CN108300812A - 一种鸽i型副粘病毒的rt-pcr检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种鸽i型副粘病毒的rt-pcr检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸽I型副粘病毒的RT‑PCR检测试剂盒及其检测方法，所述的引物组包括引物S1、S2，其中：S1:5’‑AAGGCTTAGGCTAGCTTACCAT‑3’,S2：5’‑CAAGGTAGCTGAGTCGACCTGTATG‑3’，S3：5’‑ATAAGGGCTGAGTCGACTGAT‑3’。本发明设计特异性引物S1、S2和S3，能够对鸽I型副粘病毒进行特异性扩增。本发明的专用试剂盒具有很强的敏感性，且与病毒分离和IFA等方法相比符合率可达100％，能够广泛用于鸽I型副粘病毒的鉴别诊断。

Description

一种鸽I型副粘病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及兽医生物病毒检测技术领域，具体涉及一种鸽I型副粘病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
鸽I型副粘病毒病是由鸽副黏病毒引起的一种高度接触性、败血性传染病，俗称“鸽瘟”，具有与新城疫病原类似的特性。各种品种、年龄、性别的鸽都易感，发病没有明显的季节性，一年四季都有发生。鸽被I型副黏病毒感染后，潜伏期1-10天，通常1-5天。病鸽表现扭头、曲颈、转圈，有的不能站立,有的翅下垂，有的蹲伏或侧卧。食欲下降，嗉囊空虚，充满液体或气体，倒提口流黏液。拉黄绿色稀便，鸽的羽毛、趾爪常被粪便污染为黄绿色。目前此病无有效的药品。
由于该病的死亡率一般可达20％-80％，对养鸽业危害极大，故建立一种鸽I型副粘病毒的反转录PCR诊断方法和专用试剂盒，能够方便在疫病发生早期快速、准确的诊断疫病，为疫病的防控提供有效的参考。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸽I型副粘病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒能够快速区分鸽I型副粘病毒。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种鸽I型副粘病毒的RT-PCR检测试剂盒，所述的引物组包括引物S1、S2、S3，其中：
S1：5’-AAGGCTTAGGCTAGCTTACCAT-3’；
S2：5’-CAAGGTAGCTGAGTCGACCTGTATG-3’；
S3：5’-ATAAGGGCTGAGTCGACTGAT-3’。
一种所述的引物组在制备用于鸽I型副粘病毒鉴别诊断试剂盒中的应用。
一种所述的引物组的鸽I型副粘病毒鉴别诊断试剂盒。
所述的试剂盒还包括核酸提取试剂、反转录试剂、PCR扩增试剂、和/或琼脂糖凝胶电泳试剂。
所述的反转录试剂包括10×M-MLV缓冲液、dNTP、M-MLV反转录酶、RNase酶抑制剂、S2引物。
所述的PCR扩增试剂包括10×PCR扩增缓冲液、dNTP、S1引物、S2引物、Taq DNA聚合酶和双蒸水。
所述的PCR扩增试剂所构建的PCR扩增体系为：10×PCR扩增缓冲液5.0μL、2.5mmol/L dNTP8.0μL、10mmol/L S1引物1.0μL、10mmol/L S2引物1.0μL、5U/μL Taq DNA聚合酶1.0μL、模板3.0μL，补加双蒸水至50μL。
一种所述的试剂盒的使用方法，包括核酸提取、反转录、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳。
所述的PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
本发明的有益效果：
本发明通过比对鸽I型副粘病毒的差异，设计特异性引物S1、S2、S3，能够对鸽I型副粘病毒进行特异性扩增；在此基础上研制了专用试剂盒，先提取病毒RNA，再使用S2引物反转录合成cDNA，并采用RT-PCR方法鉴别检测鸽I型副粘病毒。与现有技术相比，本发明的专用试剂盒具有很强的敏感性，能够广泛用于临床鸽I型副粘病毒的鉴别诊断。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂所建议的条件与实施步骤。
实施例1、鉴别诊断方法的构建
1、引物设计
设计两条特异性引物，具体如下:
S1：5’-AAGGCTTAGGCTAGCTTACCAT-3’(SEQ ID NO.1)
S2：5’-CAAGGTAGCTGAGTCGACCTGTATG-3’(SEQ ID NO.2)
S3：5’-ATAAGGGCTGAGTCGACTGAT-3’(SEQ ID NO.3)
使用S1、S2和S3进行PCR扩增，疫苗株预期扩增片段大小为836bp，现地分离株预期扩增片段大小为578bp。
2、病毒RNA的提取
取毒株细胞培养液，反复冻融3次后，5000g离心15min，取上清备用。
(1)取0.2ml氯仿，加入等体积的上清，剧烈摇晃15s，室温放置3min，然后12，000g，4℃离心5min。离心后分成3层，最下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，上层是无色的水相，RNA存在于水相中；
(2)将步骤(1)中的上层水相转移到另一只干净的EP管中，加入0.5ml预冷的异丙醇，室温静置10min，然后12,000g，4℃离心10min；
(3)倒掉上清，加入1ml体积分数75％乙醇洗涤RNA沉淀，混匀后，7500g，4℃离心5min；
(4)倒掉上清，室温放置10min，然后加入适量无RNAse水溶解RNA，即得到总RNA。
3、反转录
以步骤2提取的RNA为模板，进行反转录，获得cDNA，反转录反应体系为：
模板RNA 4.9μL
S2引物(10mmol/L) 0.3μL
RTase酶抑制剂(40U/μL) 0.3μL
M-MLV反转录酶(200U/μL) 0.5μL
dNTP(2.5mmol/L) 2.0μL
10×M-MLV缓冲液 2.0μL
反应条件为：42℃保温60min，70℃10min。
4、聚合酶链式反应(PCR)
4.1PCR反应体系
以步骤3获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系为：
dNTP(2.5mmol/L) 8.0μL
10×PCR扩增缓冲液 5μL
S1引物(10mmol/L) 1.0μL
S2引物(10mmol/L) 1.0μL
S3引物(10mmol/L) 1.0μL
cDNA 3.0μL
TaqDNA聚合酶(5U/μL) 1.0μL
ddH2O 至50μL
4.2PCR反应条件优化
对疫苗株的PCR反应条件进行优化，分别以退火温度为54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃进行PCR反应扩增疫苗株，反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。发现在57和62℃可以扩增出836bp大小的片段，与预期大小一致。
对现地分离株的PCR反应条件进行优化，分别以退火温度为52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃进行PCR反应扩增现地分离株，反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。发现在57℃出现578bp大小的片段，与预期大小一致。
综合上述反应，本发明最终将复合PCR的退火温度设置为57℃，优化后的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物置于-20℃保存。
5、电泳
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电泳40min，在DNA凝胶成像系统仪下观察结果。
本发明的专用试剂盒包括上述检测方法中所用的核酸提取试剂、反转录试剂、PCR扩增试剂、琼脂糖凝胶电泳试剂。
实施例2、灵敏度实验
将现地分离株病毒液进行10倍梯度稀释，使病毒浓度为5.4×104-5.4×10- 4copies/μL，并按照实施例1的方法进行检测，结果表明，在第8泳道浓度为5.4×10- 3copies/μL可扩增出预期片段，本发明的引物和检测方法的最低核酸检测量为5.4×10- 3copies/μL，但第9泳道5.4×10-4copies/μL无预期大小的片段，判断其灵敏度为5.4×10- 3copies/μL。
将疫苗株病毒液进行10倍梯度稀释，使病毒浓度为1.5×104-1.0×10-4copies/μL，并按照实施例1的方法进行检测，结果表明，在第8泳道浓度为1.5×10-3copies/μL可扩增出预期片段，本发明的引物和检测方法的最低核酸检测量为1.5×10-3copies/μL，但第9泳道1.5×10-4copies/μL无预期大小的片段，判断其灵敏度为1.5×10-3copies/μL。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 张朝明、严裕舟、张胜辉、李文得
<120> 一种鸽I型副粘病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaggcttagg ctagcttacc at 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caaggtagct gagtcgacct gtatg 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ataagggctg agtcgactga t 21

Claims (9)

1.一种鸽I型副粘病毒的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的引物组包括S1、S2、S3，其中：
S1：5’-AAGGCTTAGGCTAGCTTACCAT-3’；
S2：5’-CAAGGTAGCTGAGTCGACCTGTATG-3’；
S3：5’-ATAAGGGCTGAGTCGACTGAT-3’。
2.一种如权利要求1所述的引物组在制备用于鸽I型副粘病毒鉴别诊断试剂盒中的应用。
3.一种包含如权利要求1所述的引物组的鸽I型副粘病毒鉴别诊断试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括核酸提取试剂、反转录试剂、PCR扩增试剂、和/或琼脂糖凝胶电泳试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的反转录试剂包括10×M-MLV缓冲液、dNTP、M-MLV反转录酶、RNase酶抑制剂、S2引物。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增试剂包括10×PCR扩增缓冲液、dNTP、S1引物、S2引物、Taq DNA聚合酶和双蒸水。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增试剂所构建的PCR扩增体系为：10×PCR扩增缓冲液5.0μL、2.5mmol/L dNTP8.0μL、10mmol/L S1引物1.0μL、10mmol/LS2引物1.0μL、5U/μL Taq DNA聚合酶1.0μL、模板3.0μL，补加双蒸水至50μL。
8.一种如权利要求3-7任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括核酸提取、反转录、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳。
9.根据权利要求8所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
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