CN110527745A - 用于一次性hiv基因型耐药检测的简并引物组及其应用 - Google Patents

用于一次性hiv基因型耐药检测的简并引物组及其应用 Download PDF

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CN110527745A CN201910644838.7A CN201910644838A CN110527745A CN 110527745 A CN110527745 A CN 110527745A CN 201910644838 A CN201910644838 A CN 201910644838A CN 110527745 A CN110527745 A CN 110527745A
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    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS

Abstract

本发明提供了用于HIV基因型耐药检测的简并引物组及其应用，涉及病毒检测技术领域，所述简并引物组包括逆转录PCR引物、巢氏PCR扩增引物和测序通用引物；所述逆转录PCR引物包括WC‑pol‑F和WC‑pol‑R；所述巢氏PCR扩增引物包括WC‑nest‑F和WC‑nest‑R；所述测序通用引物包括HBX2‑3017R、HBX2‑3785R和HBX2‑4561R。本发明所述简并引物组适用于中国流行的大多数HIV‑1毒株基因型耐药检测，可一次性扩增HIV病毒蛋白酶‑逆转录酶‑整合酶的基因编码区，与常规方法比成本更低、检测速度更快，同时检测成功率更高。

Description

用于一次性HIV基因型耐药检测的简并引物组及其应用
技术领域
本发明涉及病毒基因型检测技术领域，尤其涉及用于一次性HIV基因型耐药检测的简并引物组及其应用。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)攻击人类免疫系统，严重威胁人类生命健康。HIV耐药突变株的出现，不仅使得患者抗病毒治疗的效果下降，死亡病例增加；更重要的是，耐药毒株的流行将带来严重的公共卫生问题。为此，检测HIV基因型耐药突变是非常必要的。HIV-1基因组全长约9kb，为单链反义RNA病毒，其中pol区编码蛋白酶、逆转录酶和整合酶，从2357nt到5095nt，是引起耐药突变的主要区域。当前，几家公司有成熟的商品化检测试剂盒，比如ViroSeq，TRUEGENE,Geneship等，但都仅仅检测蛋白酶和部分逆转录酶区，而且价格昂贵，预计单次检测在人民币2000元以上。在临床上，为了节省成本，主要采用“In-house”的方法:提取待检者血浆中游离的病毒RNA，然后逆转录PCR成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增和巢氏PCR扩增，纯化回收PCR产物，目的片段经Sanger测序，将序列在Stanford University Drug Resistance Database里比对，得到相应的耐药突变位点。
随着整合酶抑制剂的使用，整合酶耐药突变毒株也开始出现。因此，临床上又需要开展整合酶编码基因的突变检测。但是，至今为止，蛋白酶-逆转录酶区和整合酶区的检测都是单独进行的，要分别至少进行一次逆转录PCR反应和普通PCR扩增。这意味着HIV基因型耐药检测需要两次逆转录PCR反应和两次PCR扩增，费钱费时。这样的缺点在临床检验部门处理大量样本时尤其突出。
HIV RNA在复制过程中，由于没有校正(proofreading)功能，会产生大量序列变异。这样就导致单一的引物在遇到不同亚型(subtype)的HIV毒株时，无法与模板结合，导致逆转录PCR或者巢氏PCR扩增失败。而且，由于整个过程步骤多，中间产物无法检测，在失败时，只能从头开始重复实验，甚至重新提取RNA，大大增加成本。另外，在常规Sanger测序时，由于单一引物不能结合模板，而导致测序失败。检测结果不能及时报告，使得临床医生没有耐药数据，在更换抗病毒治疗方案时非常困惑。因此，非常有必要重新设计和优化针对不同亚型的PCR引物和测序引物。
发明内容
本发明为了克服现有的HIV基因型耐药检测失败率高、检测成本高、检测时间长的缺陷，提供了一种新的用于HIV基因型耐药检测的简并引物组和试剂盒以及检测方法，利用本发明提供的简并引物组可一次性扩增HIV的蛋白酶-逆转录PCR酶-整合酶的编码基因，降低了临床检测成本、节约时间，增加了检测成功率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了用于一次性HIV基因型耐药检测的简并引物组，包括逆转录PCR引物、巢氏PCR扩增引物和测序通用引物；
所述逆转录PCR引物包括WC-pol-F和WC-pol-R；
所述WC-pol-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述WC-pol-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述巢氏PCR扩增引物包括WC-nest-F和WC-nest-R；
所述WC-nest-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述WC-nest-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述测序通用引物包括HBX2-3017R、HBX2-3785R和HBX2-4561R；
所述HBX2-3017R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述HBX2-3785R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述HBX2-4561R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
SEQ ID NO.2～4所示的核苷酸序列中的R为A或G。
优选的，所述简并引物组能够检测的HIV亚型包括但不限于：A、B、B’、C、CRF01_AE、CRF02_AG、CRF_07BC、CRF_08BC、CRF_BC、CRF_07BC/08BC、CRF01_AE/B、CRF01_AE/07BC和CRF01_AE/B’/C。
优选的，所述WC-pol-R、WC-nest-F或WC-nest-R中，R为A的特定引物与R为G的特定引物的数量比为1:1。
本发明还提供了上述技术方案所述简并引物组在HIV基因型耐药检测中的应用。
本发明还提供了一次性HIV基因型耐药检测试剂盒，包括前述技术方案所述的简并引物组。
本发明还提供了利用前述技术方案所述简并引物组制备一次性HIV基因型耐药检测所需DNA样品的方法，包括以下步骤：
(1)从待测样品中提取HIV RNA，得到待测RNA；
(2)以所述简并引物组中的逆转录PCR引物对所述待测RNA进行一步法逆转录PCR，得到待测DNA；
(3)以所述待测DNA为模板，利用所述简并引物组中的巢氏PCR引物对进行巢氏PCR扩增，得到待测的DNA样品。
(4)对所述待测的DNA样本，利用所述简并引物组中的测序通用引物、WC-nest-F以及WC-nest-R进行Sanger测序，得到待分析的DNA序列。
优选的，步骤(2)中，所述逆转录PCR的反应条件包括：50℃ 30min，94℃ 2min，94℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 2min，30个循环，72℃ 10min。
优选的，步骤(2)中，所述逆转录PCR过程中，逆转录PCR引物在反应体系中的浓度为0.4μM。
优选的，步骤(3)中，所述巢氏PCR扩增的反应条件包括：94℃ 3min，94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min，30个循环，72℃ 10min。
优选的，步骤(3)中，所述巢氏PCR扩增过程中，巢氏PCR扩增引物在反应体系中的浓度为0.4μM。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、在全球的HIV-1流行亚型中，A亚型、B亚型、C亚型、CRF02_AG和CRF01_AE重组型占到所有流行亚型的84％。中国HIV-1流行最广泛的毒株为CRF01_AE、CRF07_BC重组型，以及B’亚型。本发明将上述HIV病毒亚型的序列进行多序列比对寻找到不同亚型的保守区域。在保守区域设计引物，可以实现对不同HIV亚型进行扩增以及对扩增产物进行Sanger测序。
2、随着整合酶抑制剂的应用，对HIV亚型关于整合酶区域耐药性的检测也至关重要。本发明提供的简并引物可一次性扩增得到含有“蛋白酶-逆转录酶-整合酶”编码基因的DNA片段，可实现更为全面的对HIV基因型耐药检测的需求。
3、本发明通过优化逆转录PCR引物和巢氏扩增引物，在关键位置引入了混合碱基(R)，以确保变异时，引物总能与模板退火进行逆转录PCR。更重要的是，通过本发明设计的简并引物组，可直接一次性扩增蛋白酶-逆转录酶-整合酶编码区。这样的片段可以进行sanger测序从而拿到HIV基因型耐药突变信息。
4、相对于常规“in-house”技术分别检测HIV的蛋白酶-逆转录酶区与整合酶区的两次HIV基因型耐药检测，本发明提供的一次性HIV基因型耐药检测的简并引物组、试剂盒、测序通用引物以及检测方法的成本更低、检测速度更快，同时检测成功率高于现有“in-house”技术。
附图说明
图1为WC-pol-F的引物序列和对应的多序列比对结果；
图2为WC-pol-R的引物序列和对应的多序列比对结果；
图3为WC-nest-F的引物序列和对应的多序列比对结果；
图4为WC-nest-R的引物序列和对应的多序列比对结果；
图5为HBX2-3017R的引物序列和对应的多序列比对结果；
图6为HBX2-3785R的引物序列和对应的多序列比对结果；
图7为HBX2-4561R的引物序列和对应的多序列比对结果；
图8为琼脂糖凝胶电泳检测巢氏PCR产物；其中，M为分子量标准，泳道1为阳性对照，以pNL4-3.Luc.R–E为模板；泳道2-6分别是样本1-5号的巢氏PCR产物；
图9为1号样本的耐药测序报告截图；1号样本为CRF_01AE亚型；
图10为2号样本的耐药测序报告截图；2号样本为CRF_01AE亚型；
图11为3号样本的耐药测序报告；3号样本为A亚型；
图12为4号样本的耐药测序报告；4号样本为CRF68_01B亚型；
图13为5号样本的耐药测序报告；5号样本为B+C亚型。
具体实施方式
本发明提供了用于HIV基因型耐药检测的简并引物组，包括逆转录PCR引物、巢氏PCR扩增引物和测序通用引物。利用本申请所述简并引物组扩增的目的产物为HIV的“蛋白酶-逆转录酶-整合酶”的编码基因，目的产物的全长为2955bp。
本发明所述逆转录PCR引物包括WC-pol-F和WC-pol-R；
所述WC-pol-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
SEQ ID NO.1：5’-gaggctagaaggagagagatgggtg-3’；
所述WC-pol-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
SEQ ID NO.2：5’-cttcctgccatagraratgcctaag-3’。
本发明所述巢氏PCR扩增引物包括WC-nest-F和WC-nest-R；
所述WC-nest-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
SEQ ID NO.3：5’-tcactctttggcarcgacc-3’；
所述WC-nest-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
SEQ ID NO.4：5’-tgggatrtgtacttctgaactta-3’。
本发明所述测序通用引物包括HBX2-3017R、HBX2-3785R和HBX2-4561R；
所述HBX2-3017R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
SEQ ID NO.5：5’-tgatcctttccatccctgtg-3’。
所述HBX2-3785R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
SEQ ID NO.6：5’-aggaatccaggtggcttgc-3’。
所述HBX2-4561R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
SEQ ID NO.7：5’-ttgactggccatcttcctgc-3’。
在本发明中，SEQ ID NO.2～4所示的核苷酸序列中的R为A或G。本发明优选的，所述WC-pol-R、WC-nest-F或WC-nest-R中，R为A的特定引物与R为G的特定引物的数量比为1:1。
本发明所述的简并引物组是根据HIV各基因型亚型的保守序列设计得到，所述简并引物组能够用于检测的HIV基因型的亚型包括但不限于A、B、B’、C、CRF01_AE、CRF02_AG、CRF_07BC、CRF_08BC、CRF_BC、CRF_07BC/08BC、CRF01_AE/B、CRF01_AE/07BC和CRF01_AE/B’/C。
具体的，本发明在NCBI数据库上获得HIV不同亚型毒株的全长或者近全长序列，包括A、B、B’、C、CRF01_AE、CRF02_AG、CRF_07BC、CRF_08BC、CRF_BC、CRF_07BC/08BC、CRF01_AE/B、CRF01_AE/07BC、CRF01_AE/B’/C。经过多序列比对(DNAman软件)，我们发现在pol区前后有相对保守区域(如图1～7所示)。
在这些相对保守的区域设计引物，使得引物可以结合不同HIV亚型的RNA。以参考毒株HXB2全长(9719bp)为基础，WC-pol-F设计在从772nt到796nt的保守区；WC-pol-R设计在从5957nt到5981nt的保守区。WC-nest-F设计在从2260nt到2278nt的保守区；WC-nest-R设计在从5192nt到5214nt的保守区；HBX2-3017R设计在从2998nt到3017nt的保守区；HBX2-3785R设计在从3767nt到3785nt的保守区；HBX2-4561R设计在从4542nt到4561nt的保守区；
WC-pol-F：GAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTG(SEQ ID NO.1)；
WC-pol-R：CTTCCTGCCATAGRARATGCCTAAG(SEQ ID NO.2)；
WC-nest-F：TCACTCTTTGGCARCGACC(SEQ ID NO.3)；
WC-nest-R：TGGGATRTGTACTTCTGAACTTA(SEQ ID NO.4)；
HBX2-3017R：TGATCCTTTCCATCCCTGTG(SEQ ID NO.5)；
HBX2-3785R：AGGAATCCAGGTGGCTTGC(SEQ ID NO.6)；
HBX2-4561R：TTGACTGGCCATCTTCCTGC(SEQ ID NO.7)
其中R代表A或者G，在合成时，A：G＝1:1。
本发明还提供了一种一次性HIV基因型耐药检测的试剂盒，包括上述技术方案所述的简并引物组。本发明优选的，所述试剂盒还包括HIV RNA的提取试剂、一步法逆转录PCR试剂、巢氏PCR扩增试剂。
本发明还提供了上述技术方案所述简并引物组在HIV基因型耐药检测中的应用。具体的，利用本发明提供的简并引物组可一次性扩增得到HIV基因型耐药性检测所需的DNA片段，后续再进行Sanger测序、突变位点比对等步骤即可。将本发明所述简并引物应用到HIV基因型耐药检测中，可有效缩短检测时间和检测成本，并提高检测的成功率。
本发明还提供了一次性HIV基因型耐药检测试剂盒，包括前述技术方案所述的简并引物组。本发明优选的，所述试剂盒还包括HIV RNA的提取试剂、逆转录PCR试剂、巢氏PCR扩增试剂。
在本发明中，所述HIV RNA的提取试剂用于提取待测样品中游离的HIV RNA。本发明所述HIV RNA的提取试剂可选用市售的提取试剂盒，也可自行配制试剂。
在本发明中，所述逆转录PCR试剂包括除了逆转录PCR引物以外的反应试剂，包括但不限于反应缓冲液、逆转录酶、Taq酶和纯化水。本发明所述逆转录PCR试剂可购买市售试剂也可以自行制备。如本发明的实施例所示，选用市售的Takara one step试剂盒进行一步法逆转录PCR。
在本发明中，所述巢氏PCR扩增试剂包括除了巢氏PCR扩增引物以外的反应试剂，包括但不限于巢氏PCR扩增反应缓冲液、Taq酶和纯化水。本发明所述巢氏PCR扩增试剂可购买市售试剂也可以自行制备。
在本发明中，所述测序通用引物也是在不同HIV亚型序列的保守区域，可以保证在测序时，引物能结合上去，保证测序成功。
本发明还提供了利用前述技术方案所述简并引物组制备一次性HIV基因型耐药检测所需DNA样品的方法，包括以下步骤：
(1)从待测样品中提取HIV RNA，得到待测RNA；
在本发明中，所述待测样品为待测患者的血液。
在本发明中，所述提取HIV的RNA优选的利用HIV RNA的提取试剂进行，本发明对此无特殊限定。
(2)以所述简并引物组中的逆转录PCR引物对所述待测RNA进行一步法逆转录PCR，得到待测DNA。本发明中的逆转录PCR引物对能够实现对多种HIV亚型进行互补扩增，可提高逆转录的成功率。
在本发明中，所述一步法逆转录PCR的反应条件优选的包括：50℃ 30min，94℃2min，94℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 2min，30个循环，72℃ 10min。
在本发明中，所述一步法逆转录PCR过程中，逆转录PCR引物在反应体系中的浓度优选的独立为0.4μM，即WC-pol-F的浓度为0.4μM，WC-pol-R中的每个特定引物浓度为0.4μM。
在本发明中，所述一步法逆转录PCR的反应体系，每50μL反应体系中优选的包括：PrimeScript 1Step Enzyme Mix 2μL、2×1Step Buffer 25μL、20μM的WC-pol-F 1μL、100μM的WC-pol-R 0.8μL、待测RNA 5μL和余量的水。
(3)以所述待测DNA为模板，利用所述简并引物组中的巢氏PCR引物对进行巢氏PCR扩增，得到待测的DNA样品。经由逆转录得到的待测DNA较长，且特异性不够高，本发明利用所述巢氏PCR引物对进行巢氏PCR扩增，能够有效增加所得DNA片段的特异性。
在本发明中，所述巢氏PCR扩增的反应条件优选的包括：94℃ 3min，94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min，30个循环，72℃ 10min。
在本发明中，所述巢氏PCR扩增过程中，巢氏PCR扩增引物在反应体系中的浓度优选的独立为0.4μM；即WC-nest-F和WC-nest-R中的每一个特定引物浓度独立的为0.4μM。
在本发明中，所述巢氏PCR扩增的反应体系，每50μL反应体系优选的包括：2×Buffermix 25μL、40μM的WC-nest-F 1μL、40μM的WC-nest-R 1μL、待测DNA 5μL和余量的水。
若本发明得到的待测扩增产物全长为2955bp，则对待测扩增产物进行进一步的Sanger测序。在本发明中，所述Sanger测序可委托测序公司进行。
(4)对所述待测的DNA样本，利用所述简并引物组中的测序通用引物、WC-nest-F以及WC-nest-R进行Sanger测序，得到待分析的DNA序列。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例
1、用Viral RNAMini(货号52906)试剂盒分别从5个HIV感染病人血浆中提取游离的HIV RNA，5份血浆中病毒载量都大于1000个拷贝。
2、利用Takara公司的一步法逆转录试剂盒(PrimeScriptTMOne Step RT-PCR KitVer.2，货号，RR055A)，加入本发明所述简并引物组中逆转录PCR引物对中的上游引物(WC-pol-F)和下游引物(WC-pol-R)进行逆转录成cDNA。具体如下：
WC-pol-F：GAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTG(SEQ ID NO.1)；
WC-pol-R：CTTCCTGCCATAGRARATGCCTAAG(SEQ ID NO.2)；
表1逆转录PCR的反应体系
试剂 用量 终浓度
PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μL
2×1 Step Buffer 25μL 1x
WC-pol-F(20μM) 1μL 0.4μM
WC-pol-R(100μM) 0.8μL 0.4μM*
RNA template 5μL
H<sub>2</sub>O 16.2μL
*由于是简并引物组，每一条特定的引物在混合引物中占的比例是1/4，也就是25μM，当在50μL体系中加入0.8μL时，每一条有效引物的终浓度为0.4μM。
一步法逆转录PCR条件：
50℃ 30min；94℃ 2min，94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 2min，30个循环，72℃ 10min，12℃待机。
3、取5μL第一步PCR产物作为模板，加入PrimeStar Max DNA Polymerase酶(货号R045A)。另外，单独加入pNL4-3.Luc.R–E作为阳性对照(pNL4-3.Luc.R–E中包含HIV-1全长的DNA序列)。采用本发明所述简并引物组中的巢氏PCR引物对中的上游引物(WC-nest-F)和下游引物(WC-nest-R)进行巢氏PCR扩增，得到待测的DNA样品。所述待测扩增产物为2955bp的DNA片段，包括蛋白酶-逆转录酶-整合酶编码基因。
WC-nest-F：TCACTCTTTGGCARCGACC(SEQ ID NO.3)；
WC-nest-R：TGGGATRTGTACTTCTGAACTTA(SEQ ID NO.4)；
表2巢氏PCR扩增的反应体系
*由于是简并引物组，每一条特定的引物在混合引物中占的比例是1/2，也就是20μM，当在50μL体系中加入1μL时，每一条有效引物的终浓度为0.4μM。
PCR条件：
94℃ 3min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，30个循环，72℃ 10min。
4、对待测扩增产物进行纯化回收后，纯化回收都是按照试剂盒标准流程做。
5、将纯化的PCR产物外送测序公司进行Sanger测序。测序所用引物为WC-nest-F、WC-nest-R、HBX2-3017R、HBX2-3785R和HBX2-4561R。
6、将测序序列进行拼接，然后将全长输入美国斯坦福大学的HIV耐药数据库进行分析(https://hivdb.stanford.edu/hivdb/by-sequences/)，得出耐药突变。
结果检测：
琼脂糖凝胶电泳的结果如图8所示，可以看出，5份待测样本与对照质粒均得到了2955bp的产物。
如图9～13所示，5份报告截图显示了本发明扩增的PCR产物包含了HIV蛋白酶-逆转录酶-整合酶的编码基因全长。并且，5份HIV样本中，包含了CRF01_AE、CRF68_01B、A和B+C等4种不同的亚型。成功率为100％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京市第二医院
<120> 用于一次性HIV基因型耐药检测的简并引物组及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggctagaa ggagagagat gggtg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttcctgcca tagraratgc ctaag 25
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcactctttg gcarcgacc 19
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgggatrtgt acttctgaac tta 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgatcctttc catccctgtg 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggaatccag gtggcttgc 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttgactggcc atcttcctgc 20

Claims (10)

1.用于HIV基因型耐药检测的简并引物组，包括逆转录PCR引物、巢氏PCR扩增引物和测序通用引物；
所述逆转录PCR引物包括WC-pol-F和WC-pol-R；
所述WC-pol-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述WC-pol-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述巢氏PCR扩增引物包括WC-nest-F和WC-nest-R；
所述WC-nest-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述WC-nest-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述测序通用引物包括HBX2-3017R、HBX2-3785R和HBX2-4561R；
所述HBX2-3017R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述HBX2-3785R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述HBX2-4561R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
SEQ ID NO.2～4所示的核苷酸序列中的R为A或G。
2.根据权利要求1所述的简并引物组，其特征在于，所述简并引物组能够检测的HIV亚型包括但不限于：A、B、B’、C、CRF01_AE、CRF02_AG、CRF_07BC、CRF_08BC、CRF_BC、CRF_07BC/08BC、CRF01_AE/B、CRF01_AE/07BC和CRF01_AE/B’/C。
3.根据权利要求1或2所述的简并引物组，其特征在于，所述WC-pol-R、WC-nest-F或WC-nest-R中，R为A的特定引物与R为G的特定引物的数量比为1:1。
4.权利要求1～3任意一项所述简并引物组在HIV基因型耐药检测中的应用。
5.一次性HIV基因型耐药检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任意一项所述的简并引物组。
6.利用权利要求1～3任意一项所述简并引物组制备一次性HIV基因型耐药检测所需DNA样品的方法，包括以下步骤：
(1)从待测样品中提取HIV RNA，得到待测RNA；
(2)以所述简并引物组中的逆转录PCR引物对所述待测RNA进行一步法逆转录PCR，得到待测DNA；
(3)以所述待测DNA为模板，利用所述简并引物组中的巢氏PCR引物对进行巢氏PCR扩增，得到待测的DNA样品；
(4)对所述待测的DNA样本，利用所述简并引物组中的测序通用引物、WC-nest-F以及WC-nest-R进行Sanger测序，得到待分析的DNA序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述逆转录PCR的反应条件包括：50℃30min，94℃2min，94℃30s、62℃30s、72℃2min，30个循环，72℃10min。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述逆转录PCR过程中，逆转录PCR引物在反应体系中的浓度为0.4μM。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述巢氏PCR扩增的反应条件包括：94℃3min，94℃30s、58℃30s、72℃1min，30个循环，72℃10min。
10.根据权利要求6或9所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述巢氏PCR扩增过程中，巢氏PCR扩增引物在反应体系中的浓度为0.4μM。
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