CN111500793A - 一种犬细小病毒的检测引物、试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，具体公开一种犬细小病毒的检测引物、试剂盒及其使用方法。所述检测引物的序列为：上游引物CPVF：5′‑TAGACCGTTACTGACATTCGC‑3′；下游引物CPVF：5′‑AATTCGAGTCTCTTTAACGTCTTCT‑3′。本发明提供的PCR检测引物，特异性较强，且灵敏度高，最低检测限可达5.47×10^‑2pg/μL，检测准确率为100％，且扩增序列的片段小，仅为610bp，整个PCR过程可以在2～2.5小时内完成，为犬细小病毒的早期检测和流行病学调查提供了可靠保障。

Description

一种犬细小病毒的检测引物、试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种犬细小病毒的检测引物、试剂盒及其使用方法。

背景技术

犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)属细小病毒科，细小病毒属，单股线状DNA病毒。CPV主要感染犬类，尤其是幼犬，以导致发病率高、传染性强、死亡率高等特点成为犬科动物临床发病的重要致病病毒。不同年龄、性别、品种的犬均可感染。临床表现为呕吐、腹泻(或出血性腹泻)的患病犬中，CPV感染阳性犬可达29.8-46.2％，其中6月龄以下幼犬最为易感，占CPV感染犬总数的比例高达75％，是我国养犬业最为重要的传染病之一。随着我国工作犬(军犬、警犬、导盲犬等)、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅增加，犬细小病毒感染日趋严重，不但影响着家养宠物的生命健康，还危害着我国养犬业、毛皮动物养殖业的发展，成为危害养犬业重大疫病之一。

临床上可根据血常规检测、试纸快速诊断法和发病的主要症状进行初步诊断，但是，这些方法均存在准确性低、特异性差和操作费时等缺陷。聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。随着PCR技术研究和应用的深化，该技术在兽医领域得到广泛应用。目前，用PCR法检测犬细小病毒感染的敏感性和特异性还有待进一步提高，目前市面上急需一种可以准确、更具有特异性、更灵敏地针对犬犬细小病毒进行检测的产品。

发明内容

针对现有检测犬细小病毒的PCR方法存在特异性差、灵敏度低的问题，本发明提供一种犬细小病毒的检测引物、试剂盒及其使用方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种犬细小病毒的检测引物，所述检测引物的序列为：

上游引物CPVF：5′-TAGACCGTTACTGACATTCGC-3′；

下游引物CPVF：5′-AATTCGAGTCTCTTTAACGTCTTCT-3′。

相对于现有技术，本发明提供的PCR检测引物可以特异性结合到犬细小病毒的DNA上，用该检测引物对与患犬细小病毒症状相似的其他病毒(如)的基因组进行PCR扩增检测，该PCR检测引物只能以犬细小病毒的基因组DNA为模板得到扩增产物，其他类似病毒都无法得到扩增产物，这说明本发明提供的检测引物特异性高，且灵敏度高，最低检测限可达5.47×10^-2pg/μL，检测准确率为100％，且扩增序列的片段小，仅为610bp，整个PCR过程可以在1.5～2小时内完成，为犬细小病毒的早期检测和流行病学调查提供了可靠保障。

本发明还提供了一种检测犬细小病毒的试剂盒，包含上述检测引物。

优选的，还包括Tap酶、10×Taq酶反应缓冲液、dNTP和去离子水。

本发明还提供上述试剂盒的使用方法，具体操作为：提取待测病毒的基因组为模板，用所述试剂盒进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

上述试剂盒的使用方法，耗时短、反应结果直观，可用于犬细小病毒的快速检测。

优选的，所述PCR扩增的体系包括以下试剂及用量：Tap酶0.5μL，10×Taq酶反应缓冲液2.5μL，dNTP0.5μL，20μmol/L的上游引物0.5μL，20μmol/L的下游引物0.5μL和模板2.0μL和三蒸水18.5μL。

优选的，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共进行35个循环；72℃延伸3min。

上述优选的反应条件可进一步提高犬细小病毒的检测效率。

优选的，所述待测病毒的基因组的提取采用酚氯仿法或基因组提取试剂盒提取。

附图说明

图1为实施例1中采用PCR法检测犬细小病毒的电泳结果图，其中，1为样品，2为阳性对照，3为阴性对照，M为DL2000 Marker；

图2为实施例2中特异性试验的电泳结果图，其中，1为CPV，2为CPV-2a，3为CPV-2b，4为CPV-2c，5为CDV，6为CIV，7为CCV，8为CPIV，9为CAV，10为DL2000 Marker。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。

实施例1

1.材料与方法

1.1主要试剂与仪器

犬细小病毒阳性血清，96孔反应板，Tap酶，10×Taq酶反应缓冲液，dNTP，引物：浓度为20μml/L，PCR仪，高速台式冷冻离心机，水平电泳仪，凝胶成像系统。

2.试验方法

2.1病料的采集及处理

采集的样品包括犬的泪液、鼻液、唾液、类便。将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000rpm离心15min，收集上清液待检。口腔拭子、拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。阳性对照样品和阴性对照样品的处理方法同上。

2.2DNA抽提

取上清液46μL，加入2μL10wt％十二烷基硫酸钠溶液和1μL的20mg/mL蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2h，加入等量的饱和苯酚溶液500μL，振荡混匀20s，12000rpm离心5min，取上清液，加人等量的苯酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液(体积比25:24:1)，振荡混匀20s，12000rpm离心5min，取上清液，再加入等量的氯甲烷和异戊醇的混合液(体积比24:1)，振荡混匀20s，12000rpm离心5min，取上清液；最后加入两倍体积的无水乙醇，上下顺倒混匀，12000g离心10min，弃上清，室温于燥后，加人50μL双蒸水溶解沉淀，即得DNA模板，-20℃贮存备用。CPV阳性对照样品和阴性对照样品与待检样品同步进行样品处理，并选行DNA抽提。

DNA抽提也可采用市售的商品化DNA抽提试剂盒进行。

2.3引物设计：

参照Genbank中登录的犬细小病毒的MK266802基因序列设计了一对特异性引物，引物序列如下，通过BLAST比对确定其特异性后，由上海生工生物工程有限公司合成。

上游引物CPVF：5′-TAGACCGTTACTGACATTCGC-3′；

下游引物CPVF：5′-AATTCGAGTCTCTTTAACGTCTTCT-3′。

预扩增片段大小为610bp。用双蒸水稀释至浓度为20μml/L，-20℃保存备用。

2.4PCR反应

用PCR扩增试剂盒对引物的扩增特性进行检测，扩增体系如表1所示。反应程序：首先逆转录：50℃、30min，94℃预变性2min，变性：94℃、30s，退火：58℃、30s，延伸：72℃、40s共进行35个循环，最后延伸72℃、3min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到的琼脂糖凝胶电泳图谱如图1所示，阳性对照和样品均在610bp左右各出现了一条片段，表明设计的引物能扩增出单一目的条带。

表1

组分	体积
		Tap酶	0.5μL
10×Taq酶反应缓冲液	2.5μL
		dNTP	0.5μL
上游引物	0.5μL
		下游引物	0.5μL
DNA模板	2μL
		三蒸水	18.5μL
总体积	25μL

实施例2

2.1特异性试验

按照实施例1的方法，分别以犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬流感病毒(CIV)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒2型(CAV)作为样品，以及并对CPV-2a，CPV-2b，CPV-2c进行检测，以灭菌水为阴性对照，得到的琼脂糖凝胶电泳图谱结果如图2所示。

用DNA/RNA提取试剂盒提取CDV、CIV、CCV、CPIV病毒的基因组R NA，并将提取得到的CDV、CIV、CCV、CPIV的基因组RNA进行反转录，得到cDNA，并用反转录得到的CDV、CIV、CCV、CPIV的cDNA和CPV与CAV的基因组DNA作为模板进行PCR扩增检测。PCR扩增检测程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共进行35个循环；72℃延伸3min。

PCR扩增体系：Tap酶0.5μL，10×Taq酶反应缓冲液2.5μL，dNTP0.5μL，20μmol/L的上游引物0.5μL，20μmol/L的下游引物0.5μL和模板2.0μL和三蒸水18.5μL，共25μl PCR扩增体系。

结果表明：采用本发明方法检测，只有CPV能扩增出610bp的目的片段，其他病毒均未扩增出目的条带，且CPV-2a，CPV-2b，CPV-2c也都可以扩增出目的条带，表明该检测方法不与其他病毒发生交叉反应，未出现假阳性，准确率可达到100％，该方法特异性良好。

3.2敏感性测试

抽提CPV病毒的DNA为模板，进行PCR扩增。扩增后产物用NanoDrop核酸蛋白检测仪测得模板浓度，10倍梯度稀释，测定本发明PCR方法的敏感性。反应条件和反应体系同上。

实验结果说明，采用本发明试剂盒检测，CPV的最低检测浓度分别为5.47×10^-2pg/μL，灵敏度高。

3.3重复性

用本发明提供的PCR法对10份阴性样品和阳性样品进行重复检测，每个样品重复检测3次，以验证该方法的重复性。阴性样品和阳性样品均为用胶体金免疫层析试纸确认的样品。结果表明，检测结果均一致，本发明提供的PCR重复性较好。

3.4临床检测

取40份临床疑似CPV感染的犬的粪便样品，加等体积生理盐水研磨匀浆，3000rpm离心15min，收集上清液。用本发明提供的PCR方法检测，阳性样品为25份。采用胶体金免疫层析试纸进行平行检测(检测方法参照说明书即可)，检测结果有21例为阳性。

将胶体金免疫层析试纸检测呈阴性的这4例样品的PCR扩增基因样品送测序公司测试后，结果显示均为CPV。将其他未检出样品的基因用通用引物(维伯鑫生物科技股份有限公司的犬细小病毒(CPV)核酸检测试剂盒(PCR法)，上游引物：5′-TACCATGGTACAGATCCAG-3′和下游引物：5′-CTCCTATATCACCAAAGTTA-3′)扩增后，将扩增序列送测序公司测试后，结果显示均为阴性，说明本发明提供的PCR法检测的准确率为100％。

实验结果说明，本发明试剂盒可用于临床检测，具有较高的准确度。

综上所述，本发明提供的引物和试剂盒可以同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒，且特异性强、灵敏度高、准确度好，且与单一PCR相比，耗时更短，检测快速，有利于尽快采取有效的治疗和防控措施，减少这些疾病对养猪业造成的危害，有利于在临床实践中推广应用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北三狮生物科技有限公司

<120> 一种犬细小病毒的检测引物、试剂盒及其使用方法

<130> 2010

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tagaccgtta ctgacattcg c 21

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aattcgagtc tctttaacgt cttct 25

<210> 3

<211> 610

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagaccgtta ctgacattcg cttcttgtct ttgacagagt gaacctctct tactctgact 60

aaccaaccat gtctggcaac cagtatactg aggaagttat ggagggagta aattggttaa 120

agaaacatgc agaaaatgaa gcattttcgt ttgtttttaa atgtgacaac gtccaactaa 180

atggaaagga tgttcgctgg aacaactata ccaaaccaat tcaaaatgaa gaactaacat 240

ctttaattag aggagcacaa acagcaatgg atcaaaccga agaagaagaa atggactggg 300

aatcggaagt tgatagtctc gccaaaaagc aagtacaaac ttttgatgca ttaattaaaa 360

aatgtctttt tgaagtcttt gtttctaaaa atatagaacc aaatgaatgt gtttggttta 420

ttcaacatga atggggaaaa gatcaaggct ggcattgtca tgttttactt catagtaaga 480

acttacaaca agcaactggt aaatggctac gcagacaaat gaatatgtat tggagtagat 540

ggttggtgac tctttgttcg gtaaacttaa caccaactga aaagattaag ctcagagaaa 600

ttgcagaaga 610

Claims (7)

1.一种犬细小病毒的检测引物，其特征在于，所述检测引物的序列为：

上游引物CPVF：5′-TAGACCGTTACTGACATTCGC-3′；

下游引物CPVF：5′-AATTCGAGTCTCTTTAACGTCTTCT-3′。

2.一种检测犬细小病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的检测引物。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括Tap酶、10×Taq酶反应缓冲液、dNTP和去离子水。

4.权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，具体操作为：提取待测病毒的基因组DNA为模板，用所述试剂盒进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

5.如权利要求4所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述PCR扩增的体系包括以下试剂及用量：Tap酶0.5μL，10×Taq酶反应缓冲液2.5μL，dNTP0.5μL，20μmol/L的上游引物0.5μL，20μmol/L的下游引物0.5μL和模板2.0μL和三蒸水18.5μL。

6.如权利要求4所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共进行35个循环；72℃延伸3min。

7.如权利要求4所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述待测病毒的基因组DNA的提取采用酚氯仿法或基因组提取试剂盒提取。

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