RU2808816C1 - Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту гена Pertactin Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica для детекции возбудителей бордетеллёза у животных - Google Patents
Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту гена Pertactin Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica для детекции возбудителей бордетеллёза у животных Download PDFInfo
- Publication number
- RU2808816C1 RU2808816C1 RU2022132323A RU2022132323A RU2808816C1 RU 2808816 C1 RU2808816 C1 RU 2808816C1 RU 2022132323 A RU2022132323 A RU 2022132323A RU 2022132323 A RU2022132323 A RU 2022132323A RU 2808816 C1 RU2808816 C1 RU 2808816C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bordetella
- pertactin
- fluorescently labeled
- primers
- bordetella bronchiseptica
- Prior art date
Links
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 title claims abstract description 35
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 title claims abstract description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 108010021711 pertactin Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 208000029754 bordetellosis Diseases 0.000 title claims abstract description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title claims abstract description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 15
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 7
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 abstract description 18
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 abstract description 18
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 abstract description 12
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 abstract description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 abstract description 6
- 241000282887 Suidae Species 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 101100519553 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) prn gene Proteins 0.000 description 13
- 101150006855 PRN gene Proteins 0.000 description 13
- 108050009456 Pertactin autotransporters Proteins 0.000 description 13
- 101100137577 Rattus norvegicus Prnp gene Proteins 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000714201 Feline calicivirus Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 208000011479 upper respiratory tract disease Diseases 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 201000004813 Bronchopneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241001647374 Chlamydia felis Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 206010025280 Lymphocytosis Diseases 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 239000013616 RNA primer Substances 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010053459 Secretion discharge Diseases 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010044314 Tracheobronchitis Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 210000000254 ciliated cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 208000027993 eye symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 208000019017 loss of appetite Diseases 0.000 description 1
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 208000010753 nasal discharge Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012932 thermodynamic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Описан набор высокоспецифических праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для выявления генетического материала ДНК-фрагмента гена Pertactin Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica для детекции возбудителей бордетеллеза у кошек, собак, свиней, кроликов. Набор содержит: прямой праймер 5'→3'
VT-Bd-F 5'-GGAACAACCAGTCCATSATCAAG-3', обратный 5'→3'
VT-Bd-R 5'-CTGTCCCGAAGACGTGAC-3', флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Probe) 5'→3'
VT-Bd-P 5'-(R6G)-GGAACGACCATCAAGGTAAGCGG-(BHQ2)-3'. Изобретение позволяет идентифицировать в реальном времени ДНК-фрагмент гена Pertactin Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica. Набор обладает более высокой гомологией к штаммам и аллельным вариантам Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, что повышает достоверность и надежность анализов. 3 ил., 3 табл.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора высокоспецифических праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для выявления генетического материала ДНК-фрагмента гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica для детекции возбудителей бордетеллеза у кошек, собак, свиней, кроликов. Представленный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда содержит пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также один флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Представленное изобретение позволяет проводить более достоверное и надежное выявление генетического материала ДНК-фрагмента гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica для детекции возбудителей бордетеллеза у кошек, собак, свиней, кроликов и может быть использовано в ветеринарии. Способ позволяет детектировать фрагмент консервативной области гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, что позволяет выявлять животных, инфицированных Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica на любых стадиях заболевания.
Изобретение относится к наборам праймеров для выявления генетического материала ДНК-фрагмента гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, в клинических образцах, секционных пробах, культуральных жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач свойств Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, и может быть использовано в ветеринарии.
Бордетеллез - инфекционное заболевание собак, кошек, свиней, проявляющееся воспалением трахеи, бронхов и легких. Основным клиническим синдромом является нарушение дыхания: кашлем, одышкой, повышением температуры. Часто наблюдается сочетанное протекание с другими инфекциями. Входит в группу инфекций, называемых «питомниковым кашлем» или инфекционным трахеобронхитом. У кошек Bordetella bronchiseptica, наряду с кошачьим калицивирусом (FCV) и герпесвирусом (FHV), Chlamydophila felis, входит в число возбудителей заболеваний верхних дыхательных путей (URTD).
Bordetella bronchiseptica и Bordetella parapertussis являются распространенной причиной возникновения респираторных заболеваний у домашних животных (кошек, собак, кроликов, свиней).
Bordetella bronchiseptica наиболее часто поражает бездомных кошек, а также животных, содержащихся в питомнике и свободно выходящих на улицу.
К бордетеллезу восприимчивы животные всех возрастов, но наибольшая заболеваемость отмечается среди молодняка, собак и кошек до года.
Источником заражения являются заболевшие и выздоравливающие животные, а также бессимптомные носители бактерии, которые, не проявляя заболевание, клинически выделяют возбудителя из дыхательных путей. Кошки с клиническими проявлениями FHV-1 или калицивиpусной инфекции (FCV) выделяют Bordetella bronchiseptica более длительный период времени, чем моноинфицированные Bordetella bronchiseptica животные.
Попав в респираторный тракт, Bordetella bronchiseptica прикрепляется к реснитчатым клеткам с помощью фимбрий - нитевидных выростов на поверхности бактерии. Прикрепившись, Bordetella bronchiseptica в процессе своей жизнедеятельности вырабатывает токсины, которые нарушают местные защитные механизмы, подавляющие активность ресничек мерцательного эпителия респираторного тракта и фагоцитоз, что в свою очередь вызывает повреждение тканей и облегчает всасывание токсинов в эпителиальные клетки.
Токсин, вырабатываемый Bordetella bronchiseptica и Bordetella parapertussis, подобно многим бактериальным экзотоксинам с ферментативной активностью, содержит две субъединицы - A и В. Субъединица-В, связываясь с рецепторами клеток-мишеней, обеспечивает доставку к ним субъединицы-A. Токсины обладают биологической активностью, в частности, стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов, лимфоцитоз, увеличение выработки простогландинов, сенсибилизацию, усиление ряда функций иммунной системы, к примеру, функции образования IgG- и IgE-антител.
После инфицирования в организме животного происходит быстрый рост числа антител к B Bordetella bronchiseptica и Bordetella parapertussis, однако продолжительность их жизни не изучена.
Болезнь может протекать в острой, подострой и хронической формах. Инкубационный период составляет от 5 - до 20 дней. Вначале отмечают снижение аппетита, вялость , чихание и выделение слизи из носа. Потом появляется кашель, усиливающийся при вставании, движении. Температура тела повышается до 40-41°С, больные животные угнетены, отказываются от корма, неохотно поднимаются и подолгу лежат. Часто симптомы бордетеллеза у взрослых у кошек являются невыраженными, при этом котята страдают более серьезно, чем может показаться, и в некоторых случаях болезнь может быстро прогрессировать до бронхопневмонии и привести к смерти. Бордетеллез может сопровождаться продуктивным кашлем с выделением мокроты.
При хроническом течении у животных отмечается ринит и конъюнктивит с выделениями из глаз и носа. У кошек и собаки набор симптомы бордетеллеза обычно включает: кашель (чаще у кошек, реже у собак), чихание, выделения из носа, глазные симптомы, лихорадка, потеря аппетита, увеличение подчелюстных лимфатических узлов.
Тяжелее заболевание протекает у котят и щенков до 12-недельного возраста.
Основными методами выявления возбудителя являются бактериологический метод и ПЦР. Образцы для диагностики получают путем ротоглоточного мазка или трансназальных/бронхоальвеолярных смывов.
ПЦР. Полимеразная цепная реакция является наиболее перспективным методом диагностики бордетеллеза. Чувствительность метода довольно высока и позволяет обнаружить даже несколько бактерий во взятых образцах образце, а специфичность метода близка к 100 %.
Серологическая диагностика. Этот диагностический метод основан на определении уровня специфических антител к определенным антигенам, но в диагностике бордетеллеза имеет ограниченное значение, т. к. серопозитивными являются практически 100 % популяции животных.
Уровень техники
При разработке набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для диагностики ДНК-фрагмента гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, был проведен сравнительный анализ структуры нуклеотидных последовательностей гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, размещенных на web-ресурсе NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/, и затем проведено конструирование праймеров и флуоресцентно-меченого зонда методом компьютерного моделирования с применением компьютерных программ Beacon Designer v. 8.14 PREMIER Biosoft International (San Francisco, CA 94131-2175, США) и Vector NTI 11 (Invitrogen, США). Выравнивание геномных последовательностей осуществлялось методом Clustal W, филогенетический анализ выполняли методом невзвешенного попарного среднего - UPGMA. Проверку качества и термодинамический анализ выбранных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда выполняли с помощью программы OLIGO DNA/RNA primer analysis software, v.5.0 и BLAST https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (США).
Амплифицируемый участок кДНК, являясь маркерным, позволяет выявить вирусный агент в исследуемом образце. Для эффективного проведения ПЦР в режиме реального времени необходимы флуоресцентно-меченый ДНК-зонд и ДНК-затравки - праймеры (синтетические олигонуклеотиды) - строго специфичные к кДНК вирусного генома. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. Праймеры должны быть комплементарны нуклеотидным последовательностям ДНК, ограничивая амплифицируемый участок справа и слева таким образом, чтобы синтез ДНК ДНК-полимеразой проходил строго в выбранном регионе. Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, в свою очередь, должен лежать внутри участка ДНК, ограниченного праймерами. Правильный выбор праймеров позволяет осуществить экспоненциальное увеличение количества копий целевого участка ДНК. Правильный выбор сочетания пары праймеров и ДНК-зонда позволяет осуществлять детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени. В целом от правильности выбора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и зондов зависит специфичность проводимой ОТ-ПЦР, а значит, и достоверность исследования.
При компьютерном дизайне праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда главными критериями были: абсолютная степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков в структуре праймеров и комплементарности их друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); максимальная близость значений температуры отжига праймеров.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, позволяющего идентифицировать в реальном времени ДНК-фрагмента гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica и обладающего более высокой гомологией к циркулирующим в настоящее время штаммам и аллельным вариантам Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, что повышает достоверность и надежность анализов.
Указанный технический результат достигается разработкой набора высокоспецифических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для ДНК-детекции фрагмента гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, содержащего пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Указанные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:
Последовательности олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica.
Прямой праймер (Forward primer) 5'→3'
VT-Bd-F 5'-GGAACAACCAGTCCATSATCAAG-3'
Обратный (Reverse primer) 5'→3'
VT-Bd-R 5'-CTGTCCCGAAGACGTGAC-3'
Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Probe) 5'→3'
VT-Bd-P 5'- (R6G)-GGAACGACCATCAAGGTAAGCGG-(BHQ2) -3'
| Таблица 1. Характеристика разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда | |||
| Показатель | VT-Bd-F | VT-Bd-R | Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-Bd-P |
| Структура от 5’ к 3’ | GGAACAACCAGTCCATSATCAAG | CTGTCCCGAAGACGTGAC | (R6G)- GGAACGACCATCAAGGTAAGCGG-(BHQ2) |
| Длина, нуклеотиды | 23 | 18 | 23 |
| Т отжига с учетом Т плавления, °C | 60 | 60 | 67 |
| GC состав, % | 48 | 61 | 57 |
| Т работы фермента, °C | 68,7 | 68,5 | 76,6 |
Дизайн предлагаемых к патентованию праймеров и зонда включает все данные международной базы GenBank о нуклеотидных последовательностях гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica по состоянию на май 2022 года. Используемые в работе праймеры и зонд обладают большей гомологией к циркулирующим в настоящее время штаммам и аллельным вариантам Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, что в свою очередь повышает чувствительность заявляемого набора диагностических праймеров и зонда. Мишенью для используемых в работе праймеров и зонда является высококонсервативная область гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica.
Представляемые к патентованию олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд позволяют выявить в образце фрагмент ДНК-гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica в режиме реального времени, а также амплифицировать фрагмент ДНК, что дает возможность секвенировать полученный ампликон, с которым можно проводить молекулярно-биологические работы, а следовательно, и более глубокое изучение свойств Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica. Помимо этого, использование в качестве положительного контроля плазмидной конструкции несущей специфическую вставку (как описано ниже) позволяет разработать количественную ПЦР, что в свою очередь дает возможность оценить вирусную нагрузку в исследуемом образце.
Апробация праймеров была осуществлена с использованием биотехнологической конструкции, в основе которой лежит плазмида со вставкой специфического ДНК-фрагмента. Экспериментально было показано, что выбранные праймеры и ДНК-зонд обеспечивают надежный синтез целевых ДНК-фрагментов. Специфичность амплификации дополнительно подтверждали секвенированием.
Положительные контрольные образцы были получены методом ТОРО-Т/А клонирования вирусспецифических ДНК-дуплексов в плазмиду PC DNA 3.1 (Invitrogen, США). После чего компетентные клетки E. coli линии TOP 10 (Invitrogen, США) были трансформированы полученной плазмидой, несущей типоспецифический фрагмент гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica.
Важно отметить, что оптимизация условий проведения ПЦР осуществлялась с использованием наборов коммерчески доступных реагентов, приборов и ферментов, предназначенных для массового использования в лабораторной практике, что позволяет быстрое и надежное применение данного изобретения в медицинских и научно-исследовательских лабораториях.
Анализ эффективности проведенной трансформации осуществляли проведением ПЦР в режиме реального времени в соответствии с протоколом, описанным ниже, где в реакционную смесь в качестве положительного образца добавляли 1×ТЕ-буфер, содержащий рекомбинантные плазмиды, со встройкой вирусспецифического синтезированного ДНК-дуплекса. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли 1×ТЕ-буфер.
Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, температуре отжига праймеров.
Состав реакционной смеси моделировали таким образом, чтобы концентрация ионов MgCl2 обеспечивала оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы Mut-3, концентрация дНТФ не превышала 0,4 мМ, концентрация праймеров была 10 пмоль/мкл, флуоресцентно-меченого ДНК-зонда 5 пмоль/мкл, а объем пробы составлял 5 мкл (для повышения специфичности реакции).
| Таблица 2. ПЦР-смесь для проведения реакции (из расчета на одну пробирку): | |
| Компонент | Объем на 1 реакцию (20 мкл), мкл |
| ПЦР-буфер ×10 | 2,5 |
| дНТФ (25 мМ) | 0,2 |
| MgCl2 (50 мМ) | 1 |
| Полимераза Taq-pol Mut-3 (5 ед./мкл) | 0.5 |
| Прямой праймер - VT-Bd-F (10 пмоль/мкл) | 1 |
| Обратный праймер - VT-Bd-R (10 пмоль/мкл) | 1 |
| Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-Bd-P (5 пмоль/мкл) | 1 |
| Образец (проба с ДНК) | 5 |
| diH2O(бидистиллированная) | 6 |
| Таблица 3. Температурно-временной режим проведения ПЦР | ||||
| Этап | Т, °С | Время, сек. | Количество повторов | |
| Амплификатор планшетного типа | Амплификатор роторного типа | |||
| Начальная денатурация | 95 | 300 | 300 | 1 |
| Денатурация | 95 | 10 | 10 | 45 циклов с флуоресцентной детекцией |
| Отжиг | 58 | 25 измерение | 25 измерение | |
| Элонгация | 72 | 25 | 40 | |
| Хранение | 4 | ∞ | ∞ | |
Отработку условий ПЦР с использованием разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда осуществляли на амплификаторах планшетного типа «ДТ-96», «ДТ-Прайм», «ДТ-Лайт» («ДНК-Технология», Россия) и роторного типа «Rotor Gene Q» (QIAGEN, ФРГ).
Для определения чувствительности способа выделенные пробы ДНК (мазки и смывы) подвергали десятикратным разведениям от 10-1 до 10-5. Полученные разведения исследовали методом ПЦР с применением разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда.
Специфичность разработанного способа проверяли на образцах Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, а также на образцах биологического материала, полученных от интактных и серонегативных животных в отношении Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica. а также с помощью метода секвенирования по Сэнгеру на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3500 (США) фиг.1, фиг.2, фиг.3 в приложении «Схема».
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Последовательности специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и
флуоресцентного зонда к фрагменту гена Pertactin бактерий Bordetella
parapertussis и Bordetella bronchiseptica для детекции возбудителей
бордетеллёза у животных.
Прямой праймер (Forward primer) 5'→3'
VT-Bd-F 5'-GGAACAACCAGTCCATSATCAAG-3'
Обратный (Reverse primer) 5'→3'
VT-Bd-R 5'-CTGTCCCGAAGACGTGAC-3'
Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Probe) 5'→3'
VT-Bd-P 5'-(R6G)-GGAACGACCATCAAGGTAAGCGG-(BHQ2)-3'
<---
Claims (6)
- Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров
- VT-Bd-F 5'-GGAACAACCAGTCCATSATCAAG-3',
- VT-Bd-R 5'-CTGTCCCGAAGACGTGAC-3',
- и флуоресцентно-меченого зонда
- VT-Bd-P 5'-(R6G)-GGAACGACCATCAAGGTAAGCGG-(BHQ2)-3',
- к фрагменту гена Pertactin бактерий Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica для детекции возбудителей бордетеллёза у животных.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2808816C1 true RU2808816C1 (ru) | 2023-12-05 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3319622A1 (en) * | 2015-12-22 | 2018-05-16 | CureVac AG | Method for producing rna molecule compositions |
| RU2702240C1 (ru) * | 2018-10-12 | 2019-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ и набор для генодиагностики коклюша и коклюшеподобных заболеваний |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3319622A1 (en) * | 2015-12-22 | 2018-05-16 | CureVac AG | Method for producing rna molecule compositions |
| RU2702240C1 (ru) * | 2018-10-12 | 2019-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ и набор для генодиагностики коклюша и коклюшеподобных заболеваний |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ПРАДЕД М.Н. и др. ПЦР-диагностика инфекций, вызванных b. pertussis, b. parapertussis и b. Bronchiseptica, Клиническая лабораторная диагностика, No 1, 2013, с. 53-56. ВАСИЛЬЕВ Д.А. и др. Бордетеллез животных: характеристика заболевания и возбудителя, разработка методов диагностики, Ульяновск, 2014, с. 160-166. AUDREY J. KING et al. Comparative genomic profiling of Dutch clinical Bordetella pertussis;isolates using DNA microarrays: Identification of genes absent from;epidemic strains, BMC Genomics 2008, 9:311, doi:10.1186/1471-2164-9-311. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Oura et al. | Virological diagnosis of African swine fever—comparative study of available tests | |
| Awad et al. | Epidemiology and diagnosis of feline panleukopenia virus in Egypt: Clinical and molecular diagnosis in cats | |
| Dowgier et al. | A molecular survey for selected viral enteropathogens revealed a limited role of Canine circovirus in the development of canine acute gastroenteritis | |
| Corsaro et al. | Pathogenic potential of novel Chlamydiae and diagnostic approaches to infections due to these obligate intracellular bacteria | |
| Jóźwik et al. | Comparison of the immunofluorescence assay with RT-PCR and nested PCR in the diagnosis of canine distemper | |
| Bertasio et al. | Porcine epidemic diarrhea virus shedding and antibody response in swine farms: A longitudinal study | |
| Berri et al. | PCR-based detection of Coxiella burnetii from clinical samples | |
| Dall Agnol et al. | Severe outbreak of bovine neonatal diarrhea in a dairy calf rearing unit with multifactorial etiology | |
| Beni et al. | Genotyping of the prevalent Chlamydia trachomatis strains involved in cervical infections in women in Ahvaz, Iran | |
| ES2335179B1 (es) | Metodo para la deteccion simultanea de histoplasma capsulatum y paracoccidioides brasiliensis. | |
| Kwit et al. | Molecular methods in detection and epidemiologic studies of rabbit and hare viruses: A review | |
| Aref et al. | Canine Trypanosoma evansi infection in Afghanistan | |
| RU2808816C1 (ru) | Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту гена Pertactin Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica для детекции возбудителей бордетеллёза у животных | |
| Qi et al. | Development and application of a TaqMan-based real-time PCR method for the detection of the ASFV MGF505-7R gene | |
| RU2761496C2 (ru) | Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени | |
| Agnihotri et al. | Molecular detection based epidemiology of canine parvovirus and canine coronavirus infection in diarrheic dogs in Haryana | |
| Angen et al. | Development of a species-specific real-time PCR test for Chlamydia psittaci and its employment in the investigation of zoonotic transmission from racing pigeons in Denmark | |
| CN110724763A (zh) | 人腺病毒和博卡病毒荧光定量pcr检测方法及其应用 | |
| CN111500793A (zh) | 一种犬细小病毒的检测引物、试剂盒及其使用方法 | |
| KR102346881B1 (ko) | 코로나 바이러스 및 인플루엔자 바이러스 동시 진단용 키트 | |
| RU2802065C1 (ru) | Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту гена ORF1 (Non structural Protein 1) РНК (кДНК) калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV) для детекции калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV). | |
| CN115820927A (zh) | 一种猴痘病毒荧光pcr检测试剂盒及其引物探针组合 | |
| RU2802937C1 (ru) | Набор праймеров и флуоресцентного зонда для выявления генетического материала (ДНК) фрагмента гена 16S рибосомальной РНК к фрагменту гена 16S рибосомальной РНК Bartonella Henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella koehlerae для детекции патогенных бартонелл кошек | |
| RU2803069C1 (ru) | Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) для детекции Чумы плотоядных (болезнь Карре, чумка) у собак - ПЦР тест-система в режиме реального времени | |
| Lis et al. | Novel locked nucleic acid (LNA)-based probe for the rapid identification of Chlamydia suis using real-time PCR |