ES2335179B1 - Metodo para la deteccion simultanea de histoplasma capsulatum y paracoccidioides brasiliensis. - Google Patents
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Abstract
Método para la detección simultánea de
Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides
brasiliensis.
La presente invención se refiere a un método de
detección simultánea de ADN de Histoplasma capsulatum y
Paracoccidioides brasiliensis mediante la técnica de PCR
multiplex cuantitativa en tiempo real, basada en sondas específicas
marcadas con dos fluoróforos diferentes. Esta técnica es aplicable
tanto en muestras biológicas como en cultivos microbiológicos y
muestras ambientales. Además, otro aspecto de la invención es un kit
que permite detectar los dos microorganismos de forma
simultánea.
Description
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Método para la detección simultánea de
Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides
brasiliensis.
La presente invención se refiere a un método de
detección simultánea de ADN de Histoplasma capsulatum y
Paracoccidioides brasiliensis mediante la técnica de PCR
multiplex cuantitativa en tiempo real, basada en sondas específicas
marcadas con dos fluoróforos diferentes. Esta técnica es aplicable
tanto en muestras biológicas como en cultivos microbiológicos y
muestras ambientales. Además, otro aspecto de la invención es que
se ha desarrollado un kit que permite detectar los dos
microorganismos de forma simultánea.
Los microorganismos Histoplasma
capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis son los
causantes de las enfermedades conocidas como histoplasmosis y
paracoccidioidomicosis. Estas enfermedades son micosis primarias de
aparición frecuente en determinadas zonas geográficas especialmente
en áreas tropicales y subtropicales de clima templado y húmedo. En
estas zonas endémicas, la aparición del SIDA ha agravado el
problema de las micosis primarias hasta convertirlo en una de las
patologías más frecuentes. La prevalencia de estas enfermedades
está aumentando en España debido a infecciones importadas en
viajeros o emigrantes procedentes de zonas endémicas, especialmente
de la población procedente de Latinoamérica. Según el Instituto
Nacional de Estadística (www.ine.es), un 35% de la población
emigrante que reside en España
\hbox{procede de zonas endémicas
y, además, un millón de españoles viaja cada año a estos
países.}
En zonas endémicas, la histoplasmosis es una de
las infecciones oportunistas más frecuentes en pacientes con SIDA.
Por tanto, la histoplasmosis debe ser incluida en el diagnóstico
diferencial de pacientes sudamericanos con SIDA, con signos de
infección sistémica y afectación del sistema
mononuclear-fagocítico. En el caso de la
histoplasmosis del viajero o del turista, la enfermedad se
manifiesta como una infección respiratoria que puede variar en
cuanto a su sintomatología, desde un cuadro catarral a una infección
grave que pone en peligro la vida del enfermo.
Respecto a la paracoccidioidomicosis, es la
micosis sistémica más frecuente de América Tropical y, aunque en
Europa es poco frecuente, se han descrito varios casos en los
últimos años asociados a población procedente de regiones
endémicas. Generalmente estos pacientes presentan la forma crónica
de la enfermedad que puede ser unifocal afectando al pulmón o
multifocal representada por una serie de lesiones cutáneas o
mucosas y con afectación del pulmón. Es frecuente, además, que
hayan transcurrido varios años desde que se adquiere la enfermedad
hasta que se desarrollan los síntomas. La paracoccidioidomicosis
también debe ser incluida en el diagnóstico diferencial en
pacientes procedentes de Latinoamérica con una infección
respiratoria, aparezcan o no lesiones cutáneas.
El diagnóstico de ambas micosis es complicado
por lo que, hasta la fecha, el diagnostico de certeza se ha basado
en el cultivo del microorganismo y posterior identificación
mediante técnicas microscópicas o de detección de exoantígenos. No
obstante, el cultivo puede tardar 1 ó 2 semanas en ser positivo y
la identificación puede resultar compleja en centros sin
experiencia. La visión de estructuras fúngicas puede ayudar a
iniciar el tratamiento, pero no confirma el diagnóstico. Las
pruebas serológicas también pueden ayudar al diagnóstico, pero
tienen una especificidad limitada en zonas endémicas y una
sensibilidad baja en enfermos inmunodeprimidos. Por otra parte, en
el caso de la histoplasmosis, existe una técnica de detección de
antígeno en orina, que tiene una gran fiabilidad, incluso en
enfermos inmunodeprimidos. Pero, hasta la fecha, esta técnica no se
ha comercializado y sólo está disponible en centros de referencia
de los EE.UU.
Ante esta situación, el Servicio de Micología
del Centro Nacional de Microbiología ha desarrollado el
procedimiento descrito en esta invención para detectar
simultáneamente ambos patógenos fúngicos ya que la clínica es
similar en ambos y la población susceptible de ser afectada por
dichos patógenos es la misma.
El método descrito en la presente invención
provee de una herramienta que soluciona algunos de los problemas
presentados por otros métodos, ya que se reduce de manera
significativa el tiempo empleado por los métodos diagnósticos
convencionales (se reduce de 1-2 semanas a
1-2 días) y sirve para detectar simultáneamente
ambos microorganismos Histoplasma capsulatum y
Paracoccidioides brasiliensis. Asimismo, la rapidez en la
detección permitirá adelantar el inicio del tratamiento de la
histoplasmosis y/o de la paracoccidioidomicosis, mejorando el
pronóstico de los enfermos y permitirá realizar el seguimiento de
la respuesta al tratamiento.
En la presente invención se describe un método
de detección simultánea de ADN de Histoplasma capsulatum y
Paracoccidioides brasiliensis mediante la técnica de PCR
multiplex cuantitativa en tiempo real, basada en sondas específicas
del tipo molecular beacon (faro molecular) marcadas con dos
fluoróforos diferentes.
Los molecular beacons son sondas que
tienen una forma de horquilla o de bucle, incorporando un
fluoróforo emisor y un quencher, que inhibe la emisión de
fluorescencia mientras que la sonda no hibride. Cuando la sonda se
une al ADN, se forma una doble hélice rígida, por lo que la sonda
pierde su forma de horquilla, separándose el emisor del
quencher, lo que origina la fluorescencia detectable. Los
moleculars beacons constan de 10-30 pares de
bases, permiten la detección de cambios de una sola base y son
sondas especialmente indicadas para usar en ensayos de PCR
multiplex ya que pueden marcarse con diferentes fluoróforos y
poseen unas propiedades termodinámicas que favorecen una alta
especificidad.
El método descrito en la presente invención
presenta una serie de ventajas respecto de las técnicas
convencionales:
- 1.
- Fiabilidad y sencillez para identificar Histoplasma y Paracoccidioides en cultivo.
- 2.
- En muestras biológicas, la técnica muestra una sensibilidad superior a la de las pruebas serológicas.
- 3.
- En lo que se refiere a muestras relacionadas con el aparato respiratorio, tiene una sensibilidad comparable a la de la identificación por cultivo.
- 4.
- Las técnicas de PCR tienen una especificidad del 100%, ya que no amplifican ADN de otras especies fúngicas.
- 5.
- Su utilización en muestras biológicas permite reducir el tiempo de diagnóstico de los 10-14 días en la identificación por cultivo, a 24-48 horas.
- 6.
- La técnica de PCR aplicada a muestras biológicas puede realizarse en instalaciones con niveles de bioseguridad convencionales (nivel 2).
En cuanto a las características innovadoras,
pueden destacarse:
- 1.
- La posibilidad de detectar simultáneamente ambos patógenos.
- 2.
- Su elevada especificidad, que evita pasos secundarios como la secuenciación del producto o la visualización de bandas de ADN marcadas.
- 3.
- La reducción significativa del tiempo empleado en la detección de de ambos patógenos.
En este sentido, un primer aspecto de la
presente invención es un método para la detección simultánea de
Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides
brasiliensis que comprende:
- a.
- obtener una muestra y aislar su ADN,
- b.
- amplificar un fragmento de la región ITS del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum y/o Paracoccidioides brasiliensis contenido en el ADN aislado en el paso (a),
- c.
- determinar la desviación del paso (b) con respecto a los controles. Estos controles pueden ser controles positivos y/o controles negativos,
- d.
- analizar la desviación del paso (c) y atribuir la misma a la presencia de los citados microorganismos.
Por el término "detección simultánea" se
entiende la capacidad de este método de detectar a la vez la
presencia de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides
brasiliensis en una muestra y con una única reacción de PCR en
tiempo real.
El aislamiento de la muestra de ADN se realiza
mediante métodos conocidos que permiten obtener el ADN total de la
muestra. De este modo, si la muestra contiene Histoplasma
capsulatum y/o Paracoccidioides brasiliensis, su ADN
será extraído y los fragmentos de interés de la región ITS serán
amplificados como consecuencia de la alta especificidad del
método.
Las regiones conocidas como ITS (Internal
Transcribed Spacer) son secuencias de ADN ribosómico no
funcional situadas entre secuencias que codifican para las
subunidades de ARN ribosómico 18S y 5.8S (ITS1) y entre las
subunidades 5.8S y 28S (ITS2). Los ITS presentan un alto grado de
variación entre especies cercanas filogenéticamente, lo que permite
usarlos de manera específica para determinar la especie así como
variaciones dentro de ésta.
El término "control negativo" hace
referencia a la muestra procedente de personas no infectadas con
Histoplasma capsulatum y/o con Paracoccidioides
brasiliensis, así como a los controles internos sin ADN que se
utilizan en las reacciones de PCR para descartar contaminaciones en
la manipulación de las muestras. El término "control positivo"
hace referencia a muestras que contienen ADN de los microorganismos
citados con total seguridad.
Una realización preferida del método descrito
anteriormente es aquella en la que, para llevar a cabo la
amplificación, la concentración de ADN es de al menos 10 fg/\mul
ya que ésta es cantidad que representa el límite de detección de
los fragmentos de ADN de Histoplasma capsulatum y
Paracoccidioides brasiliensis.
En otra realización preferida del método, la
muestra puede escogerse de entre una muestra biológica, un cultivo
microbiológico o una muestra ambiental.
El término "muestra biológica" hace
referencia a una muestra aislada de materiales de origen biológico
que pueden ser tanto de origen humano como animal o vegetal. La
principal aplicación de este método va dirigida a muestras de
origen humano pero el método de la presente invención puede
aplicarse para detectar estos microorganismos causantes de
histoplasmosis y paracoccidioidomicosis en otros seres vivos que
puedan comportarse como vehículos de transmisión de los
microorganismos citados. La muestra biológica puede seleccionarse
de la lista que comprende muestra respiratoria, aspirados de médula
ósea, líquido cefalorraquídeo, biopsia tisular, orina o fluido
sanguíneo. Se entiende por fluido sanguíneo; sangre, suero o
plasma.
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La muestra denominada como "cultivo
microbiológico" se refiere a cualquier tipo de cultivo de
microorganismos realizado en medios de crecimiento tanto líquidos,
sólidos como aquellos que permitan el crecimiento de los
microorganismos.
El término "muestra ambiental" hace
referencia a cualquier otro tipo de muestra procedente de cualquier
medio susceptible de poder contener Histoplasma capsulatum y
Paracoccidioides brasiliensis. Es decir, este último tipo de
muestras se refieren a muestras que pueden proceder de suelo, agua,
aire o cualquier otra materia inorgánica.
En otra realización más preferida, la muestra
biológica está relacionada con el aparato respiratorio. Una
"muestra relacionada con el aparato respiratorio" se entiende
una muestra de origen biológico procedente de cualquier tejido del
aparato respiratorio o fluido secretado en los citados tejidos. Por
tanto, son muestras relacionadas con el aparato respiratorio la
secreción bronquial, el lavado broncoalveolar, el esputo o el
exudado orofaríngeo, sin excluir cualquier otro tipo de muestra que
se enmarque en la definición de este párrafo.
En otra realización preferida, la amplificación
de la región ITS2 del ADN ribosómico de Histoplasma
capsulatum se realiza por medio de los cebadores SEQ ID NO: 1 y
SEQ ID NO: 2 y la amplificación de la región ITS1 del ADN
ribosómico de Paracoccidioides brasiliensis se realiza por
medio de los cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
En otra realización preferida, la amplificación
se realiza por medio de PCR multiplex en tiempo real caracterizada
porque se emplean sondas específicas marcadas con dos fluoróforos
diferentes.
Las sondas específicas consisten en una
secuencia de ADN lineal y de cadena sencilla, complementario,
parcialmente, de cualquier parte de la secuencia del fragmento
amplificado correspondiente a los ITS de Histoplasma
capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis.
La técnica de amplificación de ADN conocida como
PCR (Polymerase Chain Reaction) se basa en la repetición de
un ciclo formado por tres etapas:
Desnaturalización del ADN de doble cadena que se
consigue con temperaturas altas (94ºC en la mayor parte de los
casos), hibridación de los cebadores a la zona 3' específica de
cada una de las hebras (la temperatura es específica para cada par
de cebadores) y extensión del cebador por actuación de la ADN
polimerasa (el tiempo necesario para la extensión depende de la
longitud del fragmento).
La cantidad de copias obtenidas tras la
amplificación de los fragmentos es proporcional a la cantidad
inicial de los mismos, es decir, a la cantidad de microorganismos
presentes en las muestras (más concretamente, a la cantidad de ADN
extraído y la calidad del mismo).
La PCR se denomina multiplex cuando se utilizan
más de un par de cebadores para amplificar de forma simultánea
varios fragmentos de ADN en una sola reacción de amplificación.
Para poder llevar a cabo estas amplificaciones, tanto el diseño de
los cebadores como de las sondas debe ser lo suficientemente
específico para evitar reacciones cruzadas que den lugar a
amplificaciones inespecíficas que pudieran invalidar el método. En
esta invención se utiliza una combinación de cebadores y sondas que
se muestran muy eficaces en la amplificación de los fragmentos.
Un cebador o "primer" es un oligonucleótido
corto que se puede sintetizar in vitro para ser utilizado en
diversas técnicas moleculares. Se diseñan como secuencias
complementarias de una región de ADN diana que se desea detectar.
Para obtener un fragmento, son necesarios dos cebadores, uno de
ellos se unirá a la hebra molde (cebador directo) y el otro a la
hebra complementaria (cebador reverso), en una posición que permita
obtener, mediante sucesivas amplificaciones con una enzima ADN
polimerasa termorresistente, un fragmento que pueda ser detectado
y/o cuantificado.
Para el diseño de cebadores es necesario hacer
una serie de predicciones, como la temperatura de fusión (Tm) o la
posibilidad de formación de horquillas que puedan reducir, por
competencia, la efectividad de la hibridación con la secuencia de
ADN diana. Las variables a tener en cuenta en el diseño de los
cebadores son fundamentalmente: Tamaño del oligonucleótido,
temperatura de fusión (Tm), especificidad con el ADN de las regiones
ITS de los ADN ribosómicos de Histoplasma capsulatum y
Paracoccidioides brasiliensis que se pretenden amplificar,
secuencias complementarias, contenido en G/C y fragmentos de
pirimidinas (T, C) o purinas (A, G), secuencia 3' terminal y
secuencia 5' terminal y regiones centrales.
Además, para la síntesis del ADN es necesaria la
presencia de nucleótidos trifosfato dNTPs, es decir, dATP, dTTP,
dCTP y dGTP, ADN polimerasa termoresistente, cloruro de magnesio en
una concentración determinada así como tampones que mantengan las
condiciones físico-químicas adecuadas para el
funcionamiento de todos los componentes y se consiga con ello la
amplificación.
La técnica de la PCR cuantitativa o también
conocida como PCR en tiempo real permite cuantificar en tiempo real
la amplificación de los fragmentos de interés. El método descrito
en esta invención utiliza dos sondas marcadas con un fluoróforo
distinto que se une de manera específica a los fragmentos de ADN
amplificados, de modo que, cada una de las sondas hibridan con el
fragmento de ADN correspondiente, presente en las secuencias
amplificadas de los ITS. Cada una de las sondas está marcada con un
fluoróforo distinto, de este modo se detecta y cuantifica de forma
simultánea, por emisión de fluorescencia, la amplificación de cada
uno de los fragmentos. Para detectar la fluorescencia procedente de
cada una de las amplificaciones, sometidas todas ellas a las mismas
condiciones de amplificación, el termociclador tiene acoplado un
detector que mide la fluorescencia en tiempo real a lo largo del
tiempo de duración de los ciclos de amplificación. Para poder
conocer la concentración de ADN que se obtiene como producto, es
necesario usar patrones de concentración conocida que permitan
realizar un seguimiento del funcionamiento de la técnica.
Así pues, una realización más preferida del
método es aquella en la que las sondas empleadas son:
- a.
- SEQ ID NO: 3 (los siete primeros nucleótidos son complementarios a los siete últimos) para el fragmento amplificado de Histoplasma capsulatum y se marca en el extremo 5' con un fluoróforo y en el extremo 3' con un quencher y
- b.
- SEQ ID NO: 6 (los seis primeros nucleótidos son complementarios a los seis últimos) para el fragmento amplificado de Paracoccidioides brasiliensis y se marca en el extremo 5' con un fluoróforo distinto del usado en el apartado (a) y en el extremo 3' con un quencher.
Las sondas empleadas en esta realización son del
tipo molecular beacon. Estas sondas forman una horquilla
debido a la presencia de 6-7 nucleótidos
complementarios entre sí en ambos extremos de la secuencia, cuya
estructura secundaria mantiene el fluoróforo y el quencher
próximos, de forma que cualquier fotón emitido por el reporter es
absorbido por el quencher. El resto de la secuencia, formada
por 19 nucleótidos, situada entre los extremos complementarios, es
complementaria a su vez a una parte de la secuencia de los
fragmentos amplificados. Cuando la sonda hibrida con el ADN
amplificado, se abre y esto aleja al fluoróforo del
quencher, permitiendo que se emita fluorescencia que puede
ser detectada y cuantificada.
El término "quencher" hace
referencia a un desactivador o apagador de la fluorescencia, es
decir, una molécula capaz de absorber los fotones emitidos por el
fluoróforo y disipar la energía en forma de calor, por lo que no se
produce emisión de fluorescencia.
En una realización aún más preferida, el
fluoróforo del apartado (a) es FAM (5 o
6-carboxifluoresceina), el fluoróforo del apartado
(b) es HEX
(5'-hexachloro-fluoresceina
fosforamidita) y el quencher es BHQ1.
Otro aspecto de la presente invención es el
método descrito en los párrafos precedentes como herramienta para
la monitorización de la respuesta a un tratamiento de
histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis donde se realizan tomas
de muestras seriales de pacientes que han recibido un tratamiento.
El análisis del ascenso o del descenso de la cuantificación del ADN
fúngico permitirá evaluar si la respuesta al tratamiento es
negativa o positiva, respectivamente.
El procedimiento de monitorización comprende una
serie de pasos que comienzan por la toma de muestras seriales. Se
entiende por toma de muestras seriales a la extracción de cualquier
tipo de muestras biológicas, incluidas las mencionadas en esta
invención. La toma de muestras se realiza a diferentes tiempos
desde que se administra el tratamiento, de forma que la
cuantificación de la amplificación de los fragmentos de los ITS de
los respectivos microorganismos en cada una de las muestras
procedentes del mismo paciente, indicarán la eficacia del mismo.
Así pues, una disminución de la desviación de los valores de
amplificación respecto de un control, representado éste último, por
ejemplo, por valores de amplificación en un mismo individuo,
previos al tratamiento, supondría que el tratamiento está surtiendo
efecto en el sentido de disminuir el nivel de microorganismos
causantes de las enfermedades histoplasmosis y
paracoccidioidomicosis. Este ejemplo no se limitaría únicamente al
uso de este tipo de control.
Otro aspecto de la presente invención es un kit
que comprende pares de cebadores capaces de amplificar, de forma
simultánea y en una sola reacción, mediante la técnica de la PCR,
un fragmento de la región ITS del ADN ribosómico de Histoplasma
capsulatum y/o Paracoccidioides brasiliensis.
El kit puede incluir reactivos para la
amplificación de un fragmento de la región ITS del ADN ribosómico
de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides
brasiliensis. Los reactivos incluidos en este kit pueden ser
otros cebadores específicos de la región nucleotídica ITS, sondas
específicas marcadas con dos fluoróforos diferentes así como con un
quencher, tal como se ha descrito en esta memoria.
El kit también puede incluir controles positivos
y negativos. Por controles positivos y negativos se entienden
componentes del kit que permitan comprobar la eficacia de los
reactivos suministrados en el mismo. La naturaleza de los controles
depende de la propia naturaleza de los reactivos, así pues, un
control positivo puede ser, por ejemplo, una construcción genética
que incluya las secuencias de los fragmentos de los ITS objeto de
estudio en la presente invención, que pueden ser amplificadas por
los pares de cebadores descritos anteriormente y, el control
negativo puede ser una construcción que carece de los fragmentos de
ITS presentes en el control positivo. Otros controles positivos y
negativos pueden ser incluidos este kit para evaluar el
funcionamiento del mismo.
En una realización preferida, el kit comprende
los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para amplificar un
fragmento de la región ITS2 del ADN ribosómico de Histoplasma
capsulatum y los cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 para
amplificar un fragmento de la región ITS1 del ADN ribosómico de
Paracoccidioides brasiliensis, mediante PCR.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
En otra realización preferida del kit, la
amplificación se realiza por medio de PCR multiplex en tiempo real
y se emplean sondas marcadas con dos fluoróforos diferentes.
En una realización más preferida del kit, las
secuencias de las sondas son SEQ ID NO: 3 para el fragmento
amplificado de Histoplasma capsulatum y SEQ ID NO: 6 para el
fragmento amplificado de Paracoccidioides brasiliensis. Las
sondas se marcan en el
\hbox{extremo 5' con un fluoróforo
diferente en cada caso y en el extremo 3' con el quencher
BHQ1.}
En diversas realizaciones preferidas, el kit se
emplea para:
- -
- el diagnóstico de histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis en una muestra biológica, ambiental o en un cultivo microbiológico.
- -
- la monitorización de la respuesta a un tratamiento de histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de
ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente
invención.
Fig 1. Muestra la región del ITS2 del ADN
ribosómico de Histoplasma capsulatum .
En la figura se observa la posición interna del
ITS2 de Histoplasma capsulatum. Los cebadores SEQ ID NO: 1 y
SEQ ID NO: 2 amplifican un fragmento situado en el ITS2, entre las
secuencias que codifican para el ARN ribosómico 5.8S y 28S.
Fig 2. Muestra la región del ITS1 del ADN
ribosómico de Paracoccidioides brasiliensis .
En la figura se observa la posición interna del
ITS1 de Paracoccidioides brasiliensis. Los cebadores SEQ ID
NO: 4 y SEQ ID NO: 5 amplifican un fragmento situado en el ITS2,
entre las secuencias que codifican para el ARN ribosómico 18S y
5.8S.
Ejemplo
1
Se diseñaron iniciadores y sondas del tipo
Molecular Beacon específicos para H. capsulatum y
P. brasiliensis dirigidos al ADN ribosómico, en concreto a la
región ITS2 (Internal Transcriber Spacer 2) en el caso de
H. capsulatum y a la región ITS1 en el caso de P.
brasiliensis.
Para el diseño de los iniciadores y de las
sondas se analizaron las secuencias de la regiones ITS (Internal
Transcriber Spacers) del ADN ribosómico de 20 cepas de H.
capsulatum y de una cepa de P. brasiliensis disponible en
el Servicio de Micología así como 14 cepas clínicas de P.
brasiliensis procedentes del Instituto de Pesquisa Clínica
Evandro Chagas. El diseño de los iniciadores y de las sondas se
realizó con la ayuda del programa de diseño de sondas Beacon
Desing 5.0 (Premier Biosoft, Palo Alto, CA, EE.UU.). En
el caso de H. capsulatum, el iniciador directo fue SEQ ID
NO: 1 y el reverso fue SEQ ID NO: 2. La sonda Molecular
Beacon, definida por la secuencia SEQ ID NO: 3, se marcó en el
extremo 5' con el fluoróforo FAM y en el extremo 3' con el
quencher o apagador BHQ1. En el caso de P.
brasiliensis, el iniciador directo fue SEQ ID NO: 4 y el
reverso fue SEQ ID NO: 5. La sonda, definida por la secuencia SEQ
ID NO: 6, se marcó en el extremo 5' con el fluoróforo HEX y en el
extremo 3' con el quencher BHQ1.
En la Tabla 1 aparecen los espectros de
excitación y emisión de los dos fluorocromos empleados para el
marcaje de las sondas.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Una vez diseñados los iniciadores y las sondas,
se realizó una búsqueda de tipo BLAST en la base de datos GenBank
(http://www.ncbi.nih.gov/Genbank/) para estar seguros de que no
presentaban homología con otros microorganismos. Adicionalmente, se
comprobó la especificidad de las sondas y de los iniciadores
diseñados mediante análisis filogenéticos de sus secuencias. Para
estos análisis se utilizó la base de datos de secuencias del
Servicio de Micología, que dispone de 3600 cepas pertenecientes a
300 especies fúngicas y el programa informático Fingerprinting
II informatix, versión 3.0 (BIORAD, Madrid, España).
En una primera etapa de puesta a punto de la
técnica se optimizó por separado la detección de ADN de H.
capsulatum y P. brasiliensis. Se determinó la
sensibilidad y reproducibilidad de cada ensayo de PCR por separado y
también se realizó un estudio para conocer la especificidad de las
secuencias elegidas para los iniciadores y las sondas. En este
estudio de especificidad se utilizaron doce cepas pertenecientes a
especies fúngicas que causan infecciones parecidas a la
histoplasmosis y paracoccidioidomicosis y especies fúngicas que
originan infecciones con frecuencia. Estas especies eran
Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasiliensis
(se incluyó en el caso de la PCR en tiempo real de detección de
H. capsulatum), Histoplasma capsulatum (se incluyó en
el caso de la PCR en tiempo real de la detección de P.
brasiliensis) Blastomyces dermatitidis, Aspergillus
fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus terreus, Fusarium
solani, Fusarium verticillioides, Fusarium oxysporum, Scedosporium
prolificans, Scedosporium apiospermum y Candida albicans. Además
se incluyeron en los experimentos ADN genómico humano y de ratón
(Promega, Madrid, Spain).
En una segunda etapa se optimizó la PCR
multiplex en tiempo real de modo que no se produjera una
disminución de sensibilidad respecto a las PCRs en tiempo real
estandarizadas individualmente. Puesto que los fluorocromos estaban
separados sólo 30 nm se realizó una compensación de color para
evitar solapamiento en la detección de fluorescencia. Para realizar
la compensación de color se hizo una lectura de fluorescencia en
ambos canales empleando las sondas en una concentración 0,4 \muM.
Una vez estandarizadas las condiciones se aplicó dicha compensación
de color a cada uno de los experimentos.
En la Fig 1 y Fig 2 se representan
esquemáticamente las zonas de amplificación elegidas en cada
caso.
Ejemplo
2
Se emplearon las 20 cepas de H.
capsulatum, las 15 cepas de P. brasiliensis y las 11 de
otras especies descritas en el apartado anterior. La extracción de
ácidos nucleicos se realizó siguiendo procedimientos habituales. En
el caso de los patógenos primarios, la extracción se realizó en un
laboratorio de bioseguridad para patógenos del grupo 3, cumpliendo
las normas establecidas (Real Decreto 664/1997).
Las reacciones de PCR en tiempo real contenían
un volumen final de 20 \muL, con 4,5 mM de Cl_{2}Mg, 0,5 \muM
de cada iniciador y 0,2 \muM de la sonda SEQ ID NO: 3 y 0,6
\muM de sonda SEQ ID NO: 6, además, se añadieron 2 \mul de ADN a
la mezcla de PCR. Respecto a las condiciones de la reacción de PCR,
se realizó una preincubación a 95ºC seguida de 50 ciclos de
desnaturalización (25 s a 95ºC), anillamiento (30 s a 53ºC), y
extensión (5 s a 72ºC). Por último, el protocolo incluyó un ciclo
para conocer la temperatura de fusión de la doble cadena de ADN del
producto amplificado (curva de melting). Este ciclo se
realizó en el intervalo de temperaturas de 30 a 80ºC. Este ciclo se
realiza siempre en las PCR en tiempo real (o cuantitativas), pues
ayuda a identificar el producto amplificado, ya que la temperatura
de fusión es específica para cada secuencia.
Las reacciones de PCR se realizaron en el equipo
LC480 (Roche Applied Science, Madrid, España) y en cada
experimento se incluyeron controles negativos.
El estudio de reproducibilidad de la técnica,
así como la cuantificación del ADN amplificado se realizaron
mediante la construcción de rectas de regresión con los resultados
de cinco repeticiones de diferentes diluciones de ADN (desde 10 ng a
1 fg DNA/\muL) de H. capsulatum
CNM-CM-2721 (Colección de hongos
filamentosos del Servicio de Micología del Centro Nacional de
Microbiología), así como cinco repeticiones de diferentes
diluciones de ADN de P. brasiliensis 20960 (Colección de
hongos filamentosos del Servicio de Micología del Centro Nacional de
Microbiología) (desde 10 ng a 1 fg DNA/\muL). Las rectas de
regresión se realizaron entre los logaritmos de las concentraciones
de ADN y el ciclo de la reacción de PCR en el que se empezaba a
detectar la fluorescencia (crossing point, Ct). La
fluorescencia se midió en los canales correspondientes en cada caso.
La reproducibilidad se obtuvo mediante el cálculo de los
coeficientes de variación de los Ct para cada una de las
concentraciones de ADN utilizadas. Las rectas de regresión
construidas entre las concentraciones conocidas de ADN y los
Ct tenían un coeficiente de determinación (r^{2})
de 0,99 (P<0.01). La reproducibilidad del ensayo fue muy
elevada siendo la media de los coeficientes de variación en torno
al 3% para H. capsulatum y en el caso de P.
brasiliensis, se situó en tomo al 4%.
La sensibilidad fue también elevada, situándose
el límite de detección entre 10 fg y 1 fg por \muL de muestra
analizada, aunque en el caso de la detección de P.
brasiliensis en las concentraciones más bajas (1 fg por \muL)
se pierde la reproducibilidad siendo el límite reproducible de 10
fg por \muL.
La especificidad fue del 100%, ya que no se
detectó en ninguna de las reacciones realizadas, ADN de las otras
11 especies incluidas en los estudios, ni ADN murino o humano.
Ejemplo
3
Se emplearon las 46 cepas enumeradas en las
secciones precedentes. Se utilizaron las mismas técnicas de
extracción y de amplificación. La sensibilidad fue del 100% y la
especificidad del 100%. Todos estos experimentos se realizaron en
las instalaciones con medidas de bioseguridad de nivel 3.
Ejemplo
4
Una vez que se estandarizó in vitro la
técnica de PCR multiplex y que se comprobó su utilidad como método
de identificación de colonias en cultivo, se procedió a realizar
una adaptación de la misma, para utilizarla en muestras
biológicas.
La extracción de ADN de las muestras biológicas
se realizó mediante procedimientos habituales y también empleando
el kit QiampDNA Mini Kit (Qiagen, Izasa, Madrid, España). Se
emplearon 2 \mul del ADN extraído de cada muestra para cada
reacción de PCR en tiempo real. La única excepción fueron las
muestras de suero en los que se verificó que el empleo de 4 \mul
mejoraba la sensibilidad del ensayo.
En el caso de muestras parafinadas se realizó un
paso previo para desparafinar consistente en lavar con 1,2 ml de
Xileno seguido de dos lavados con 1,2 ml de etanol
(96-100%). Para validar la técnica de PCR en tiempo
real en muestras biológicas, se emplearon 44 muestras procedentes
de 20 pacientes, 18 de ellos con histoplasmosis probada y dos
pacientes con paracoccidioidomicosis probada. La infección se había
confirmado mediante técnicas de diagnóstico convencionales como el
cultivo, el examen histológico o la serología positiva, más cuadro
clínico y antecedentes epidemiológicos compatibles. Debe destacarse
que la técnica de PCR se aplicó a las muestras biológicas
disponibles, que fueron
\hbox{enviadas desde 20 centros
sanitarios diferentes, según sintomatología, disponibilidad y
posibilidades de cada caso.}
La técnica de PCR fue positiva en 14 de los 18
enfermos con histoplasmosis y en los dos enfermos con
paracoccidioidomicosis lo que representa en total el 80% de todos
los pacientes. Por muestras, se analizaron 21 sueros (de algunos
enfermos se recibieron muestras seriadas de suero), 11 muestras
relacionadas con el aparato respiratorio, 3 aspirados de médula
ósea, 3 muestras de plasma, 2 muestras de sangre, dos biopsias y
una muestra de orina. La técnica de PCR mostró un 91% de
sensibilidad en muestras relacionadas con el aparato respiratorio,
ya que detectó ADN de esta especie en 10 de las 11 muestras
analizadas (lavados broncoalveolares, secreciones bronquiales,
esputo y exudado orofaríngeo). En otros tipos de muestras
biológicas, la técnica fue positiva en dos de las tres muestras de
médula ósea (66%) y en dos de las tres muestras de plasma (66%) y
en el 100% de las biopsias. Fue negativa para la muestra de orina y
para las tres muestras de sangre, probablemente debido a la
inhibición de la PCR por los componentes de dichas muestras.
Respecto a los sueros, fue positiva en 9 de los 21 sueros (42,8%).
Nunca se obtuvieron resultados positivos en los sueros de pacientes
con paracoccidioidomicosis pero es un resultado esperable ya que la
cantidad de ADN en dichas muestras es muy pequeña. En total, la
técnica fue positiva en 25 de las muestras analizadas (57%).
En la tabla se resumen los resultados de las
muestras analizadas, junto con las determinaciones serológicas y
los resultados del cultivo, en las muestras que se recibieron.
La media de las concentraciones de DNA en
muestras biológicas fue de 51,36 fg/\mul en las muestras séricas
y de 25,2 x10^{3} fg/\mul en el resto de muestras analizadas,
lo que puede explicar la mejor sensibilidad de la técnica en
muestras no serológicas.
Asimismo se realizó un estudio de especificidad.
Se analizaron 40 muestras de sueros de pacientes neutropénicos (con
disminución de la concentración de neutrófilos en sangre), 10 de
ellos con PCR positiva para Aspergillus fumigatus y otros 30
con PCR negativa. Para todos ellos la técnica de PCR en tiempo real
múltiple específica para H. capsulatum y P.
brasiliensis fue negativa. Se analizaron también cinco sueros
de pacientes sanos procedentes de zonas endémicas obteniéndose
también resultados negativos.
Estos resultados indican que la técnica de PCR
demostró una sensibilidad notable en todas las muestras analizadas,
particularmente en las muestras relacionadas con el aparato
respiratorio. Nunca se detectó reacción cruzada entre ambos
patógenos, siendo la técnica negativa a histoplasma en los casos de
paracoccidioidomicosis y a la inversa. Además, el resultado de la
PCR se obtuvo 24-48 horas después de recibir la
muestra en el Servicio de Micología, lo que muestra que es una
técnica de diagnóstico rápido.
Paralelamente, se determinó la presencia de
anticuerpos para H. capsulatum y P. brasiliensis en
las muestras de suero y se realizó el cultivo de las muestras de
sangre, muestras relacionadas con el aparato respiratorio, de médula
ósea y de orina. Como puede verse en la tabla anterior, se
cultivaron muestras, resultando positivas un total de 12 (52%). El
cultivo fue positivo entre 10 y 14 días después de la siembra.
También se determinaron los anticuerpos anti Histoplasma y
Paracoccidioides mediante una técnica de inmunodifusión (ID
Fungal Antibody System, Immuno-Mycologics,
Leti Laboratorios, Madrid, España), siendo la técnica positiva en
nueve sueros de los 21 recibidos (42%). La inmunodifusión fue
invariablemente negativa en la mayoría de las muestras procedentes
de enfermos VIH+ o con otras inmunodepresiones.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Instituto de Salud Carlos III
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para la detección simultánea
de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides
brasiliesis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1613.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Histoplasma capsulatum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Histoplasma capsulatum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> stem-loop
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los siete primeros nucleótidos son
complementarios a los siete últimos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccidioides
brasiliensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paracoccidioides
brasiliensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> stem-loop
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los seis primeros nucleótidos son
complementarios a los seis últimos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (16)
1. Método para la detección simultánea de
Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides
brasiliensis que comprende:
- a.
- obtener una muestra y aislar su ADN,
- b.
- amplificar un fragmento de la región ITS del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum y/o Paracoccidioides brasiliensis contenido en el ADN aislado en el paso (a),
- c.
- determinar la desviación del paso (b) con respecto a los controles y
- d.
- analizar la desviación del paso (c) y atribuir la misma a la presencia de los citados microorganismos.
2. Método según la reivindicación 1 donde la
concentración del ADN aislado para llevar a cabo la amplificación
es de al menos 10 fg/\mul.
3. Método según la reivindicación 1 donde la
muestra es:
- a.
- una muestra biológica,
- b.
- un cultivo microbiológico o
- c.
- una muestra ambiental.
4. Método según la reivindicación 3 donde la
muestra biológica está relacionada con el aparato respiratorio.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 donde la amplificación de la región ITS2 del
ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum se realiza por
medio de los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y la
amplificación de la región ITS1 del ADN ribosómico de
Paracoccidioides brasiliensis se realiza por medio de los
cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 donde la amplificación se realiza por medio
de PCR multiplex en tiempo real caracterizada porque se
emplean sondas específicas marcadas con dos fluoróforos
diferentes.
7. Método según la reivindicación 6 donde las
sondas son:
- a.
- SEQ ID NO: 3 para el fragmento amplificado de Histoplasma capsulatum y se marca en el extremo 5' con un fluoróforo y en el extremo 3' con un quencher y
- b.
- SEQ ID NO: 6 para el fragmento amplificado de Paracoccidioides brasiliensis y se marca en el extremo 5' con un fluoróforo distinto del usado en el apartado (a) y en el extremo 3' con un quencher.
8. Método según la reivindicación 7 donde el
fluoróforo del apartado (a) es FAM, el fluoróforo del apartado (b)
es HEX y el quencher es BHQ1.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, para la monitorización de la respuesta a un
tratamiento de histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis.
10. Kit para la detección simultánea de
Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides
brasiliensis que comprende pares de cebadores que pueden
amplificar, mediante la técnica de la PCR, un fragmento de la
región ITS del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum y/o
Paracoccidioides brasiliensis.
11. Kit según la reivindicación 10 que comprende
los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para amplificar un
fragmento de la región ITS2 del ADN ribosómico de Histoplasma
capsulatum y los cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 para
amplificar un fragmento de la región ITS1 del ADN ribosómico de
Paracoccidioides brasiliensis.
12. Kit según la cualquiera de las
reivindicaciones 10 u 11 donde la amplificación se realiza por
medio de PCR multiplex en tiempo real y se emplean sondas
específicas marcadas con dos fluoróforos diferentes.
13. Kit según la reivindicación 12 donde las
sondas son:
- a.
- SEQ ID NO: 3 para el fragmento amplificado de Histoplasma capsulatum y se marca en el extremo 5'con un fluoróforo y en el extremo 3' con un quencher y
- b.
- SEQ ID NO: 6 para el fragmento amplificado de Paracoccidioides brasiliensis y se marca en el extremo 5' con un fluoróforo distinto del usado en el apartado (a) y en el extremo 3' con un quencher.
14. Kit según la reivindicación 13 donde el
fluoróforo del apartado (a) es FAM, el fluoróforo del apartado (b)
es HEX y el quencher es BHQ1.
15. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
10 a 14, para el diagnóstico de histoplasmosis y/o
paracoccidioidomicosis en una muestra biológica, ambiental o en un
cultivo microbiológico.
16. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
10 a 14, para la monitorización de la respuesta a un tratamiento de
histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis.
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| EC2A | Search report published |
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Ref document number: 2335179 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B1 Effective date: 20110914 |