CN114107565A - 用于检测apmv-16的引物、诊断试剂以及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测APMV‑16(avian paramyxovirus 16，APMV‑16)的引物、诊断试剂以及试剂盒，基于APMV‑16病毒的高度保守区域设计一对特异性引物序，通过RT‑PCR检测方法可以检测出APMV‑16病毒。实验证明，本发明具有灵敏度高、特异性好、适用度高的优点。

Description

用于检测APMV-16的引物、诊断试剂以及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测APMV-16的引物、诊断试剂以及试剂盒。
背景技术
随着经济水平的提高，人与自然接触逐渐增多，以动物携带的新发病毒的诊断与防控引起人们的关注。禽副黏病毒与禽流感病毒是危害养禽业的两大重要传染病病原，随着分子生物学的发展和研究的不断深入，禽副黏病毒的新血清型报道得越来越多。2017年韩国首次报导了APMV-16(avian paramyxovirus 16，APMV-16)，APMV-16作为一种新发现的病毒引起人们的注意，随后在美国和哈萨克斯坦也发现了这种病毒，但对于其传播特性、毒力一直没有很好的了解，对于禽类的危害尚不清楚，所以对APMV-16的流行动态监测并对其遗传多样性和传播特性研究是预防和控制这种病毒极为重要的。
现行的禽副黏病毒检测方法是交叉血凝抑制实验，但其推荐的病原分离及血清学检测操作难度大、周期长、对操作人员要求较高。诸多文献表明许多禽副黏病毒由于没有血凝性，并不能通过禽副黏病毒交叉血凝抑制实验的方法检测出来，病毒高通量测序获得全基因组序列与禽副黏病毒交叉血凝抑制实验结果不符的情况。聚合酶链式反应(PCR)由于特异性好，操作简单成为一种广泛应用的实验室检测。因此建立一种诊断APMV-16的分子生物学诊断方法成为亟待解决的科学问题，也为国家标准的制定提供理论基础和技术支持。
本发明的目的在于提供一种用于检测APMV-16的RT-PCR方法,该方法针对APMV-16保守序列，可以检测所有APMV-16病毒。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种用于检测APMV-16的引物、诊断试剂以及试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种用于检测APMV-16的引物，上游引物和下游引物的序列如下：
F:5'-CCATAAAGCCTGACTACCTC-3'；
R:5'-AGTAAGCATTGTTAGCGTTC-3'。
上述引物可以应用于制备APMV-16的诊断试剂中。
本发明还提供一种检测APMV-16的RT-PCR检测试剂盒，其上述引物。
进一步地，所述试剂盒包括2×Taq Mix 10μL、20μM的上游引物和下游引物各1μL、cDNA模板2μL和ddH2O 6μL。
本发明的有益效果在于：
1、本发明基于APMV-16病毒高度保守区域设计一对特异性引物序列，实验证明，该引物具有灵敏度高、特异性好、适用度高的优点。
2、利用本发明可以通过PCR产物测序验证是否为APMV-16。RT-PCR较其他检测方法相比具有成本低廉，操作简单等特点，尤其在检测样品过程中，可以通过PCR产物的测序来验证实验结果，大大降低了假阳性样品的发生。
3、利用本发明，APMV-16尿囊液病毒RNA浓度为0.0000002ng/μL的条件下，均可以检测出APMV-16。
附图说明
图1为本发明实施例2中实验一结果示意图。
图2为本发明实施例2中实验二结果示意图。
图3为本发明实施例2中实验三结果示意图。
图4为本发明实施例2中实验四结果示意图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
实施例1
本实施例提供一种用于检测APMV-16的引物的应用实例。
1、主要试剂
2×Taq Mix和ddH2O购自全式金生物技术有限公司；gDNA Eraser、5×gDNAEraser Buffer、Primescript RT Enzyme Mix、5×Primescript Buffer 2和RT PrimerMix均购自TaKaRa技术有限公司。
2、主要仪器
SW-CJ-IBM超净工作台、PTC-200型PCR扩增仪、DYY6D核酸电泳仪和MV2450紫外凝胶成像系统。
3、实现过程
3.1、引物设计
利用MEGA 7.0软件将GenBnak中收录的APMV-16病毒的基因序列进行比对分析，选定保守区域序列，利用Premier 5.0软件针对其保守区域序列设计一对特异性引物，设计的引物序列为：
F:5’-CCATAAAGCCTGACTACCTC-3'(SEQ ID No.1)，
R:5’-AGTAAGCATTGTTAGCGTTC-3'(Seq ID No.2)。
3.2、鸡胚繁毒
采集鸟类的新鲜粪便样品和口咽拭子样品，取100μL接种于9-11日龄鸡胚的尿囊腔，接种后置于37℃恒温培养箱中孵育，无菌收获24h后病死鸡胚的尿囊液，置于-80℃冰箱保存。
3.3、病毒RNA的抽提
3.3.1、取200μL上述尿囊液加入1.5mL无核酸酶管中，依次加入600μL的Trizol LSReagent以及120μL的氯仿，剧烈振荡。
3.3.2、冰浴静置15min，于4℃12000×g离心15min。
3.3.3、上清转管，加入300μL异丙醇，颠倒混匀，冰浴静置10min。
3.3.4、于4℃12000×g离心10min。
3.3.5、弃去上清液，向管内加入600μL的75％乙醇(DEPC处理水配置)，颠倒混匀。
3.3.6、于4℃7500×g离心15min，弃去上清，晾干。
3.3.7、加入20μL DEPC处理水溶解RNA，测定RNA浓度后，放于-80℃保存备用。
3.4、反转录为病毒cDNA
用反转录试剂盒将步骤3.3提取的病毒RNA进行反转录，得到病毒cDNA。
3.4.1、第一步为去除基因组DNA，按照表1依次加入以下组分，混匀后置于42℃2min。
表1
试剂 使用量
gDNA Eraser 1μL
5×gDNA Eraser Buffer 2μL
病毒RNA 1μL
RNase Free dH<sub>2</sub>O 补充至10μL
3.4.2、第二步为反转录反应，反应体系为20μL，按照表2将各组分混匀后，置于37℃15min，85℃5s。加入80μL的RNase Free dH2O定容至100μL，得到病毒cDNA。
表2
Figure BDA0003381374640000051
Figure BDA0003381374640000061
3.4.3、PCR检测
将上述步骤所得的病毒cDNA作为模板，使用实施例1所述引物进行PCR扩增。
扩增体系为:20μM上下游引物各1μL、cDNA模板2μL、2×Taq Mix 10μL和ddH2O 6μL。
PCR扩增程序为:95℃2min，(95℃15s、51℃30s、72℃30s)35个循环，72℃10min，4℃保存；
对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果确定样品中能否扩增出目的条带，如果出现477bp的目的条带，则证明待测样品中含有APMV-16病毒，即检测阳性；否则为检测阴性。。
实施例2
本实施例旨在通过实验验证实施例1所述引物在检测APMV-16上的效果。
实验一、特异性检验
1.主要病毒株
新城疫病毒(NDV,疫苗株)、禽流感病毒(AIV)、禽副黏病毒4型(APMV-4)、禽腺病毒(FAV)禽副黏病毒6型(APMV-6)、禽副黏病毒8型(APMV-8)、禽副黏病毒13型(APMV-13)样品由吉林大学动物传染病实验室保存。
2.以上述各病毒cDNA为模板，用实施例1所述引物按照实施例1的方法进行PCR扩增,其中泳道1为APMV-16阳性样品，泳道2为NDV阳性样品，泳道3为AIV阳性样品，泳道4为APMV-4阳性样品，泳道5为APMV-6阳性样品，泳道6为APMV-8阳性样品，泳道7为APMV-13阳性样品，泳道8为FAV DNA阳性样品。
结果如图1所示,以NDV、AIV、APMV-4、APMV-6、APMV-8、APMV-13、FAV DNA为模板,不能扩增出特异条带,说明利用实施例1所述的引物进行APMV-16检测有很好的特异性。
实验二、敏感性检验
将初始浓度为200ng/μL的APMV-16病毒cDNA进行10倍梯度稀释，泳道1至泳道11的稀释度依次为100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010，各取3μL用实施例1所述的方法进行检验，观察结果。
实验结果如图2显示109倍稀释的APMV-16病毒cDNA模板(即0.0000002ng/μL)仍能显示目的条带。说明利用实施例1所述引物进行APMV-16的检测有很好的敏感性。
实验三、临床样品检测
1.不同来源的APMV-16临床样品来自吉林大学动物传染病实验室保存。
2.以上述APMV-16病毒cDNA为模板，用实施例1所述方法进行检测。
检测结果如图3所示，不同来源的APMV-16临床样品均显示出预期条带，说明实施例1所述的引物具有很高的适用度。
四、混合感染的检测
待测样品依次为APMV-16与APMV-1混合感染样品、APMV-16病毒cDNA，并以ddH2O为阴性对照，按照实施例1进行检测。
结果如图4所示，APMV-16与APMV-1混合感染样品、APMV-16病毒cDNA显示阳性，其余显示阴性，表明该方法能检测到混合感染下的APMV-16。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学
<120> 用于检测APMV-16的引物、诊断试剂以及试剂盒
<130> 123
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccataaagcc tgactacctc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agtaagcatt gttagcgttc 20

Claims (4)

1.一种用于检测APMV-16的引物，其特征在于，上游引物和下游引物的序列如下：
F:5'-CCATAAAGCCTGACTACCTC-3'；
R:5'-AGTAAGCATTGTTAGCGTTC-3'。
2.权利要求1所述的引物在制备APMV-16的诊断试剂中的应用。
3.一种检测APMV-16的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物。
4.根据权利要求3所述的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括2×Taq Mix 10μL、20μM的上游引物和下游引物各1μL、cDNA模板2μL和ddH2O 6μL。
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