  • the biological sample can also come from a viral culture.
  • a biological sample corresponds to all types of samples containing one or more HIV-1 variants.
  • HIV-1 virus is meant any viral strain belonging to subtypes B and not B.
  • FIG. 3 shows that, on 4 patients, the patent method gives a better amplification of the viral populations than under the conditions of the previous patent.
  • the patent method allows the amplification of all the samples while the method described in the previous patent only allows the effective amplification of 16 samples out of the 26 tested (4 are negative and 6 are too weakly amplified).
  • Tables 2 and 3 below show two examples of plasma samples from patients 1 and 2 respectively, for which the amplicons generated by the method of the invention above have enabled the genotype to be produced according to the Trugene and Viroseq techniques and of the Phenotype using the Phenoscript technique.
  • the method of the invention comprises the following steps: 1) The viral RNA contained in a biological sample is extracted.
  • RNA obtained in (1) is retrotranscribed and amplified with a pair of specific primers making it possible to regularly amplify a specific amplicon, comprising at least 2 genes of interest in the study of resistance to retrovirals, as described in Example 1.
  • the primers of the patent method described in Table 4 allow better recombination in patients with numerous mutations with a new retroviral vector deleted from part of the gag gene, from the region of the pol reading frame coding for the protease and part of the HIV-1 reverse transcriptase as the recombination described under the conditions of the prior patent.
  • Tables 5 and 6 the mutations identified in the protease and reverse transcriptase gene are listed for a series of 6 patients.
  • Table 7 gives the mean values of replicative capacity obtained for these 6 patients in two independent tests with the method of the present invention.
  • RTI reverse transcriptase inhibitors
  • the primers of the patent method described in Table 4 allow, on another series of 4 patients, in addition the production of a quantity of recombinant viruses greater than the recombination described under the conditions of the prior patent as well as the normalization of infection of indicator cells using, for example, p24 antigen assay.
  • Table 8 describes that the amount of p24 produced by the recombinant viruses of 4 patients according to the patent method (vector GRF) is greater than that of the previous patent (vector GPR).
  • the primers in Table 4 also make it possible to measure the replicative capacity on a range of recombinant viruses in comparison to a reference according to quantitative methods integrating the optical density values resulting from an enzymatic reaction linked to a revealing gene independent of the vector and present in the infected cells ( Figure
  • Example 3 Compatibility of the amplicon of examples 1 and 2 with the various commercial tests.
  • the Trugene HIV-1 Genotyping Kit is used to determine the genotype of virus types B and not B.
  • the RNA is extracted from the plasmas of patients according to conventional techniques, the viral RNA is transcribed and amplified by PCR with specific primers of the pol gene allowing the amplification of a nucleic acid sequence of 1300 bp comprising for the protease codons 1 to 99 and comprising for the reverse transcriptase the codons 1 to 247.
  • the RT-PCR product thus obtained is used in each of the 16 sequencing reactions using the principle of the CLIP TM reaction, a sequencing technique using labeled primers (dye primers).
  • each sequence reaction is initiated by a specific labeled primer (CLIP TM) and then interrupted by the corresponding labeled nucleotide. All the synthesized fragments are then separated on an electrophoresis gel and analyzed by an automatic sequencer, specifically indicating the fragments ending in each of the four labeled nucleotides. The sequences, once reconstituted, are compared to the sequence of a reference virus, using alignment software.
  • CLIP TM specific labeled primer
  • TM specific labeled primer
  • RNA is extracted from the plasmas of patients according to a conventional extraction technique based on the affinity of the RNA vis-à-vis Sicily columns, the viral RNA is retrotranscribed and amplified by PCR with primers specific for the pol gene allowing the amplification of a 1800 bp nucleic acid sequence comprising for the protease codons 1 to 99 and comprising for the reverse transcriptase codons 1 to 335.
  • the DNA thus obtained is then sequenced with 7 different primers using Big Dye TM Terminator technology, a sequencing technique using labeled nucleotides (dye terminators). The sequence reaction is initiated by each specific unlabeled primer and then interrupted by each of the labeled nucleotides.
  • GenoSure TM (Virco) (PCT patent application WO 01/81624).
  • the RNA is extracted from the plasmas of patients according to conventional extraction techniques, the viral RNA is retrotranscribed and amplified by PCR with primers specific for the pol gene allowing the amplification of a nucleic acid sequence of 1800 bp comprising for the protease the codons 1 to 99 and comprising for the reverse transcriptase the codons 1 to 415.
  • the DNA thus obtained is then sequenced according to the Big Dye TM Terminator technology, previously described.
  • Phenoscript TM (Viralliance); Antivirogram TM (Virco); PhenoSense TM (ViroLogic).
  • PhenoSense TM (ViroLogic) (Parkin NT et. Al., Antimicrob.Agents Chemother. 2004. 48: 437; Petropoulos et. Al., Antimicrob.Agents Chemother. 2000. 44: 920).
  • the PhenoSense test is carried out using viral RNA extracted from the plasma of an HIV patient.
  • the regions of the pol gene coding for the protease and the reverse transcriptase are amplified by RT-PCR to obtain a nucleic acid sequence of 1500 bp comprising the cleavage sites of the gag protein (p7-pl-p6) the entire region coding for the protease and the reverse transcriptase region from codon 1 to codon 313.
  • This sequence is then ligated into an HIV retroviral vector containing a reporter gene (Luciferase) and deleted in the HIV envelope protein.
  • the retroviral vector is then co-transfected into 293T cells with a vector encoding the envelope protein MLV (Murine Leukemia Virus).
  • the viruses produced are used to infect new cells in the presence or absence of antiretrovirals. Luciferase activity in infected cells in the presence of drugs is compared to luciferase activity in the absence of drugs, which allows the calculation of concentrations inhibiting 50% of viral production (IC50).
  • Table 10 summarizes the characteristics of the nucleic acid sequences amplified in the main tests described above. Table 10
  • FIG. 6 shows the regions amplified by the various commercial genotyping and phenotyping tests described in example 3.
  • the amplicon according to the present invention, designated “new amplicon” in FIG. 6 is compatible with all of these tests.
  • Example 4 Determination of a score as a tool to aid therapeutic decision.
  • the method of the invention makes it possible to take into account in a score system the measures of gene and functional variability of an HIV virus belonging to subtypes B and not B.
  • the measurement of gene variability is carried out from the specific nucleic acid sequence amplified according to the method of the invention, then analyzed according to the usual sequencing techniques (Trugene, ViroSeq).
  • the mutations in the protease and reverse transcriptase genes identified by these tests are interpreted according to algorithms regularly updated by expert committees.
  • a first score of 0 to 2 is assigned to each of the 3 resistance levels determined by the interpretation.
  • Table 11 summarizes the interpretations given by the Trugene and ViroSeq tests according to the mutations identified and the antiretrovirals (ARVs) used and assigns a genotypic score corresponding to the importance of the resistance.
  • Table 11 summarizes the interpretations given by the Trugene and ViroSeq tests according to the mutations identified and the antiretrovirals (ARVs) used and assigns a genotyp
  • the measurement of the functional variability of an HIV virus consists in analyzing the replicative capacity of the virus in the presence (phenotype) or in the absence of antiretrovirals (Fitness).
  • the principle of phenotypic resistance tests is based on the in vitro measurement of the growth of a patient's virus in the presence of drugs, compared to a reference virus (resistance index).
  • the resistance level is defined according to sensitivity thresholds (eut off).
  • a second score of 0 to 2 is assigned to each of the 3 resistance levels determined by the interpretation.
  • Table 12 summarizes the interpretations given by the main Phenotypic tests PhenoSense and Phenoscript according to their sensitivity thresholds and assigns a phenotypic score corresponding to the importance of the resistance. Table 12 below reports the assignment of a phenotypic score according to the interpretation of the phenotypic thresholds.
  • the replicative capacity of a virus, or fitness, in the absence of antiretroviral is measured in comparison with a reference virus. It provides information on the ability of the virus to replicate and is expressed as a% of the reference virus. By way of examples, there may be mentioned a virus having a fitness of 100% which will be considered to have a high replicative activity and a virus having a fitness of 10% which will be considered to have a low replicative activity.
  • the combination of the two scores, genotype, phenotype and the percentage of replicative capacity from the same biological sample should allow a better interpretation of clinical data and provide a tool to aid therapeutic decision.
  • genotypic + phenotypic score will be between 0 and 4 for each ARV and will be accompanied by a% replicative capacity.
  • the molecule must be stopped because the virus is resistant and retains a strong capacity to replicate in the presence of this ARV.
  • the continuation of the molecule may be preferred to the cessation of treatment by the clinician by absence of therapeutic alternative.

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Abstract

La présente invention a pour objet une méthode d'analyse d'un échantillon susceptible de contenir un virus VIH, comprenant les étapes suivantes : (a) l'extraction de l'ARN viral ; (b) la transcription inverse de l'ARN obtenu à l'étape (a) et l'amplification avec une première paire d'amorces permettant l'obtention d'un produit amplifié de transcription inverse comprenant tout ou partie d'au moins deux gènes successifs du génome d'un virus VIH ; (c) le séquençage du produit amplifié de transcription inverse ; (d) l'amplification du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) avec une seconde paire d'amorces ; (e) la recombinaison homologue dudit produit d'amplification préparé à l’étape (d) avec un vecteur; (f) l’analyse fonctionnelle des protéines virales codées par tout ou partie desdits au moins deux gènes ; (g) la mesure de la capacité réplicative des virus recombinants obtenus à l'étape (e).

Description

MÉTHODE D'ETUDE DE LA VARIABILITE GENIQUE ET FONCTIONNELLE DU VIH ET KIT POUR SA MISE EN ŒUVRE.
La présente invention concerne le domaine de l'analyse du virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1). Plus particulièrement l'invention se rapporte à une méthode et ses moyens de mise en œuvre pour l'investigation de la variabilité génique et fonctionnelle du VIH. Le Virus de l' Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1) est un rétrovirus enveloppé dont le génome code notamment pour trois enzymes distinctes : la Transcriptase Inverse qui transcrit l'ARN viral en ADN double brin, l'integrase qui permet l'intégration de l'ADN viral dans le génome de la cellule cible et la protéase qui est nécessaire pour la maturation des virions. Les enzymes virales, Transcriptase Inverse (RT) et protéase (PR) vont être les principales cibles des anti-rétroviraux. Actuellement une quinzaine molécules anti- rétrovirales inhibant la Transcriptase Inverse et la protéase sont utilisées en pratique clinique. L'utilisation combinée de ces inhibiteurs conduit à de fortes diminutions de la réplication virale, mais ces associations de drogues sont souvent compliquées par d'importants effets secondaires, une faible compliance et le développement de souches virales résistantes aux anti-rétrovirau . Une des causes majeures d'échec des traitements du Virus de l' Immunodéficience Humaine (VIH) est l'émergence de virus mutants résistants aux traitements antiviraux qui apparaissent lbrsque la suppression de la réplication virale est incomplète. L'échappement à la pression exercée par les drogues entraîne l'apparition de mutations dans les enzymes et protéines virales (RT et PR) qui jouent un rôle important dans la réplication et l'infectivité virale (Fitness). Les virus résistants peuvent présenter une infectivité réduite en comparaison aux virus « sauvages ». Cliniquement, il apparaît important de disposer dans le même temps d'informations sur la variabilité génique et fonctionnelle sur les 2 principales cibles puisque ces traitements sont associés en pratique clinique. Aujourd'hui, un tel outil n'est pas disponible. Les tests présents ne sont pas suffisants, à partir du même échantillon viral de patient, pour explorer dans le même temps les mutations connues et inconnues et l'infectivité en présence ou en absence de drogues ceci sur au moins 2 cibles géniques d'intérêt. Les différents tests diagnostics actuels permettent de juger soit de la variabilité génique (génotype) soit de la variabilité fonctionnelle (phénotype et capacité replicative) des virus de patients infectés par le VIH aux antiviraux (Figure
1) - Tests génotypiques de Résistance - Tests Phénotypiques de Résistance - Tests de réplication virale - Tests associés
Les tests génotypiques de Résistance. Dans les tests de résistance génotypiques, l'ARN viral, dérivé du plasma est extrait puis les régions codant pour la transcriptase inverse et la protéase sont analysées. Aujourd'hui, leur méthode d'analyse repose sur la position de l'acide aminé muté précédé et suivi par une lettre indiquant l'acide aminé « sauvage » et le mutant respectivement. Par exemple, pour la mutation de résistance à la lamivudine M184V, la Valine remplace la Méthionine en position 184 de la RT. Les tests actuels utilisent majoritairement des techniques de séquençage automatique des gènes cibles. Ces tests détectent toutes les mutations présentes dans la région séquencée mais ne peuvent pas toutes les interpréter. En effet, seules les mutations connues sont interprétées en fonction d'algorithmes qui sont remis à jour régulièrement par des comités d'experts internationaux. Ces algorithmes sont devenus de plus en plus complexes avec les associations thérapeutiques en croissance et plus de 15 drogues disponibles sur le marché. D'autres tests, comme le « Line Probe Assay » (LiPA) ou les « Gène Chips » proposés par la Société Affymetrix, sont basés sur des techniques d'hybridation et utilisent des sondes spécifiques limitées à l'identification de certaines mutations. L'interprétation des résultats des tests génotypiques est complexe en raison de la difficulté à estimer les effets cumulatifs de mutations multiples dont certaines peuvent avoir des effets additifs tandis que d'autres vont restaurer la sensibilité.
Les tests Phénotypiques de Résistance. Le principe des tests de résistance phénotypique repose sur la mesure in vitro de la croissance d'un virus de patient en présence de drogues. Dans les tests phénotypiques, l'ARN viral, dérivé du plasma est extrait puis les régions codant pour la transcriptase inverse et/ou la protéase sont amplifiées par PCR. Les amplicons sont recombinés in vitro dans un vecteur défectif pour former une particule virale. Cette particule virale est mise en culture en présence de concentrations croissantes de drogues. Les résultats sont exprimés en ratio « fold change » de l'IC 50 (ou IC90) vis-à-vis d'un virus contrôle, qui correspond à la concentration de la drogue qui inhibe 50% (ou 90%) de la réplication virale en comparaison au virus sauvage de référence. Le niveau de résistance est défini en fonction de seuils de sensibilité (eut off). Trois principaux tests de résistance Phénotypique sont actuellement disponibles sur le marché : PhenoSense™ (Virologie, USA), Antivirogram™ (Virco, Belgique) et Phenoscript™ (VIRalliance, France). Ces tests donnent des renseignements sur la susceptibilité des drogues vis-à-vis de leur cible mais ne préjugent pas de l'impact de mutations sentinelles sur l'évolution de la résistance du virus. Ces deux informations, génotype et phénotype, ont pu être regroupées pour valider la technique mais dans ce cas la méthodologie inclut une étape comprenant la construction d'un vecteur de recombinaison par ligation (Parkin et al 2004, Antimicrob. Agents Chemother. 48 :437) ou nécessite de multiples cycles d'infections pour le phénotypage (demande de brevet PCT 00233638). Ces deux approches techniques peuvent introduire un biais dans la représentativité du virus du patient. D'autre part, les tests de phénotypage actuels ne sont pas conçus pour être compatibles avec les tests de génotypage en usage sauf pour une utilisation interne. Les tests de réplication virale. Les mutations de résistance induites par les inhibiteurs de protéase et de transcriptase inverse sont connues pour modifier la capacité replicative des virus du VIH. Les tests de détermination de la capacité replicative in vitro sont basés sur l'utilisation d'un plasmide recombinant, transfecté puis amplifié en culture cellulaire. Après normalisation de la quantité de virus, le surnageant viral est utilisé pour infecter de nouvelles cellules. La capacité replicative est alors évaluée sur une période donnée, correspondant à un unique cycle ou plusieurs cycles de réplication selon la méthodologie utilisée. La capacité replicative d'un variant muté s'exprime d'une façon générale comparativement à celle d'un variant sauvage. La qualification d'un virus de forte infectivité est aujourd'hui déconnectée de sa variabilité génique et fonctionnelle à partir du même prélèvement de patient.
Les tests associés. La demande de brevet PCT 00233638 décrit la possibilité de réaliser un phénotype et un génotype à partir d'un même produit d'amplification. Cependant, la technique de phénotypage utilisée ne décrit pas un cycle unique de réplication virale. Dans un premier temps, elle nécessite une production virale dans des cellules permissives permettant dans un deuxième temps la réinfection de cellules indicatrices pour mesurer les IC50 (demande de brevet PCT W09727480). Ces étapes sont peu représentatives des populations virales initiales du patient en raison de cycles multiples d'infection sans la pression de sélection des drogues avec le risque d'évolution du virus initial. La demande de brevet PCT W02004003513 propose une méthode de génotypage, phénotypage et par ailleurs de capacité replicative, centrées sur la construction par ligation d'un vecteur de recombinaison contenant un gène rapporteur et la séquence étudiée. Cette méthode est aussi moins représentative de la réalité du comportement du virus au cours de l'infection du patient. Le clonage par ligation est intéressant pour le rendement de recombinaison, mais peut introduire des biais dans la sélection des populations virales initiales du patient. Les tests décrits dans la demande de brevet PCT W00238792, permettent de mesurer l'infectivité (capacité replicative) et le phénotype à partir du même vecteur de recombinaison. En particulier, le grand fragment (>2800 pb) codant pour une partie du gène gag et des régions du cadre de lecture du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse, peut être utilisé pour déterminer la capacité replicative du virus. Or, ce grand fragment, en pratique courante, ne permet pas d'obtenir un taux de succès d'amplification et un taux de réplication suffisant pour permettre la mesure de l'infectivité. Les étapes suivantes ne sont donc pas réalisables, ce qui limite l'usage de ce grand fragment.
Les méthodes d'étude du virus VIH décrites dans l'art antérieur sont limitées par la difficulté à réaliser à la fois une bonne représentativité du comportement du virus (recombinaison homologue), un niveau d'amplification et de réplication suffisants y compris pour des virus très mutés . La méthode de 1 ' invention permet maintenant de renseigner et mieux interpréter les données du virus et les données du traitement du malade à partir du même prélèvement. Il existe en effet aujourd'hui un besoin important pour une stratégie permettant, à partir d'un même échantillon biologique d'un patient atteint par le
VIH, d'obtenir une mesure de la résistance génotypique, phénotypique et de la capacité replicative du virus. La présente invention a précisément pour but d'offrir une nouvelle stratégie permettant, à partir d'un même échantillon biologique d'un patient infecté par le VIH, d'obtenir une mesure de la résistance génotypique, phénotypique et de la capacité replicative du virus, de façon à disposer d'une meilleure compréhension de la situation du patient et donc de réaliser une meilleure orientation thérapeutique . Ce but est atteint selon l'invention grâce à une méthode d'analyse d'un échantillon susceptible de contenir un virus VIH, comprenant les étapes suivantes : a) l'extraction de l'ARN viral d'un échantillon biologique susceptible de contenir un virus
VIH ; b) la transcription inverse de l'ARN obtenu à l'étape (a) et l'amplification avec une première paire d'amorces permettant l'obtention d'un produit amplifié de transcription inverse comprenant tout ou partie d'au moins deux gènes successifs du génome d'un virus VIH ; ladite méthode comprenant en outre : - l'étape (c), et/ou - la suite d'étapes (d),(e), (f) et (g), ci-après : c) le séquençage du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) de façon à établir un génotype du virus VIH présent dans ledit échantillon et identifier les mutations éventuellement présentes dans ledit produit amplifié de transcription inverse ; d) l'amplification du produit de transcription inverse obtenu à l'étape (b) avec une seconde paire d'amorces, complémentaire de la première paire mise en œuvre à l'étape b, et capable de générer un produit d'amplification susceptible d'être inséré par recombinaison homologue dans un vecteur rétroviral défectif dans la région correspondant au produit amplifié de transcription inverse préparé à l'étape (b) ; e) la recombinaison homologue dudit produit d'amplification préparé à l'étape (d) avec ledit vecteur défectif ; f) l'analyse fonctionnelle des protéines virales codées par tout ou partie desdits au moins deux gènes successifs du produit de transcription inverse recombiné dans un vecteur à l'étape (d) ; g) la mesure de la capacité replicative des virus recombinants obtenus à l'étape (e) en présence ou absence d'une ou plusieurs drogues.
La méthode de l'invention est remarquable en ce qu'elle offre la possibilité de mesurer l'impact des traitements anti-rétroviraux, jugé à la fois sur : la variation génique enregistrant les mutations connues, les mutations associées et les mutations inconnues ; - la variation fonctionnelle enregistrant l'infectivité ou capacité replicative du virus en présence ou en absence d' anti-rétroviraux ; Elle permet d'étudier à la fois sur le même prélèvement biologique issu d'un malade l'impact d'un agent antiviral sur la variabilité génique et fonctionnelle sur sa cible initiale, par exemple l'enzyme virale pour laquelle l'anti-rétroviral a été conçu, mais également l'outil va renseigner en parallèle sur les mêmes données, variabilité génique et fonctionnelle, sur une ou plusieurs cibles d'intérêt. La méthode de l'invention permet en outre d'être très représentative du comportement du virus du patient, elle est aussi représentative pour évaluer la variabilité génique et fonctionnelle d'une ou plusieurs cibles de virus VIH-1 appartenant aux sous types B et non-B. Chaque paramètre, génotype, phénotype, capacité replicative, pris individuellement apporte des informations sur la résistance, et selon l'invention le virus testé est le plus proche de son comportement naturel. L'invention permet à partir du même échantillon biologique de mesurer les 3 paramètres clés de la résistance : génotype, phénotype et capacité réplication . Elle assure une efficacité dans l'isolement des populations virales, permet la normalisation des virus reconstitués et une analyse quantitative des résultats. Les 3 volets permettent une meilleure interprétation clinique et un éclairage réciproque de ces items pour en faire un outil combiné d'utilité clinique. La méthode de l'invention concerne plus particulièrement une méthode d'analyse d'échantillons susceptible de contenir des virus VIH appartenant aux sous-types B et non B. Ainsi, l'ARN est celui d'un virus VIH appartenant aux sous-types B et non B.
Pour la réalisation de l'étape (a), la méthode de l'invention s'intéresse plus particulièrement à des échantillons dérivés d'un prélèvement d'un patient. Il peut s'agir d'un échantillon de sang ou de sérum, mais peut aussi provenir d'un fluide biologique ou d'une biopsie ou de tout autre préparation tissulaire. L'échantillon biologique peut également provenir d'une culture virale. De façon générale, un échantillon biologique correspond à tous types d'échantillons contenant un ou plusieurs variants de VIH, notamment de VIH-1. Par virus VIH-1, on entend, comme indiqué ci-dessus, toute souche virale appartenant aux sous type B et non B.
Pour la réalisation de l'étape (b), la méthode de l'invention s'intéresse plus particulièrement à une première paire d'amorces permettant l'obtention d'un produit amplifié de transcription inverse, aussi désigné ci-après amplicon, comprenant tout ou partie d'au moins deux gènes utiles dans l'étude de la résistance aux anti-rétroviraux. Ainsi, l'étape (b) met en œuvre une paire d'amorces qui permet de préparer un amplicon caractérisé par : - La présence à chacune de ses extrémités de zones conservées pour permettre l'amplification des populations virales, la présence potentielle de mutations d'intérêt.
Une forme de réalisation préférée de l'invention, comprend, à l'étape (b), la mise en œuvre d'une première paire d'amorces permettant l'obtention d'un amplicon, comprenant tout ou partie du gène gag et du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse impliqués dans la capacité replicative du virus, et susceptible de conférer, au virus, une résistance thérapeutique. Il s'agit alors à l'étape (b) d'obtenir un amplicon possédant outre les caractéristiques ci- dessus : - une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage, - la totalité de la séquence codant pour la protéase, - la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340. L' amplicon tel que défini ci-dessus présente une taille inférieure à 2800pb, de préférence comprise entre 2200 et 2700 pb et tout préférentiellement entre 2300 et 2600 pb. Ainsi, avantageusement, l'amplification de l'étape (b) de la méthode de l'invention, met en œuvre une paire d'amorces encadrant une séquence nucléique, complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag incluant les sites de clivage, contenant la totalité de la séquence d'acides nucléiques codant pour la protéase, complémentaire en 3 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse. Plus particulièrement, la paire d'amorces mise en œuvre à l'étape (b) encadre une séquence d'acides nucléiques : complémentaire en 5 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 102 de la protéine pl7 (position 1093 sur le génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position
1415 sur le génome), et complémentaire en 3 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 325
(position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le génome) . De façon toute préférée, la paire d'amorces mise en œuvre à l'étape (b) encadre une séquence d'acides nucléiques : complémentaire en 5 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la protéine pl7 et le codon 21 de la protéine p24
(position 1250 sur le génome), et complémentaire en 3 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 335 (position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position
3751 sur le génome). L'amplification de l'étape (b) de la méthode de l'invention est réalisée avec une paire d'amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 nucléotides, de préférence entre 20 et 30 nucléotides. Avantageusement, l'amplification de l'étape (b) est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant : - comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 et SEQ ID NO. 5 (Tableau 1) - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 et
SEQ ID NO. 6 (Tableau 1) des fragments ou analogues de ces séquences . On entend par analogues, soit des séquences portant une ou plusieurs mutations sans que cela n'altère ses capacités d'hybridation dans des conditions de stringences généralement rencontrées lors de la PCR, soit des séquences qui se situent de 1 à 10, 1 à 5 ou 1 à 3 nucléotides en amont ou en aval desdites séquences d'amorces. Tout spécialement, l'invention concerne la mise en œuvre à l'étape (b) d'une paire d'amorce choisie dans le groupe comprenant : - la paire d'amorces Ri de séquences SEQ ID NO.l et SEQ ID NO.2 du tableau 1 - la paire d'amorces R2 de séquences SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.4 du tableau 1 - la paire d'amorces R3 de séquences SEQ ID NO.5 et SEQ ID NO.6 du tableau 1.
L'étape (c) de séquençage de la méthode de l'invention permet d'identifier les mutations connues, inconnues et associées à partir des données disponibles dans la littérature.
A l'étape (d), l'amplification du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) met œuvre une paire d'amorces qui permet de préparer un amplicon caractérisé par : - la présence à chacune de ses extrémités de zones conservées pour permettre la recombinaison avec le vecteur rétroviral, la présence potentielle de mutations d'intérêt. A l'étape (d), l'amplification du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) comprenant tout ou partie du gène gag et du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse est avantageusement réalisé avec une seconde paire d'amorces, complémentaire de la première paire mise en œuvre à l'étape (b), permettant d'obtenir un amplicon comprenant en outre : une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage, - la totalité de la séquence codant pour la protéase, - la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340. L' amplicon tel que défini ci-dessus présente une taille inférieure à 2800pb, de préférence comprise entre 2200 et 2700 pb et tout préférentiellement entre 2300 et 2600 pb. Ainsi, avantageusement, l'amplification de l'étape (d) de la méthode de l'invention, met en œuvre une paire d'amorces encadrant une séquence d'acides nucléiques, complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag incluant les sites de clivage, contenant la totalité de la séquence d'acides nucléiques codant pour la protéase, complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse. Plus particulièrement, la paire d'amorces mise en œuvre à l'étape (d) encadre une séquence d'acides nucléiques : complémentaire en 5 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 102 de la protéine pl7 (position 1093 sur le génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position
1415 sur le génome), et complémentaire en 3 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 325
(position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le génome ) . De façon toute préférée, la paire d'amorces mise en œuvre à l'étape (d) encadre une séquence d'acides nucléiques : complémentaire en 5 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la protéine pl7 et le codon 21 de la protéine p24
(position 1250 sur le génome), et complémentaire en 3 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 335 (position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position
3751 sur le génome). L'amplification de l'étape (d) de la méthode de l'invention est réalisée avec une paire d'amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 nucléotides, de préférence entre 20 et 30 nucléotides. Avantageusement, l'amplification de l'étape (d) est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant : - comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 7 et SEQ ID NO. 9 (Tableau 4) - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 8 et SEQ ID NO. 10
(Tableau 4) des fragments ou analogues de ces séquences. On entend par analogues, soit des séquences portant une ou plusieurs mutations sans que cela n'altère ses capacités d'hybridation dans des conditions de stringences généralement rencontrées lors de la PCR, soit des séquences qui se situent de 1 à 10, 1 à 5 ou 1 à 3 nucléotides en amont ou en aval desdites séquences d'amorces. Tout spécialement, l'invention concerne la mise en œuvre à l'étape (d) d'une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant : - la paire d'amorces Ni de séquences SEQ ID NO.7 et SEQ ID NO.8 du tableau 4 - la paire d'amorces N2 de séquences SEQ ID NO.9 et SEQ ID NO.10 du tableau 4.
L'analyse fonctionnelle de l'étape (f) de la méthode de l'invention consiste plus particulièrement à infecter des cellules cibles du VIH avec les virus recombinants produits à l'étape (e) en présence ou en absence d'une ou plusieurs drogues. A titre d'exemple, on peut citer l'infection de cellules cibles du VIH, en présence ou en absence d'une ou plusieurs drogues, contenant un gène indicateur, indépendant du vecteur rétroviral, dont l'expression est liée à l'infection virale. La mesure de la capacité replicative à l'étape (g) de la méthode de l'invention consiste plus particulièrement à mesurer l'expression d'un gène indicateur en réponse à l'infection par le virus recombinant produit à l'étape (e) en comparaison à un virus de référence. A titre d'exemple, on peut citer les procédés intégrant les valeurs de densités optiques issues d'une réaction enzymatique liée à un gène révélateur indépendant du vecteur et présent dans les cellules infectées.
Selon une forme particulière de réalisation, la méthode de l'invention comprend dans le cas où les étapes (c) et (f) et (g) ont été effectuées : h) le traitement des données relatives : - à la présence éventuelle de mutations déterminée à l'étape (c), et - à l'analyse fonctionnelle des protéines virales de l'étape (f), et - à la capacité replicative de l'étape (g), pour obtenir les caractéristiques du virus et/ou du traitement. A titre d'exemple de tels traitements de ces données, on peut citer les algorithmes d'interprétation des mutations identifiées en (c), les valeurs des concentrations de drogues inhibant 50% (IC50) ou 90% (IC90) de la réplication virale obtenues en (f), la comparaison de la capacité replicative du virus recombinant en (g) avec un virus de référence en absence de drogues. Ceux-ci permettent une interprétation réciproque des caractéristiques du virus et du traitement, de façon à disposer d'un nouvel outil de suivi épidémiologique individuel et collectif.
L'invention concerne aussi des amorces et combinaisons de celles-ci pour l'amplification de séquences d'acides nucléiques du VIH comme définies précédemment.
La méthode de l'invention permet de disposer d'un nouveau test capable, à partir du même échantillon biologique d'un patient VIH, d'obtenir une mesure de la résistance génotypique, phénotypique et de la capacité replicative du virus c'est-à-dire la variation génique enregistrant les mutations connues, les mutations associées et les mutations inconnues et la variation fonctionnelle enregistrant l'infectivité ou capacité replicative du virus en présence ou en absence d' anti-rétroviraux (figure 2). L'invention concerne donc encore un kit pour la mise en œuvre d'une méthode comme décrite comprenant une ou plusieurs amorces définies précédemment. Un tel kit comprend également une méthode d'analyse des 3 données obtenues grâce à la méthode de l'invention : génotype, phénotype et capacité replicative, etc..
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : La figure 1 représente les étapes principales des analyses du génotype, du phénotype et de la capacité replicative. La figure 2 représente la compatibilité des analyses du génotype, du phénotype et de la capacité replicative selon la méthode de l'invention. La figure 3 montre une meilleure efficacité d'amplification des populations virales : Les ARN provenant de 4 patients (A, B, C, D) ont été rétrotrancrits et amplifiés dans les conditions décrites dans la demande de brevet PCT WO 0238792 (test 1) ou dans les conditions définies par la présente invention dans son exemple 1 (test 2). La figure 4 représente la courbe DO/P24 obtenue dans un test de capacité replicative pour un virus de patient (virus 1) et un virus de référence. La figure 5 représente la position des paires d'amorces de l'invention sur le génome du VIH. En outre, la figure montre l'organisation des gènes gag et pol du VIH-1 : - Gène gag : . Matrice (matrix) : pl7 . Capside (core) : p24 . Nucléocapside (CA) : p2 , p7, pi, p6 - Gène pol : . Protéase (PR) : plO Clivage et maturation gag et pol . Reverse transcriptase (RT) : p51 :
Transcription Inverse . RNAse H : pl5 : Activité RNAse H . Intégrase (Int) : p31 : Intégration ADN proviral La Figure 6 montre les régions amplifiées par les différents tests commerciaux de génotypage et phénotypage décrits dans l'exemple 3. Exemple l_j Analyse génique et fonctionnelle de la protéase et de la transcriptase inverse. La méthode selon la présente invention se caractérise en premier lieu par la génération d'un acide nucléique spécifique compatible à la fois avec les techniques de génotypage et les techniques de phénotypage. Pour générer ce premier amplicon spécifique, on procède de la façon suivante :
1) On extrait l'ARN viral contenu dans un échantillon biologique. L'échantillon biologique peut être dérivé d'un prélèvement d'un patient. Il peut s'agir d'un échantillon de sang ou de sérum, mais peut aussi provenir d'un fluide biologique ou d'une biopsie ou de tout autre préparation tissulaire. L'échantillon biologique peut également provenir d'une culture virale. De façon générale, un échantillon biologique correspond à tous types d'échantillons contenant un ou plusieurs variants VIH-1. Par virus VIH-1, on entend toute souche virale appartenant aux sous types B et non B. 2) On rétrotranscrit et amplifie l'ARN obtenu en (1) avec une des paires d'amorces spécifiques du tableau 1 ci-après pour obtenir un amplicon caractérisé par : - La présence, en 5' et en 3', de zones conservées pour permettre l'amplification des populations virales ; la présence de toutes les mutations d'intérêt déjà décrites ; - la présence d'une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage ; - la totalité de la séquence codant pour la protéase ; - la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
Tableau 1
La figure 3 montre que, sur 4 patients, la méthode du brevet donne une meilleure amplification des populations virales que dans les conditions du brevet antérieur. D'autre part, sur une série de 26 patients, la méthode du brevet permet l'amplification de la totalité des échantillons alors que la méthode décrite dans le brevet antérieur ne permet l'amplification efficace que de 16 échantillons sur les 26 testés (4 sont négatifs et 6 sont trop faiblement amplifiés). Les tableaux 2 et 3 ci-après montrent deux exemples d'échantillons de plasmas respectivement des patients 1 et 2 pour lesquels les amplicons générés par la méthode de l'invention ci-dessus ont permis la réalisation du génotype selon les techniques Trugene et Viroseq et du Phénotype selon la technique Phenoscript.
Tableau 2
Tableau 3
Exemple Analyse de la capacité replicative de virus VIH provenant de patients présentant des mutations dans la protéase et la transcriptase inverse. Dans cet exemple, la méthode de l'invention comprend les étapes suivantes : 1) On extrait l'ARN viral contenu dans un échantillon biologique.
2) On Rétrotranscrit et amplifie l'ARN obtenu en (1) avec une paire d'amorces spécifiques permettant d'amplifier de façon régulière un amplicon spécifique, comprenant au moins 2 gènes d'intérêt dans l'étude de la résistance aux anti-rétroviraux, comme décrit à l'exemple 1.
3) La préparation d'un nouvel amplicon à partir de l' amplicon obtenu à l'étape (2) ci-dessus à l'aide d'une nouvelle paire d'amorces décrite dans le tableau 4 ci-après. Ce nouvel amplicon est caractérisé, par : - La présence, en 5' et en 3', de zones conservées pour permettre la recombinaison avec le vecteur rétroviral la présence de toutes les mutations d'intérêt déjà décrites ; - la présence d'une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage ; - la totalité de la séquence codant pour la protéase ; - la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340. Tableau 4
Les amorces de la méthode du brevet décrites dans le tableau 4 permettent une meilleure recombinaison sur des patients présentant de nombreuses mutations avec un nouveau vecteur rétroviral délété d'une partie du gène gag, de la région du cadre de lecture pol codant pour la protéase et une partie de la transcriptase inverse du VIH-1 que la recombinaison décrite dans les conditions du brevet antérieur. Dans les tableaux 5 et 6 ci-dessous, sont listées les mutations identifiées dans le gène de la protéase et de la transcriptase inverse pour une série de 6 patients. Le tableau 7 donne les valeurs moyennes de capacité replicative obtenue pour ces 6 patients dans deux tests indépendants avec la méthode de la présente invention. Dans les conditions décrites dans la demande de brevet PCT WO 0238792), sur cette série de patients présentant de nombreuses mutations, la recombinaison avec le vecteur rétroviral n'était pas assez efficace pour produire un niveau suffisant de virus recombinants et permettre une analyse de la capacité replicative. Tableau 5 : liste des principales mutations identifiées pour les inhibiteurs de protéase (IP) sur les six patients étudiés.
Tableau 6; liste des principales mutations identifiées pour les inhibiteurs de transcriptase inverse (RTI) sur les six patients étudiés.
Tableau 7
Les amorces de la méthode du brevet décrites dans le tableau 4 permettent, sur une autre série de 4 patients ,en outre la production d'une quantité de virus recombinants plus importante que la recombinaison décrite dans les conditions du brevet antérieur ainsi que la normalisation de l'infection des cellules indicatrices en utilisant, par exemple, le dosage de l'antigène p24. Le tableau 8 ci-dessous décrit que la quantité de p24 produite par les virus recombinants de 4 patients selon la méthode du brevet (vecteur GRF) est supérieure à celle du brevet antérieur (vecteur GPR) .
Tableau 8
Les amorces du tableau 4 permettent encore de mesurer la capacité replicative sur une gamme de virus recombinants en comparaison à un virus de référence selon des méthodes quantitatives intégrant les valeurs de densités optiques issues d'une réaction enzymatique liée à un gène révélateur indépendant du vecteur et présent dans les cellules infectées (Figure
4). Les amorces du tableau 4 permettent enfin d'obtenir une bonne reproductibilité de la mesure de la capacité replicative sur deux échantillons contrôles dont l'un présentant des mutations connues pour diminuer la capacité replicative. Le tableau 9 ci- dessous rapporte la reproductibilité de la valeur de capacité replicative sur 2 échantillons contrôles présentant des mutations connues dans la protéase. 3 tests indépendants . Tableau 9
Exemple 3 : Compatibilité de l' amplicon des exemples 1 et 2 avec les différents tests commerciaux.
1) Compatibilité avec les principaux tests commerciaux de génotypage. Les 4 principaux tests commerciaux sont décrits dans un article de W. Cavert & H. H. Balfour (Détection of antiretroviral résistance in HIV-1 Clin Lab Med 2003 23 :915) . 1.1) Trugene™ kit (Bayer visible Genetics Inc,) (Demande de brevet WO 02/070731 ; Grant et. al. Accuracy of the Trugene HIV-1 Genotyping kit J Clin Microbiol 2003 41:1586).
Le Kit de génotypage Trugene HIV-1 est utilisé pour déterminer le génotype de virus de sous types B et non B. L'ARN est extrait à partir des plasmas de patients selon les techniques classiques, l'ARN viral est retrotranscrit et amplifié par PCR avec des amorces spécifiques du gène pol permettant l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques de 1300 pb comprenant pour la protéase les codons 1 à 99 et comprenant pour la transcriptase inverse les codons l à 247. Le produit de RT-PCR ainsi obtenu est utilisé dans chacune des 16 réactions de séquençage en utilisant le principe de la réaction CLIP™, technique de séquençage utilisant des amorces marquées (dye primers). Quatre paires d'amorces différentes sont utilisées pour cette méthode de séquençage, deux paires pour le séquençage de la protéase et deux autres paires pour le séquençage de la transcriptase inverse. Chaque réaction de séquence est initiée par une amorce spécifique marquée (CLIP™) puis interrompue par le nucléotide marqué correspondant. Tous les fragments synthétisés sont ensuite séparés sur gel d'électrophorèse et analysés par un séquenceur automatique, indiquant spécifiquement les fragments se terminant par chacun des quatre nucléotides marqués. Les séquences, une fois reconstituées, sont comparées à la séquence d'un virus de référence, à l'aide d'un logiciel d'alignement. 1.2) ViroSeq™ (Applied Biosystems) (Mracna M et. al. J Clin Microbiol. 2001. 39:4323). L'ARN est extrait à partir des plasmas de patients selon une technique classique d'extraction basée sur l'affinité de l'ARN vis-à-vis de colonnes de sicile, l'ARN viral est retrotranscrit et amplifié par PCR avec des amorces spécifiques du gène pol permettant l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques de 1800 pb comprenant pour la protéase les codons 1 à 99 et comprenant pour la transcriptase inverse les codons 1 à 335. L'ADN ainsi obtenu est ensuite séquence avec 7 amorces différentes selon la technologie Big Dye™ Terminator, technique de séquençage utilisant des nucléotides marqués (dye terminators ) . La réaction de séquence est initiée par chaque amorce spécifique non marquée puis interrompue par chacun des nucléotides marqués. Tous les fragments synthétisés sont ensuite séparés sur gel d'électrophorèse. La couleur du fluorochrome sera alors enregistrée par un séquenceur automatique (séquenceur ABI Prism 377 DNA) , indiquant spécifiquement les fragments se terminant par chacun des quatre nucléotides marqués. Les séquences, une fois reconstituées, sont comparées à la séquence d'un virus de référence, à l'aide d'un logiciel d'alignement.
1.3) GeneSeq™ (ViroLogic) (Parkin NT et. al., Antimicrob.Agents Chemother. 2004. 48 :437). Cette technologie utilise les vecteurs de résistance construits pour le test d'étude phénotypique PhenoSense. La séquence d'acides nucléiques du vecteur comprenant, pour la protéase les codons 1 à 99 et comprenant, pour la transcriptase inverse les codons 1 à 305, est analysée par séquençage en utilisant différentes combinaisons de sondes fluorescentes, les acides nucléiques sont ensuite déposés sur un gel d'électrophorèse et analysés par un séquenceur automatique. Les séquences obtenues sont comparées à celles obtenues pour des virus de référence.
1.4) GenoSure™ (Virco) (Demande de brevet PCT WO 01/81624). L'ARN est extrait à partir des plasmas de patients selon les techniques classiques d'extraction, l'ARN viral est retrotranscrit et amplifié par PCR avec des amorces spécifiques du gène pol permettant l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques de 1800 pb comprenant pour la protéase les codons 1 à 99 et comprenant pour la transcriptase inverse les codons l à 415. L'ADN ainsi obtenu est ensuite séquence selon la technologie Big Dye™ Terminator, précédemment décrite.
2) Compatibilité avec les principaux tests commerciaux de phénotypage. Une synthèse récente de M. Youle «Clinical Issues in HIV » publiée en décembre 2003 sur le site www.hivandhepatitis.com décrit les principaux tests de résistance. Trois tests sont actuellement disponibles :
Phenoscript™ (Viralliance) ; Antivirogram™ (Virco) ; PhenoSense™ (ViroLogic).
2.1) Le test développé par Virco, Antivirogram™, n'est pas compatible avec la méthode de l'invention car le fragment d'acides nucléiques de 2200 pb amplifié à partir de l'ARN du patient comprend la protéase du codon 10 au codon 99 et la totalité de la transcriptase inverse. (Hertogs et. al. 1998. Antimicrob.Agents Chemother).
2.2) PhenoSense™ (ViroLogic) (Parkin NT et. al., Antimicrob.Agents Chemother. 2004. 48 :437 ; Petropoulos et. al., Antimicrob.Agents Chemother. 2000. 44 :920). Le test PhenoSense est réalisé à partir de l'ARN viral extrait du plasma d'un patient VIH. Les régions du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse sont amplifiées par RT-PCR pour obtenir une séquence d'acides nucléiques de 1500 pb comprenant les sites de clivage de la protéine gag (p7- pl-p6) la région entière codant pour la protéase et la région de la transcriptase inverse allant du codon 1 au codon 313. Cette séquence est ensuite insérée par ligation dans un vecteur rétroviral VIH contenant un gène rapporteur (Luciférase) et délété dans la protéine d'enveloppe du VIH. Le vecteur rétroviral est ensuite co-transfecté dans des cellules 293T avec un vecteur codant pour la protéine d'enveloppe MLV (Murine Leukemia Virus). Les virus produits sont utilisés pour infecter de nouvelles cellules en présence ou en absence d'antirétroviraux. L'activité luciférase dans les cellules infectées en présence de drogue est comparée à l'activité luciférase en absence de drogue ce qui permet le calcul des concentrations inhibant 50% de la production virale (IC50). Le tableau 10 ci-dessous résume les caractéristiques des séquences d'acides nucléiques amplifiées dans les principaux tests décrits précédemment. Tableau 10
La Figure 6 montre les régions amplifiées par les différents tests commerciaux de génotypage et phénotypage décrits dans l'exemple 3. L' amplicon selon la présente invention, désigné « nouvel amplicon » dans la figure 6 est compatible avec l'ensemble de ces tests.
Exemple 4 : Détermination d'un score comme outil d'aide à la décision thérapeutique.
A partir d'un échantillon biologique d'un patient VIH, la méthode de l'invention permet de prendre en compte dans un système de score les mesures de variabilité génique et fonctionnelle d'un virus VIH appartenant aux sous types B et non B. La mesure de la variabilité génique est réalisée à partir de la séquence d'acides nucléiques spécifique amplifiée selon la méthode de l'invention, puis analysée selon les techniques de séquençage usuelles (Trugene, ViroSeq). Les mutations dans les gènes de la protéase et de la transcriptase inverse identifiées par ces tests sont interprétées selon des algorithmes remis à jour régulièrement par des comités d'experts. Un premier score de 0 à 2 est attribué à chacun des 3 niveaux de résistance déterminés par l'interprétation. Le tableau 11 ci-dessous résume les interprétations données par les tests Trugene et ViroSeq en fonction des mutations identifiées et des antirétroviraux (ARV) utilisés et attribue un score génotypique correspondant à l'importance de la résistance. Tableau 11
La mesure de la variabilité fonctionnelle d'un virus VIH consiste en l'analyse de la capacité replicative du virus en présence (phénotype) ou en absence d' antirétroviraux (Fitness). Le principe des tests de résistance phénotypique repose sur la mesure in vitro de la croissance d'un virus de patient en présence de drogues, comparée à un virus de référence (index de résistance). Le niveau de résistance est défini en fonction de seuils de sensibilité (eut off). Un second score de 0 à 2 est attribué à chacun des 3 niveaux de résistance déterminés par l'interprétation. Le tableau 12 résume les interprétations données par les principaux tests Phénotypiques PhenoSense et Phenoscript en fonction de leurs seuils de sensibilité et attribue un score phénotypique correspondant à l'importance de la résistance. Le tableau 12 ci-dessous rapporte l'attribution d'un score phénotypique en fonction de l'interprétation des seuils phénotypiques. Tableau 12
La capacité replicative d'un virus, ou fitness, en l'absence d' antirétroviral est mesurée en comparaison à un virus de référence. Elle renseigne sur la capacité du virus à se répliquer et est exprimée en % du virus de référence. A titre d'exemples, on peut citer un virus ayant une fitness de 100% qui sera considéré comme ayant une forte activité replicative et un virus ayant une fitness de 10% qui sera considéré comme ayant une faible activité replicative. La combinaison des deux scores, génotype, phénotype et du pourcentage de capacité replicative à partir d'un même échantillon biologique doit permettre une meilleure interprétation des données cliniques et fournir un outil d'aide à la décision thérapeutique. En pratique, l'addition des scores génotypiques et phénotypiques pour un antirétroviral donné, combinée à la mesure de la capacité replicative peut permettre d'orienter le choix thérapeutique. Le score génotypique + phénotypique sera compris entre 0 et 4 pour chaque ARV et sera accompagné d'un % de capacité replicative. Ainsi, pour un ARV en cours au moment du prélèvement si le score génotypique + phénotypique est inférieur à 1 et que la capacité replicative est élevée (100% ou plus), il faut favoriser l'arrêt de la molécule car, le virus est résistant et garde une forte capacité à se répliquer en présence de cet ARV. Pour un ARV en cours au moment du prélèvement si le score génotypique + phénotypique est inférieur à 1, et la capacité replicative faible (10%), la poursuite de la molécule peut être préférée à l'arrêt du traitement par le clinicien en l'absence d'alternative thérapeutique.

Claims

REVENDICATIONS
1) Méthode d'analyse d'un échantillon susceptible de contenir un virus VIH, comprenant les étapes suivantes : a) l'extraction de l'ARN viral d'un échantillon biologique susceptible de contenir un virus VIH ; b) la transcription inverse de l'ARN obtenu à l'étape (a) et l'amplification avec une première paire d'amorces permettant l'obtention d'un produit amplifié de transcription inverse comprenant tout ou partie d'au moins deux gènes successifs du génome d'un virus VIH ; ladite méthode comprenant en outre : - l'étape (c), et/ou - la suite d'étapes (d),(e), (f) et (g), ci-après : c) le séquençage du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) de façon à établir un génotype du virus VIH présent dans ledit échantillon et identifier les mutations éventuellement présentes dans ledit produit de transcription inverse ; d) l'amplification du produit de transcription inverse obtenu à l'étape (b) avec une seconde paire d'amorces, complémentaire de la première paire mise en œuvre à l'étape b, et capable de générer un produit d'amplification susceptible d'être inséré par recombinaison homologue dans un vecteur rétroviral défectif dans la région correspondant au produit amplifié de transcription inverse préparé à l'étape (b) ; e) la recombinaison homologue dudit produit d'amplification préparé à l'étape (d) avec ledit vecteur défectif ; f) l'analyse fonctionnelle des protéines virales codées par tout ou partie desdits au moins deux gènes successifs du produit de transcription inverse recombiné dans un vecteur à l'étape (d) ; g) la mesure de la capacité replicative des virus recombinants obtenus à l'étape (e) en présence ou absence d'une ou plusieurs drogues.
2) Une méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'à l'étape (b), la première paire d'amorces permet l'obtention d'un produit amplifié de transcription inverse, comprenant tout ou partie d'au moins deux gènes utiles dans l'étude de la résistance aux anti-rétroviraux.
3) Une méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'à l'étape
(b), la première paire d'amorces permet de préparer un produit amplifié de transcription inverse présentant : - à chacune de ses extrémités des zones conservées pour permettre l'amplification des populations virales, - potentiellement des mutations d'intérêt.
4) Une méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'à l'étape (b), la première paire d'amorces permet de préparer un produit amplifié de transcription inverse comprenant tout ou partie du gène gag et du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse impliqués dans la capacité replicative du virus, et susceptible de conférer, au virus, une résistance thérapeutique.
5) Une méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) on obtient un produit amplifié de transcription inverse possédant : une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage, - la totalité de la séquence codant pour la protéase, - la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340. 6) Une méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) on obtient un produit amplifié de transcription inverse présentant une taille inférieure à 2800pb, de préférence comprise entre 2200 et 2700 pb et tout préférentiellement entre 2300 et 2600 pb.
7) Une méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) la première paire d'amorces encadre une séquence nucléique, complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag incluant les sites de clivage, contenant la totalité de la séquence d'acides nucléiques codant pour la protéase, et complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse.
8) Une méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) la première paire d'amorces encadre une séquence d'acides nucléiques : complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 102 de la protéine pl7 (position 1093 sur le génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position
1415 sur le génome), et complémentaire en 3 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 325
(position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le génome ) .
9) Une méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisée en ce qu'à l'étape
(b) la première paire d'amorces encadre une séquence d'acides nucléiques : complémentaire en 5 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la protéine pl7 et le codon 21 de la protéine p24
(position 1250 sur le génome), et complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 335
(position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position
3751 sur le génome).
10) Une méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisée en ce qu'à l'étape
(b) l'amplification est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant : - comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 et SEQ ID NO. 5 - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 et
SEQ ID NO. 6 des fragments ou analogues de ces séquences. 11) Une méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 10, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) l'amplification est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant : - la paire d'amorces séquences SEQ ID NO.l et SEQ ID NO.2 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.4 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID NO.5 et SEQ ID NO.6.
12) Une méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'étape (c) de séquençage permet d'identifier les mutations connues, inconnues et associées à partir des données disponibles dans la littérature.
13) Une méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'à l'étape (d), l'amplification du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) met œuvre une paire d'amorces qui permet de préparer un amplicon présentant : - à chacune de ses extrémités des zones conservées pour permettre la recombinaison avec le vecteur rétroviral - potentiellement des mutations d'intérêt.
14) Une méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'à l'étape (d), l'amplification du produit amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b) comprend tout ou partie du gène gag et du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase inverse, est réalisée avec une seconde paire d'amorces, complémentaire de la première paire mise en œuvre à l'étape (b), et permettant d'obtenir un amplicon comprenant : - une partie de la séquence d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les sites de clivage, - la totalité de la séquence codant pour la protéase, - la séquence codant pour la transcriptase inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
15) Une méthode selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce que 1' amplicon présente une taille inférieure à 2800pb, de préférence comprise entre 2200 et 2700 pb et tout préférentiellement entre 2300 et 2600 pb.
16) Une méthode selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisée en ce que l'amplification de l'étape (d) met en œuvre une paire d'amorces encadrant une séquence d'acides nucléiques, complémentaire en 5 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag incluant les sites de clivage, contenant la totalité de la séquence d'acides nucléiques codant pour la protéase, complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse.
17) Une méthode selon l'une des revendications 13 à 16, caractérisée en ce que la paire d'amorces mise en œuvre à l'étape (d) encadre une séquence d'acides nucléiques : - complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 102 de la protéine pl7 (position 1093 sur le génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position 1415 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 325 (position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le génome ) .
18) Une méthode selon l'une des revendications 13 à 17, caractérisée en ce que la paire d'amorces mise en œuvre à l'étape (d) encadre une séquence d'acides nucléiques : - complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la protéine pl7 et le codon 21 de la protéine p24 (position 1250 sur le génome), et - complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 335 (position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position 3751 sur le génome). 19) Une méthode selon l'une des revendications 13 à 18, caractérisée en ce que l'amplification de l'étape (d) est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant : - comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 7 et SEQ ID NO. 9 - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 8 et SEQ ID NO. 10 des fragments ou analogues de ces séquences.
20) Une méthode selon l'une des revendications 13 à 19, caractérisée en ce que l'amplification de l'étape (d) est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant : - la paire d'amorces de séquences SEQ ID NO.7 et SEQ ID NO.8 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID NO.9 et SEQ ID NO.10.
21) Une méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'analyse fonctionnelle de l'étape (f) consiste à infecter des cellules cibles du VIH avec les virus recombinants produits à l'étape (e) en présence ou en absence d'une ou plusieurs drogues.
22) Une méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la mesure de la capacité replicative à l'étape (g) consiste à mesurer l'expression d'un gène indicateur en réponse à l'infection par le virus recombinant produit à l'étape (e) en comparaison à un virus de référence. 23) Une méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que dans le cas où les étapes (c) et (f) et (g) ont été effectuées, ladite méthode comprend : h) le traitement des données relatives : - à la présence éventuelle de mutations déterminée à l'étape (c), et - à l'analyse fonctionnelle des protéines virales de l'étape (f), et - à la capacité replicative de l'étape (g), pour obtenir les caractéristiques du virus et/ou du traitement.
24) Un jeu d'amorces susceptibles d'être mise en œuvre dans une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué d'une paire d'amorces encadrant une séquence nucléique, complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag incluant les sites de clivage, contenant la totalité de la séquence d'acides nucléiques codant pour la protéase, et complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse.
25) Un jeu d'amorces selon la revendication 24, caractérisé en ce que ladite paire d'amorces encadre une séquence d'acides nucléiques : complémentaire en 5 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 102 de la protéine pl7 (position 1093 sur le génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position
1415 sur le génome), et complémentaire en 3 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 325
(position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le génome ) .
26) Un jeu d'amorces selon l'une des revendication 24 ou 25, caractérisé en ce que ladite paire d'amorces encadre une séquence d'acides nucléiques : complémentaire en 5 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la protéine pl7 et le codon 21 de la protéine p24 (position 1250 sur le génome), et complémentaire en 3 ' de la région phylogénétiquement conservée du gène codant pour la transcriptase inverse, comprise entre le codon 335 (position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position 3751 sur le génome).
27) Un jeu d'amorces selon l'une des revendications 24 à 26, caractérisé en ce que ladite paire est choisie dans le groupe comprenant : - comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 et SEQ ID NO. 5 - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 et SEQ ID NO. 6 des fragments ou analogues de ces séquences . 28) Un jeu d'amorces selon l'une des revendications 24 à 27, caractérisé en ce que ladite paire est choisie dans le groupe comprenant : - la paire d'amorces séquences SEQ ID NO.l et SEQ ID NO.2 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.4 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID NO.5 et SEQ ID NO.6.
29) Un jeu d'amorces susceptibles d'être mise en œuvre dans une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisée en ce qu'il comprend ou est constitué d'une paire d'amorces choisie dans le groupe comprenant : - comme amorce sens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 7 et SEQ ID NO. 9 - comme amorce antisens, celle représentée par l'une des séquences SEQ ID NO. 8 et SEQ ID NO. 10 - des fragments ou analogues de ces séquences.
30) Un jeu d'amorces selon la revendication 29, caractérisé en ce que ladite paire d'amorces est choisie dans le groupe comprenant : - la paire d'amorces de séquences SEQ ID NO.7 et SEQ ID NO.8 - la paire d'amorces de séquences SEQ ID NO.9 et SEQ ID NO.10.
31) Un jeu d'amorce selon l'une quelconque des revendications 24 à 30, caractérisée en ce que ladite paire d'amorces permet d'amplifier une séquence présentant une taille inférieure à 2800pb, de préférence comprise entre 2200 et 2700 pb et tout préférentiellement entre 2300 et 2600 pb.
32) Un kit pour la mise en œuvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un jeu d'amorces selon l'une quelconque des revendications 24 à 31.
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