CN115038797A - 用于确定肠道寄生虫的存在的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及来自患者、食物或环境样品，优选来自粪便样品的肠道寄生虫的检测领域。特别地，本发明提供了一种基于聚合酶链式反应(PCR)的测定方法，其用于检测肠道寄生虫感染，特别是选自由以下组成的组的寄生虫种类的感染：短膜壳绦虫(Hymenolepis nana)、缩小膜壳绦虫(Hymenolepis diminuta)、布氏姜片虫(Fasciolopsis buski)、脑胞内原虫属(Encephalitozoon spp)(诸如肠脑炎微孢子虫(E.intestinalis)、家兔脑胞内原虫(E.cuniculi)和脑细胞内原虫(E.hellem))、比氏肠孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)、蠕形住肠蛲虫(Enterobius vermicularis)、阔节裂头绦虫(Diphyllobothrium latum)、日本海裂头绦虫(Diphyllobothrium nihonkaiense)、曼氏裂体吸虫(Schistosoma mansoni)、人芽囊原虫(Blastocystis hominis)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)和肝蠕虫(liver worm)(诸如华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)、后睾吸虫属(Opisthorchis spp.)和次睾吸虫属(Metorchis spp))。本发明进一步提供了用于本发明方法的材料，例如引物、引物对和探针。优选地，本发明的方法是用于快速确定临床上重要的肠道寄生虫的多重实时荧光定量PCR测定。
Description
技术领域
本发明涉及来自患者、食物或环境样品，优选来自粪便样品的肠道寄生虫的检测领域。特别地，本发明提供了一种基于聚合酶链式反应(PCR)的测定方法，其用于检测肠道寄生虫感染，特别是选自由以下组成的组的寄生虫种类的感染：短膜壳绦虫(Hymenolepisnana)、缩小膜壳绦虫(Hymenolepis diminuta)、布氏姜片虫(Fasciolopsis buski)、脑胞内原虫属(Encephalitozoon spp)(诸如肠脑炎微孢子虫(E.intestinalis)、家兔脑胞内原虫(E.cuniculi)和脑细胞内原虫(E.hellem))、比氏肠孢子虫(Enterocytozoonbieneusi)、蠕形住肠蛲虫(Enterobius vermicularis)、阔节裂头绦虫(Diphyllobothriumlatum)、日本海裂头绦虫(Diphyllobothrium nihonkaiense)、曼氏裂体吸虫(Schistosomamansoni)、人芽囊原虫(Blastocystis hominis)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)和肝蠕虫(liver worm)(诸如华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)、后睾吸虫属(Opisthorchis spp.)和次睾吸虫属(Metorchis spp))。本发明进一步提供了用于本发明方法的材料，例如引物、引物对和探针。优选地，本发明的方法是用于快速确定临床上重要的肠道寄生虫的多重实时荧光定量PCR测定。
背景技术
肠道寄生虫感染是世界范围内的主要健康问题，导致发病率和死亡率，尤其是发展中国家的婴儿死亡率。肠道寄生虫感染也是旅行者报告的问题，并且通常是由食物或水的污染、受感染的土壤和卫生不当引起的。肠道寄生虫感染可能会引起轻微症状，但存在腹痛、出血性腹泻和呕吐的严重感染。这些症状对营养状况、食欲不振、体重减轻和通常会导致贫血的肠道失血产生负面影响。
目前，肠道寄生虫的鉴定还没有统一的标准(Garcia等人,2018)。目前，许多寄生虫的诊断依赖于粪便样品的显微镜检查。众所周知，显微镜检查耗时长，检查效率低，并且对检查者的临床经验要求高。此外，肠道寄生虫可能以囊肿或卵的形式存在，形状与多种寄生虫种类相似，因此无法通过普通光学显微镜相互区分。因此，现有技术方法经常导致误判。免疫诊断也已用于寄生虫检测，但尽管免疫诊断比显微镜检查更有效，但它通常受到灵敏度和特异性的限制。
尽管已经公开了许多用于检测肠道寄生虫种类的基于PCR的测定法，但该领域仍需要能够为特定肠道寄生虫种类的检测提供高特异性和可靠性的进一步PCR测定法，例如在多重测定法中。本发明人现已在寄生虫基因组中定位了DNA序列区域，这些区域出人意料地非常适合特异性地且灵敏地扩增特定肠道寄生虫种类中的标志物。
寄生虫诊断中通常是粪便或食物样品的样品基质可能含有大量PCR抑制剂。这会降低PCR反应的扩增效率，因此预期由扩增子设计步骤进行甚至更仔细的优化，以验证所有模板和拷贝数是否均等地扩增，而且足够有效。因此，需要能够实现高PCR效率(最好尽可能接近100％)的寡核苷酸设计。所用检测方法也可能影响扩增效率和/或偏差。
本发明人现在已定位了非常适合特异性地且灵敏地扩增和定量肠道寄生虫种类的的DNA序列区域。扩增子被设计成具有如此特异性，以至于它们可以相互组合成任何多重集合。当然，前提条件是所有公开的扩增子也被设计为在相同的反应和循环条件下进行扩增。本发明的目的是代替抗原测试和显微镜检查作为肠道寄生虫的筛查测试，从而快速通过提供一组丰富的信息，提供用于实验室的工艺改进和在改善患者管理方面的临床益处。此外，如果临床微生物学实验室能够轻松区分肠道寄生虫种类，感染控制可能会受益。
发明内容
肠道寄生虫的数量很大，并且寄生虫测试方法应最佳地尽可能多地鉴定。每个种类进行一次PCR反应可能很麻烦，因为测试的样品数量通常很大。应最佳地在一个反应中检测多个种类。在PCR设置中，最明显的替代方法是‘多重’PCR扩增。在多重PCR中，在同一反应容器中包含若干寡核苷酸组，每个寡核苷酸组被设计用于扩增一个种类/种类组，并且每个寡核苷酸组用于在同一PCR反应期间扩增其各自的病原体DNA。在本发明中，描述了一种用阔节裂头绦虫于快速检测临床上重要的肠道寄生虫的基于PCR的方法，所述肠道寄生虫特别是短膜壳绦虫、缩小膜壳绦虫、布氏姜片虫、脑胞内原虫属(诸如肠脑炎微孢子虫、家兔脑胞内原虫和脑细胞内原虫)、比氏肠孢子虫、蠕形住肠蛲虫、阔节裂头绦虫、日本海裂头绦虫、曼氏裂体吸虫、人芽囊原虫、十二指肠钩虫和肝蠕虫(诸如华支睾吸虫、后睾吸虫属和次睾吸虫属)。本发明公开了设计用于所述肠道寄生虫中保守的靶序列的引物和探针。这些引物和探针可兼容用于确定多种肠道寄生虫的存在的任何多重qPCR中。
多重PCR对病原体DNA的定量(qPCR)提出了挑战：不同的扩增子竞争相同的PCR反应组分(例如DNA聚合酶和MgCl2)，这可能会影响样品之间的反应的定量性质，并且尤其是样品之间的定量比较。本领域公知的是，不同模板量或长度之间的扩增效率存在偏差，因此例如短的扩增子在较长的扩增子的代价下更受青睐。
同时，必须避免多重集合寡核苷酸组合的不希望的交叉反应。还必须记住检查对样品中存在的任何其他序列的错误引导。
寻找用于检测多种病原微生物的合适的引物和探针序列绝非易事，尤其是在设计所有扩增子和模板均应以同等效率扩增的多重设置时。许多种类相对密切相关，使得定位每个种类特有的序列具有挑战性。一些基因具有复杂的重复密切相关元件，从扩增子设计的角度来看，这是具有挑战性的，尤其是在设计用于多重PCR的扩增子时。
肠道寄生虫诊断中通常是粪便或食物样品的样品基质可能含有大量PCR抑制剂。这会降低PCR反应的扩增效率，因此预期由扩增子设计步骤进行甚至更仔细的优化，以验证所有模板和拷贝数是否均等地扩增，而且足够有效。因此，需要能够实现高PCR效率(最好尽可能接近100％)的寡核苷酸设计。所用检测方法也可能影响扩增效率和/或偏差。
在一个方面，本发明涉及一种用于确定生物样品中一种或多种肠道寄生虫的存在的方法，其包括以下步骤：
i)在扩增测定中使所述样品或从所述样品中分离的核酸与寡核苷酸引物接触，以提供用于核酸扩增的反应混合物；
ii)使用从步骤i)中获得的包含来自所述生物样品的DNA作为模板的所述反应混合物进行核酸扩增反应，使得只要所述一种或多种肠道寄生虫的靶序列存在于所述样品中，所述序列就被特异性扩增；和
iii)检测所述反应混合物中扩增的靶序列的存在，其中所述靶序列的存在表明所述样品中存在肠道寄生虫；
其中所述一种或多种肠道寄生虫选自由以下组成的组：短膜壳绦虫、缩小膜壳绦虫、布氏姜片虫、脑胞内原虫属(诸如肠脑炎微孢子虫、家兔脑胞内原虫和脑细胞内原虫)、比氏肠孢子虫、蠕形住肠蛲虫、阔节裂头绦虫、日本海裂头绦虫、曼氏裂体吸虫、人芽囊原虫、十二指肠钩虫和肝蠕虫诸如华支睾吸虫、后睾吸虫属和次睾吸虫属；
其中所述靶序列选自由如SEQ ID No:1-16和46-47所定义的序列组成的组，其中所述寡核苷酸引物包含与由如SEQ ID No:1-16和46-47定义的靶序列之一结合的引物对并且允许在步骤ii)中扩增至少部分靶序列。
附图说明
图1.用短膜壳绦虫和缩小膜壳绦虫的引物进行PCR反应的扩增曲线。
图2.用布氏姜片虫的引物进行PCR反应的扩增曲线。
图3.用A.家兔脑胞内原虫和B.肠脑炎微孢子虫的引物进行PCR反应的扩增曲线。
图4.用A.脑细胞内原虫和B.比氏肠孢子虫的引物进行PCR反应的扩增曲线。
图5.用A.蠕形住肠蛲虫和B.裂头绦虫属的引物进行PCR反应的扩增曲线。
图6.用A.日本海裂头绦虫和B.日本海裂头绦虫/Diphyllobothriumklebanovskii的引物进行PCR反应的扩增曲线。
图7.用A.曼氏裂体吸虫和B.人芽囊原虫的引物进行PCR反应的扩增曲线。
图8.用肝蠕虫华支睾吸虫、后睾吸虫属和次睾吸虫属的引物进行PCR反应的扩增曲线。
图9.本发明的优选PCR方案。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测肠道寄生虫的基于核酸扩增的检测方法，所述肠道寄生虫特别是选自由以下组成的组的一种或多种肠道寄生虫：短膜壳绦虫、缩小膜壳绦虫、布氏姜片虫、脑胞内原虫属(诸如肠脑炎微孢子虫、家兔脑胞内原虫和脑细胞内原虫)、比氏肠孢子虫、蠕形住肠蛲虫、阔节裂头绦虫、日本海裂头绦虫、曼氏裂体吸虫、人芽囊原虫、十二指肠钩虫和肝蠕虫(诸如华支睾吸虫、后睾吸虫属和次睾吸虫属)。本发明进一步提供了用于本发明的方法的材料，例如引物、引物对(即一对正向引物和反向引物)和探针。具体地，本发明提供了一种用于确定生物样品中肠道寄生虫的存在的方法，其包括以下步骤：i)在扩增测定中使样品或从所述样品中分离的核酸与寡核苷酸引物接触，以提供用于核酸扩增的反应混合物；
ii)使用从步骤i)中获得的包含来自所述生物样品的DNA作为模板的所述反应混合物进行核酸扩增反应，使得只要所述一种或多种肠道寄生虫的靶序列存在于所述样品中，所述序列就被特异性扩增；和
iii)检测所述反应混合物中扩增的靶序列的存在，其中所述靶序列的存在表明所述样品中存在肠道寄生虫；
其中所述靶序列选自由如SEQ ID No:1-16和46-47所定义的序列组成的组，其中所述寡核苷酸引物包含与由如SEQ ID No:1-16和46-47定义的靶序列之一结合的引物对并且允许在步骤ii)中扩增至少部分靶序列。
所述生物样品可以是粪便样品、食物样品(例如肉类样品)或任何环境样品。样品可以在步骤i)之前进行富集。
优选地，所述核酸扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)。如本领域公知的，PCR是一种方法，其中核酸分子的有限片段(即靶序列)被重复扩增，以产生大量仅由该片段组成的DNA分子。该程序依赖于大量引导和转录循环的重复。在每个循环中，两个寡核苷酸引物(即正向引物和反向引物)与片段结合，并限定片段的界限。然后，引物依赖性DNA聚合酶转录或复制与引物结合的链。产生的PCR产物称为扩增子。在一个具体实施例中，本文公开的方法包括对肠道寄生虫基因组的一部分进行PCR扩增的步骤。
如本文所定义的“靶序列”是存在于肠道寄生虫基因组中的核酸片段，其旨在进行检测、定量、定性检测或其组合。例如，靶序列是肠道寄生虫基因组中的特定核酸，其旨在进行扩增。如果需要，用于引发扩增反应的模板分子的纯化或分离可以通过本领域技术人员已知的方法进行。例如，模板的分离可以通过使用可商购获得的纯化试剂盒等来实现。
在靶生物体中扩增的优选靶序列(或扩增子)列于表1中。然而，本领域技术人员知道这些靶序列在相关菌株中自然地变化。在设计适用于在本发明的方法中扩增所述扩增子的引物时，可以考虑这种微小的变化。优选地，在所述方法中扩增选自由SEQ ID NO:1-16和46-47组成的组的靶序列中每一者的至少20、25、30、35、40、50、60、70、80、90 100或125个核苷酸长度的序列。
表1.在靶生物体中扩增的靶序列(5′->3′)。仅显示了每个核酸序列的一条链，但互补链被理解为包括在对所示链的任何提及中。
膜壳绦虫属cox1
AATTCCTGATGCTTTTGGGTTTTATGGTTTATTATTTGCTATGTTTTCTATAGTGTGCTTAGGTTGTAGTGTGTGGGCTCATCATATGTTTACTGTTGGTTTGGATGTTAAGACGGCTGTATTTT(SEQ ID NO:1)
膜壳绦虫属cox1、v2
AATTCCTGATGCTTTTGGGTTTTATGGGCTCTTGTTTGCCATGTTTTCTATTGTTTGTTTAGGTAGAAGTGTTTGAGGGCATCATATGTTTACTGTTGGTTTAGATGTAAAGACGGCAGTGTTCT(SEQ ID NO:2)
布氏姜片虫ITS1
CACTGTTCAAGTGGTATTGATTGGGTTCGCCCATTCTTTGCCATTGCCCTCGCATGCACCTGGTCCTTGTGGCCGGACTGCACGTACGTCGCCCGGCGGTGCCTATCCCGGGTAGGACTGATAACCTGG(SEQ ID NO:3)
脑胞内原虫属18S
GACGAAGATCGGAAGGTCTGAGTCCTGAGTGTTAGATAAGATATAAGTCGTAACATGGCTGCTGTTGGAGAACCAGCAGCAGGATCAGTATGTTGTTGTGTTTTGATGGATGTTTGTTTGTTTGTTTGTGGTTTCTCTGTTCACGGGATTGATTGGCATTAGCG(SEQ ID NO:4)
脑胞内原虫属18S v2
GACGAAGATTGGAAGGTCTGAGTCCTTCGTGTTAGATAAGATATAAGTCGTAACGCGGCTGCTGTTGGAGAACCAGCAGCAGGATCAGTATTTGAGAGATTGGGGGGAATTTTTTTGATTTGAGGATCCACGGGATTGATAGGCATTAGCA(SEQ ID NO:5)
脑胞内原虫属18S v3
GACGAAGATTGAGAGGTCTGAGTCTTTCGTGTTAGATAAGATATAAGTCGTAACATGGCTGCTGTTGGAGAACCAGCAGCAGGATCAGTATGTTGATTTGATTGATTTGTGGGGATTTTTAGTTTTTTAGTTTTTCTTTCTCTATCCATGGGATTGATTGGCATTATCT(SEQ ID NO:6)
比氏肠孢子虫18S
GAGTGTAGTATAGACTGGCGAAGAATGAAATCTCAAGACCCAGTTTGGACTAACGGAGGCGAAGGCGACACTCTTAGACGTATCTTAGGATCAAGGACGA(SEQ ID NO:7)
蠕形住肠蛲虫ITS
GCAGAGCTTTTCCAAAATTTATTTCCAAGCCACAGACTCACTGATGTTCATGTCTGAGCCGGAACGAGAAATTACCTCAAACTTGGG(SEQ ID NO:8)
阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1
CCAGTTATTACAGGTGTGAGATTGAATAAGTATTTATTACAATGTCATTGTATAGTTTCTAATGTTGGTTTCAATTTATGTTTTTTCCCTATGCATTACTTTGGTGTGTGCGGTTTACCACGTCGTGTGTGTGTGTACGAGTCGGGTTATGCTTGA(SEQ ID NO:9)
阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1 v2
CCAGTTATTACTGGTGTAAGATTGAATAAGTATTTACTACAATGTCATTGTATAGTTTCTAATGTTGGTTTCAATTTATGTTTTTTTCCCATGCATTATTTTGGTGTGTGCGGTTTACCACGTCGTGTGTGCGTATATGAGTCAGGTTATGCTTGA(SEQ ID NO:10)
阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1 v3
CCAGTTATTACTGGTGTAAGATTGAATAAGTATTTACTACAATGTCATTGTATAGTTTCTAATGTTGGTTTCAATTTATGTTTTTTTCCTATGCATTATTTTGGTGTGTGCGGTTTACCACGTCGTGTGTGTGTATATGAGTCAGGTTATGCTTGA(SEQ ID NO:11)
阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1 v4
CCAGTTATTACTGGTGTGAGATTGAATAAGTATTTACTACAATGTCATTGTATAGTTTCTAATGTTGGTTTCAATTTATGTTTTTTTCCTATGCATTATTTTGGTGTGTGCGGTTTACCACGTCGTGTGTGCGTATATGAGTCAGGTTATGCTTGA(SEQ ID NO:12)
曼氏裂体吸虫cox1
AGGTGTTTTCATGACTTTATATGTTGAATAGTTGCGGTATGCGGGTTTTAGATCCCATAGTATGGTGATTAGTCGGTTTTATATTTTTATTTACGGTTGGTGGTGTCACAGGGGTGGCTTTATCTGCATCTGCT(SEQ ID NO:13)
人芽囊原虫18S
TCAGCTTTCGATGGTAGTGTATTGGACTACCATGGCAGTAACGGGTAACGAAGAATTTGGGTTCGATTTCGGAGAGGGAGCC(SEQ ID NO:14)
人芽囊原虫18S v2
TCAGCTTTCGATGGTAGTATATGGGCCTACCATGGCAGTAACGGGTAACGAAGAATTTGGGTTCGATTTCGGAGAGGGAGCC(SEQ ID NO:15)
华支睾吸虫/后睾吸虫属/次睾吸虫属18S
AGCTCGTAGTTGGATCTGGGTCGCATGGCTACATGCCGTTGCTCGTATTCCTGGCCTGGTTCACACCGGGACGGGTTTGTGAGTCGGTGTCGTGG(SEQ ID NO:16)
十二指肠钩虫ITS_gB_1
CCCATGAGACATACAAAAAGGTAATGCCGCCGTCTGGTTCAGGGTTGTTTATATCTACTACAGTGTAGCTTGTGGCACTGTTTGTCGAACGGCACTTGCTTTTAGCGATTCCCGTTCTAGATCAGAATATATTGCAACATGTACGTTAGCTGGCTAGTTTGCTAACGTGCGCTGAATGACAGCAAACTCGTTGTTGCTGCTGAATCGTTCACCGACTTTAGAACGTTTCGGGTCTCGACTATACGCCCGTTTTCGGATC(SEQ ID NO:46)
十二指肠钩虫ITS_gB_2
CCCATGAGACATACAAAAAGGTAATGCCGCCTATATCTACTACAGTGCAGCTTGTGGCACTGTTTGTCGAACGGCACTTGCTTTTAGCGATTCCCGTTCTAGATCAGAATATATTGCAACATGTACGTTGGCTGGCTAGTTTGCTAACGTGCGCTGAATGACAGCAAACTCGTTGTTGCTGCTGAATCGTTTACCGACTTTAGAACGTTTCGGGTCTCGACTATACGCCCGTTTTCGGATC(SEQ ID NO:47)
在本发明方法中优选用于扩增靶序列的引物对列于表2中。
表2.用于扩增表1中列出的靶序列的引物序列(5′->3′)实施例。
引物对A)，膜壳绦虫属cox1
正向引物：AATTCCTGATGCTTTTGGGTTTTATG(SEQ ID NO:17)
反向引物：AGAACACTGCCGTCTTTACATCTAA(SEQ ID NO:18)
引物对B)，膜壳绦虫属cox1、v2
正向引物：AATTCCTGATGCTTTTGGGTTTTATG(SEQ ID NO:17)
反向引物：AAATACAGCCGTCTTAACATCCAA(SEQ ID NO:19)
引物对C)，布氏姜片虫ITS1
正向引物：CACTGTTCAAGTGGTATTGATTG(SEQ ID NO:20)
反向引物：CCAGGTTATCAGTCCTACCC(SEQ ID NO:21)
引物对D)，脑胞内原虫属18S
正向引物：CTGAGTCCTGAGTGTTAGATAAGA(SEQ ID NO:22)
反向引物：CTAATGCCAATCAATCCCGTG(SEQ ID NO:23)
引物对E)，脑胞内原虫属18S v2
正向引物：GTCCTTCGTGTTAGATAAGATATAAGTC(SEQ ID NO:24)
反向引物：AGATAATGCCAATCAATCCCATG(SEQ ID NO:25)
引物对F)，脑胞内原虫属18S v3
正向引物：GACGAAGATTGAGAGGTCTGA(SEQ ID NO:26)
反向引物：CTAATGCCTATCAATCCCGTG(SEQ ID NO:27)
引物对G)，比氏肠孢子虫18S
正向引物：GAGTGTAGTATAGACTGGCGAA(SEQ ID NO:28)
反向引物：TCGTCCTTGATCCTAAGATACG(SEQ ID NO:29)
引物对H)，蠕形住肠蛲虫ITS
正向引物：GCAGAGCTTTCCAAAATTTATTTCC(SEQ ID NO:30)
反向引物：CCCAAGTTTGAGGGTAATTTCTCG(SEQ ID NO:31)
引物对I)，阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1
正向引物：CCAGTTATTACTGGTGTAAGATTGAA(SEQ ID NO:32)
反向引物：TCAAGCATAACCTGACTCATATAC(SEQ ID NO:33)
引物对J)，阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1 v2
正向引物：CCAGTTATTACTGGTGTAAGATTGAA(SEQ ID NO:34)
反向引物：TCAAGCATAACCTGACTCATATAC(SEQ ID NO:35)
引物对K)，阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1 v3
正向引物：CCAGTTATTACAGGTGTGAGATTG(SEQ ID NO:36)
反向引物：CAAGCATAACCCGACTCGTA(SEQ ID NO:37)
引物对L)，阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1 v4
正向引物：CCAGTTATTACAGGTGTGAGATTG(SEQ ID NO:36)
反向引物：CAAGCATAACCCGACTCGTA(SEQ ID NO:37)
引物对M)，曼氏裂体吸虫cox1
正向引物：AGGTGTTTTCATGACTTTATATGTTGA(SEQ ID NO:38)
反向引物：AGCAGATGCAGATAAAGCCA(SEQ ID NO:39)
引物对N)，人芽囊原虫18S
正向引物：CAGCTTTCGATGGTAGTGTATTG(SEQ ID NO:40)
反向引物：GGCTCCCTCTCCGAAATC(SEQ ID NO:41)
引物对O)，人芽囊原虫18S v2
正向引物：TCAGCTTTCGATGGTAGTATATGG(SEQ ID NO:42)
反向引物：GGCTCCCTCTCCGAAATC(SEQ ID NO:43)
引物对P)，华支睾吸虫/后睾吸虫属/次睾吸虫属18S
正向引物：AGCTCGTAGTTGGATCTGG(SEQ ID NO:44)
反向引物：CCACCAATCATGCTAACACC(SEQ ID NO:45)
引物对Q)，十二指肠钩虫ITS.3.1
正向引物：CAGTGTAGCTTGTGGCAC(SEQ ID NO:48)
反向引物：CAGCTAACGTACATGTTGCAATA(SEQ ID NO:49)
引物对R)，十二指肠钩虫ITS.3.2
正向引物：ACAGTGCAGCTTGTGGCA(SEQ ID NO:50)
反向引物：CAGCCAACGTACATGTTGCAATA(SEQ ID NO:51)
本发明的方法的特征在于步骤iv)的PCR反应中每个引物对的扩增的靶序列(即产物)的存在以如下方式表明样品中存在肠道寄生虫：
-引物对A)或B)的产物表明存在短膜壳绦虫或缩小膜壳绦虫；
-引物对C)的产物表明存在布氏姜片虫；
-引物对D)、E)或F)的产物表明存在肠脑炎微孢子虫、家兔脑胞内原虫和脑细胞内原虫；
-引物对G)的产物表明存在比氏肠孢子虫；
-引物对H)的产物表明存在蠕形住肠蛲虫；
-引物对I)、J)、K)或L)的产物表明存在阔节裂头绦虫或日本海裂头绦虫；
-引物对M)的产物表明存在曼氏裂体吸虫；
-引物对N)或O)的产物表明存在人芽囊原虫；
-引物对P)的产物表明存在肝蠕虫，例如华支睾吸虫、后翅目虫属和梅托氏虫属；并且
-引物对Q)或R)的产物表明存在十二指肠钩虫。
优选地，所述引物对中的每个引物的长度小于25、30、35、40、45、50或55个核苷酸，并且更优选地长度小于50个核苷酸。本发明引物中的每一个还可以定义为包含存在于选自由SEQ ID NO:17-45和48-51组成的组的至少一种引物序列中的至少10、15、16、17或18个连续核苷酸或由其组成。本发明引物中的每一个可以进一步定义为与选自由SEQ ID NO:17-45和48-51组成的组的至少一种引物序列具有至少80％、85％或90％序列同一性。
本发明的一个具体实施方案是将所述方法作为实时聚合酶链反应进行，并且在这种情况下，包含以下序列或由以下序列组成的核酸探针以以下方式与引物对A)至T)中的每一个一起特别使用：
-引物对A)的探针：
5'-AGTGTGCTTAGGTTGTAGTGTGTGGGCTCATC-3'(SEQ ID NO:52)
-引物对B)的探针：
5'-TGTTTGCCATGTTTTCTATTGTTTGTTTAGG-3'(SEQ ID NO:53)
-引物对C)的探针：
5'-TTCGCCCATTCTTTGCCATTGCCC-3'(SEQ ID NO:54)
-引物对D)的探针：
5'-CTGATCCTGCTGCTGGTTCTCCAACAG-3'(SEQ ID NO:55)
-引物对E)的探针：
5'-ATGATCCTGCTAATGGTTCTCCAACAGCA-3'(SEQ ID NO:56)
-引物对F)的探针：
5'-ATGATCCTGCTAATGGTTCTCCAACAGCA-3'(SEQ ID NO:57)
-引物对G)的探针：
5'-AGTGTCGCCTTCGCCTCCGTTAG-3'(SEQ ID NO:58)
-引物对H)的探针：
5'-TCCGGCTCAGACATGAACATCAGTGAGTCT-3'(SEQ ID NO:59)
-引物对I)的探针：
5'-ACACGACGTGGTAAACCGCACACA-3'(SEQ ID NO:60)
-引物对J)的探针：
5'-ACACGACGTGGTAAACCGCACACA -3'(SEQ ID NO:61)
-引物对K)的探针：
5'-ACACGACGTGGTAAACCGCACACA -3'(SEQ ID NO:62)
-引物对L)的探针：
5'-ACACGACGTGGTAAACCGCACACA -3'(SEQ ID NO:63)
-引物对M)的探针：
5'-CCCCTGTGACACCACCAACCGT-3'(SEQ ID NO:64)
-引物对N)的探针：
5'-AAATTCTTCGTTACCCGTTACTGCCATGGT-3'(SEQ ID NO:65)
-引物对O)的探针：
5'-AAATTCTTCGTTACCCGTTACTGCCATGGT-3'(SEQ ID NO:66)
-引物对P)的探针：
5'-TTGCTCGTATTCCTGGCCTGGTTCA-3'(SEQ ID NO:67)
一些探针(例如引物对G)、H)、K)和L)的探针)的解链温度Tm优选通过添加修饰的核苷酸增加至少5℃。一个探针中修饰的核苷酸的数量为1、2、3或优选地4。上表中带下划线的核苷酸是修饰的核苷酸，每个核苷酸都增加了探针的Tm。修饰的核苷酸可以是LNA核苷酸(Exiqon A/S)、小沟结合剂(MGBTM)、超强碱或肽核酸(PNA)或任何其他增加探针Tm的修饰。
优选地，上述探针包含定义的序列并且长度小于25、30、35、40、45、50或55个核苷酸，并且更优选地长度小于50个核苷酸。本发明探针中的每一个也可以定义为包含存在于选自由SEQ ID NO:52-67或其互补序列组成的组的探针序列中的至少10或15、16、17或18个连续核苷酸或由其组成。
探针优选包括可检测标记，例如荧光团。荧光团的实施例是荧光素及其衍生物，例如6-羧基荧光素(FAM)和异硫氰酸荧光素(FITC)。根据探针的特定结构，可检测标记可在靶扩增子存在下产生信号，或在靶扩增子存在下导致信号减弱。
本发明的方法基于同时分析来自样品的许多模板的核酸的多重PCR技术，即多重PCR反应包括能够同时扩增多个靶序列的一组引物对。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含任何如上文所定义的探针序列或由其组成的核苷酸探针。
本发明优选涉及一种用于确定样品中肠道寄生虫的存在的方法，其中检测到至少一种以下病原体的存在：短膜壳绦虫、缩小膜壳绦虫、布氏姜片虫、脑胞内原虫属(诸如肠脑炎微孢子虫、家兔脑胞内原虫和脑细胞内原虫)、比氏肠孢子虫、蠕形住肠蛲虫、阔节裂头绦虫、日本海裂头绦虫、曼氏裂体吸虫、人芽囊原虫、十二指肠钩虫和肝蠕虫(诸如华支睾吸虫、后睾吸虫属和次睾吸虫属)。在优选的实施方案中，检测上文列出的肠道寄生虫的任何组合的存在。因此，所述肠道寄生虫中2、3、4、5、6、7、8或更多种的每种组合是本发明的优选的实施方案。
在一个优选的实施方案中，在所述方法中检测到至少短膜壳绦虫和缩小膜壳绦虫的存在，其中靶序列至少如SEQ ID NO:1和2所定义。更优选地，允许扩增至少部分所述靶序列的引物对集合包含SEQ ID NO:17、18和19中定义的序列的至少15个连续核苷酸或由其组成。
在一个优选的实施方案中，在所述方法中检测到至少布氏姜片虫的存在，其中靶序列至少如SEQ ID NO:3所定义。更优选地，允许扩增至少部分所述靶序列的引物对集合包含SEQ ID NO:20和21中定义的序列的至少15个连续核苷酸或由其组成。
在一个优选的实施方案中，在所述法中至少检测到脑胞内原虫属(诸如肠脑炎微孢子虫、家兔脑胞内原虫和脑细胞内原虫)的存在，其中靶序列至少如SEQ ID NO:4-6所定义。更优选地，允许扩增至少部分所述靶序列的引物对集合包含SEQ ID NO:22-27中定义的序列的至少15个连续核苷酸或由其组成。
在一个优选的实施方案中，在所述方法中检测到至少比氏肠孢子虫的存在，其中靶序列至少如SEQ ID NO:7所定义。更优选地，允许扩增至少部分所述靶序列的引物对集合包含SEQ ID NO:28和29中定义的序列的至少15个连续核苷酸或由其组成。
在一个优选的实施方案中，在所述方法中检测到至少蠕形住肠蛲虫的存在，其中靶序列至少如SEQ ID NO:8所定义。更优选地，允许扩增至少部分所述靶序列的引物对集合包含SEQ ID NO:30和31中定义的序列的至少15个连续核苷酸或由其组成。
在一个优选的实施方案中，在所述方法中检测到至少阔节裂头绦虫和日本海裂头绦虫的存在，其中靶序列至少如SEQ ID NO:9-12所定义。更优选地，允许扩增至少部分所述靶序列的引物对集合包含SEQ ID NO:32-37中定义的序列的至少15个连续核苷酸或由其组成。
在一个优选的实施方案中，在所述方法中检测到至少曼氏裂体吸虫的存在，其中靶序列至少如SEQ ID NO:13所定义。更优选地，允许扩增至少部分所述靶序列的引物对集合包含SEQ ID NO:38和39中定义的序列的至少15个连续核苷酸或由其组成。
在一个优选的实施方案中，在所述方法中检测到至少人芽囊原虫的存在，其中靶序列至少如SEQ ID NO:14和15所定义。更优选地，允许扩增至少部分所述靶序列的引物对集合包含SEQ ID NO:40-43中定义的序列的至少15个连续核苷酸或由其组成。
在一个优选的实施方案中，在所述方法中检测到至少肝蠕虫诸如华支睾吸虫、后睾吸虫属和次睾吸虫属的存在，其中靶序列至少如SEQ ID NO:16所定义。更优选地，允许扩增至少部分所述靶序列的引物对集合包含SEQ ID NO:44和45中定义的序列的至少15个连续核苷酸或由其组成。
在一个优选的实施方案中，在所述方法中检测到至少短膜壳绦虫、缩小膜壳绦虫肝蠕虫诸如华支睾吸虫、后睾吸虫属和次睾吸虫属的存在，其中靶序列至少如SEQ ID NO:1、2和16所定义。更优选地，允许扩增至少部分所述靶序列的引物对集合包含SEQ ID NO:17、18、19、44和45中定义的序列的至少15个连续核苷酸或由其组成。
在另一个优选的实施方案中，在所述方法中检测到至少比氏肠孢子虫、蠕形住肠蛲虫和曼氏裂体吸虫的存在，其中靶序列至少如SEQ ID NO:7、8和13所定义。更优选地，允许扩增至少部分所述靶序列的引物对集合包含SEQ ID NO:28、29、30、31、38和39中定义的序列的至少15个连续核苷酸或由其组成。
在一个优选的实施方案中，在所述方法中检测到至少十二指肠钩虫的存在，其中靶序列至少如SEQ ID NO:46和47所定义。更优选地，允许扩增至少部分所述靶序列的引物对集合包含SEQ ID NO:48-51中定义的序列的至少15个连续核苷酸或由其组成。
本发明还涉及如上定义的核苷酸引物、引物对或探针用于确定样品中肠道寄生虫的存在的用途。
本发明还提供了用于检测样品中肠道寄生虫的存在的试剂盒。这种试剂盒包含选自由如上定义的引物对组成的组的引物对。该试剂盒还可包含选自如上定义的探针的探针。上文和以下实施例中描述了引物对和探针的用途。优选地，所述试剂盒包含用于实时聚合酶链反应的工具，例如标记的探针、聚合酶、缓冲液和核苷酸。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管本公开的实践或测试中可以使用与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。
实施例1
该实施例描述了在专用多重qPCR测定中以下各项的检测的概念验证研究的结果：短膜壳绦虫、缩小膜壳绦虫、布氏姜片虫、脑胞内原虫属(诸如肠脑炎微孢子虫、家兔脑胞内原虫和脑细胞内原虫)、比氏肠孢子虫、蠕形住肠蛲虫、阔节裂头绦虫、日本海裂头绦虫、曼氏裂体吸虫、人芽囊原虫和肝蠕虫(诸如华支睾吸虫、后睾吸虫属和次睾吸虫属)。用于此设计的测定的样品材料是加标的粪便样品。
材料和方法
qPCR试剂：
Mobidiag’s qPCR Mastermix(MM)
由如表2中定义的寄生虫靶标特异性引物和如上文所定义的探针组成的测定混合物。
装置：
BIO-RAD CFX96
PCR设置
在反应中：
10μl 2 x MM
5μl 4 x引物混
合物
2μl样品/H2O
20μl
PCR方案：
通过标记的探针进行检测的两步qPCR。
样品：
在粪便背景中加标样品，代表上文列出的病原体。样品已从商业生物库(如ATCC)或Mobidiag样品存储设施中收集，并以一系列十倍样品稀释液进行分析。
结果
在高复用条件下，在所有样品浓度中均检测到所有靶标(图1-8)。
实施例2
该实施例描述了肠道寄生虫qPCR测定中由于交叉反应导致的潜在假阳性结果的研究结果。用于该设计的测定的样品材料优选地是粪便样品。因此，除了与胃肠道感染相关的寄生虫(细菌和病毒)以外的病原体(检测面板未涵盖)可能会导致潜在的交叉反应。此外，其他真核微生物可能会发生交叉反应。
材料和方法
qPCR试剂：
Mobidiag’s qPCR Mastermix(MM)
由如表2中定义的寄生虫靶标特异性引物和如上文所定义的探针组成的测定混合物。
装置：
BIO-RAD CFX96
PCR设置
在反应中：
10μl 2 x MM
5μl 4 x引物混
合物
2μl样品/H2O
20μl
PCR方案
通过标记的探针进行检测的两步qPCR：
样品：
总共61种活的或减毒的微生物或从不同微生物中提取的DNA样品(表3)。菌株主要从商业生物库(ATCC、DSMZ、Microbiologics Qnostics和Vircell)收集。所有样品均在高浓度(>108CFU/mL)下进行分析。
表3.交叉反应结果。
结果
交叉反应性测试显示没有假阳性(参见上表3)。
实施例3
对于实验，使用两组样品：一组(n＝8)已知的来自临床来源的脑胞内原虫属阳性样品(每名患者一个)和一组(n＝104)脑胞内原虫属阴性粪便样品。(参见表4)。通过将已知菌株以临床相关浓度掺入阴性粪便背景来制备阳性样品。总共运行120个Novodiag柱(Mobidiag，芬兰)。
样品定量
在CFX96qPCR仪器中将来自商业生物库(ATCC)的已知脑胞内原虫属样品相对于以10倍方式稀释的相同靶标的已知标准DNA样品进行定量。标准系列范围为200至200 000c/μL。通过将初级脑胞内原虫属样品以临床相关浓度(范围为100到80 000个细胞/mL)掺入eSwab-粪便-悬浮液来制备最终的“临床”样品。
样品分析
每个样品(阳性和阴性)都经过预处理并在Novodiag仪器中运行。
表4.样品
寡核苷酸
脑胞内原虫属测定混合物包含以下寡核苷酸：
脑胞内原虫属18S_F3.1(SEQ ID NO:22)
脑胞内原虫属18S_F3.2(SEQ ID NO:24)
脑胞内原虫属18S_F3.3(SEQ ID NO:26)
脑胞内原虫属18S_P2.1as
脑胞内原虫属18S_P2.2as
脑胞内原虫属18S_R2.1(SEQ ID NO:23)
脑胞内原虫属18S_R2.2(SEQ ID NO:25)
脑胞内原虫属18S_R2.3(SEQ ID NO:27)
结果
细胞计数近似的阳性样品结果呈现在下表5中：
1转换因子11来自在脑胞内原虫属细胞核中发现的18S基因的拷贝数。Biderre C,Peyretaillade E,Duffieux F,Peyret P,Méténier G,Vivarès C.家兔脑胞内原虫(微孢子虫)的rDNA单位：完整的23S序列和拷贝数(The rDNA Unit of Encephalitozooncuniculi(Microsporidia):Complete 23S Sequence and Copy Number.)《真核微生物杂志(J Eukaryot Microbiol.)》1997年11月至12月；44(6):76S。
2Graczyk TK,Johansson MA,Tamang L,Visvesvara GS,Moura LS,DaSilva AJ,Girouard AS,Matos O.通过多重荧光原位杂交对人类免疫缺陷病毒/AIDS患者的腹泻粪便样品中的微孢子虫孢子进行回顾性鉴定(Retrospective Species Identification ofMicrosporidian Spores in Diarrheic Fecal Samples from Human ImmunodeficiencyVirus/AIDS Patients by Multiplexed Fluorescence In Situ Hybridization.)《临床微生物学杂志(J Clin Microbiol.)》2007年4月；45(4):1255-60。
3Kahler AM,Thurston-Enriquez JA.农业样品中人类致病性微孢子虫检测：方法开发和评估(Human pathogenic microsporidia detection in agricultural samples:method development and assessment)《寄生虫研究(Parasitol Res.)》2007年2月；100(3):529-38。
最终结果汇总在下表6中：
用于用加标样品和脑胞内原虫属阴性粪便样品检测脑胞内原虫属的测定的总体敏感性和特异性分别为100％(95％CI 63.1–100％)和100％(95％CI 96.5–100％)。
总体阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)分别为100％(95％CI 63.1–100％)和100％(95％CI 96.5–100％)。
实施例4
该实验使用如SEQ ID NO:48-51中所述的十二指肠钩虫引物进行，并将结果与参考O&P显微镜方法进行比较。
最终结果为：
PLR＝阳性似然比。由于本研究未获得临床数据，因此似然比和正确性仅为估计值。
NLR＝阴性似然比。由于本研究未获得临床数据，因此似然比和正确性仅为估计值。
N/A＝由于灵敏度和特异性为100％而无法计算。
用于从未保存的粪便样品中检测十二指肠钩虫的NVD SP测定的总体敏感性和特异性分别为100％(95％CI 29.2–100％)和100％(95％CI 96.1–100％)。
总体PPV和NPV分别为100％(95％CI 29.2–100％)和100％(95％CI 96.1–100％)。
从样品集(1/96)中观察到一次无效运行，产生1％的无效率。
参考文献
Garcia,Lynne S.,Michael Arrowood,Evelyne Kokoskin,Graeme P.Paltridge,Dylan R.Pillai,Gary W.Procop,Norbert Ryan,Robyn Y.Shimizu,and GovindaVisvesvarab,Laboratory Diagnosis of Parasites from the GastrointestinalTract,Clinical Microbiology Reviews,January 2018,Volume 31,Issue 1,e00025-17.
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<110> 莫比蒂亚戈公司
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<130> MOBID3PCT
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<160> 67
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 125
<212> DNA
<213> 膜壳绦虫属（Hymenolepis）
<400> 1
aattcctgat gcttttgggt tttatggttt attatttgct atgttttcta tagtgtgctt 60
aggttgtagt gtgtgggctc atcatatgtt tactgttggt ttggatgtta agacggctgt 120
atttt 125
<210> 2
<211> 125
<212> DNA
<213> 膜壳绦虫属（Hymenolepis）
<400> 2
aattcctgat gcttttgggt tttatgggct cttgtttgcc atgttttcta ttgtttgttt 60
aggtagaagt gtttgagggc atcatatgtt tactgttggt ttagatgtaa agacggcagt 120
gttct 125
<210> 3
<211> 129
<212> DNA
<213> 布氏姜片虫（Fasciolopsis buski）
<400> 3
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ataacctgg 129
<210> 4
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<212> DNA
<213> 脑胞内原虫属（Encephalitozoon sp）
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<212> DNA
<213> 脑胞内原虫属（Encephalitozoon sp）
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gctgttggag aaccagcagc aggatcagta tttgagagat tggggggaat ttttttgatt 120
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<212> DNA
<213> 脑胞内原虫属（Encephalitozoon_sp_）
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<212> DNA
<213> 比氏肠孢子虫（Enterocytozoon bieneusi）
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<212> DNA
<213> 蠕形住肠蛲虫（Enterobius vermicularis）
<400> 8
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<212> DNA
<213> 阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫（Diphyllobothrium latum/nihonkaiense）
<400> 9
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<210> 10
<211> 156
<212> DNA
<213> 阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫（Diphyllobothrium latum/nihonkaiense）
<400> 10
ccagttatta ctggtgtaag attgaataag tatttactac aatgtcattg tatagtttct 60
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<210> 11
<211> 156
<212> DNA
<213> 阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫（Diphyllobothrium latum/nihonkaiense）
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<210> 12
<211> 156
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<213> 阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫（Diphyllobothrium latum/nihonkaiense）
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<210> 13
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<212> DNA
<213> 曼氏裂体吸虫（Schistosoma mansoni）
<400> 13
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<212> DNA
<213> 人芽囊原虫（Blastocystis hominis）_
<400> 14
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<212> DNA
<213> 人芽囊原虫（Blastocystis hominis）
<400> 15
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<212> DNA
<213> 华支睾吸虫/后睾吸虫属/次睾吸虫属（C.sinensis / Opistothorchis sp. /Metorchis sp.）
<400> 16
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<213> 膜壳绦虫属（Hymenolepis）
<400> 17
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<212> DNA
<213> 膜壳绦虫属（Hymenolepis）
<400> 18
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<211> 24
<212> DNA
<213> 膜壳绦虫属（Hymenolepis）
<400> 19
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<213> 布氏姜片虫（Fasciolopsis buski）
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cactgttcaa gtggtattga ttg 23
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<211> 20
<212> DNA
<213> 布氏姜片虫（Fasciolopsis buski）
<400> 21
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<211> 24
<212> DNA
<213> 脑胞内原虫属（Encephalitozoon sp）
<400> 22
ctgagtcctg agtgttagat aaga 24
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 脑胞内原虫属（Encephalitozoon sp）
<400> 23
ctaatgccaa tcaatcccgt g 21
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 脑胞内原虫属（Encephalitozoon sp）
<400> 24
gtccttcgtg ttagataaga tataagtc 28
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 脑胞内原虫属（Encephalitozoon sp）
<400> 25
agataatgcc aatcaatccc atg 23
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 脑胞内原虫属（Encephalitozoon sp）
<400> 26
gacgaagatt gagaggtctg a 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 脑胞内原虫属（Encephalitozoon sp）
<400> 27
ctaatgccta tcaatcccgt g 21
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 比氏肠孢子虫（Enterocytozoon bieneusi）
<400> 28
gagtgtagta tagactggcg aa 22
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 比氏肠孢子虫（Enterocytozoon bieneusi）
<400> 29
tcgtccttga tcctaagata cg 22
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 蠕形住肠蛲虫（Enterobius vermicularis）
<400> 30
gcagagcttt tccaaaattt atttcc 26
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 蠕形住肠蛲虫（Enterobius vermicularis）
<400> 31
cccaagtttg aggtaatttc tcg 23
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫（Diphyllobothrium latum/nihonkaiense）
<400> 32
ccagttatta ctggtgtaag attgaa 26
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫（Diphyllobothrium latum/nihonkaiense）
<400> 33
tcaagcataa cctgactcat atac 24
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫（Diphyllobothrium latum/nihonkaiense）
<400> 34
ccagttatta ctggtgtaag attgaa 26
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫（Diphyllobothrium latum/nihonkaiense）
<400> 35
tcaagcataa cctgactcat atac 24
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫（Diphyllobothrium latum/nihonkaiense）
<400> 36
ccagttatta caggtgtgag attg 24
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫（Diphyllobothrium latum/nihonkaiense）
<400> 37
caagcataac ccgactcgta 20
<210> 38
<211> 27
<212> DNA
<213> 曼氏裂体吸虫（Schistosoma mansoni）
<400> 38
aggtgttttc atgactttat atgttga 27
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 曼氏裂体吸虫（Schistosoma mansoni）
<400> 39
agcagatgca gataaagcca 20
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人芽囊原虫（Blastocystis hominis）
<400> 40
cagctttcga tggtagtgta ttg 23
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人芽囊原虫（Blastocystis hominis）
<400> 41
ggctccctct ccgaaatc 18
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人芽囊原虫（Blastocystis hominis）
<400> 42
tcagctttcg atggtagtat atgg 24
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人芽囊原虫（Blastocystis hominis）
<400> 43
ggctccctct ccgaaatc 18
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 华支睾吸虫/后睾吸虫属/次睾吸虫属（C.sinensis / Opistothorchis sp. /Metorchis sp.）
<400> 44
agctcgtagt tggatctgg 19
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 华支睾吸虫/后睾吸虫属/次睾吸虫属（C.sinensis / Opistothorchis sp. /Metorchis sp.）
<400> 45
ccaccaatca tgctaacacc 20
<210> 46
<211> 259
<212> DNA
<213> 十二指肠钩虫（Ancylostoma duodenale）
<400> 46
cccatgagac atacaaaaag gtaatgccgc cgtctggttc agggttgttt atatctacta 60
cagtgtagct tgtggcactg tttgtcgaac ggcacttgct tttagcgatt cccgttctag 120
atcagaatat attgcaacat gtacgttagc tggctagttt gctaacgtgc gctgaatgac 180
agcaaactcg ttgttgctgc tgaatcgttc accgacttta gaacgtttcg ggtctcgact 240
atacgcccgt tttcggatc 259
<210> 47
<211> 241
<212> DNA
<213> 十二指肠钩虫（Ancylostoma duodenale）
<400> 47
cccatgagac atacaaaaag gtaatgccgc ctatatctac tacagtgcag cttgtggcac 60
tgtttgtcga acggcacttg cttttagcga ttcccgttct agatcagaat atattgcaac 120
atgtacgttg gctggctagt ttgctaacgt gcgctgaatg acagcaaact cgttgttgct 180
gctgaatcgt ttaccgactt tagaacgttt cgggtctcga ctatacgccc gttttcggat 240
c 241
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 十二指肠钩虫（Ancylostoma duodenale）
<400> 48
cagtgtagct tgtggcac 18
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 十二指肠钩虫（Ancylostoma duodenale）
<400> 49
cagctaacgt acatgttgca ata 23
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 十二指肠钩虫（Ancylostoma duodenale）
<400> 50
acagtgcagc ttgtggca 18
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 十二指肠钩虫（Ancylostoma duodenale）
<400> 51
cagccaacgt acatgttgca ata 23
<210> 52
<211> 32
<212> DNA
<213> 短膜壳绦虫（Hymenolepis nana）
<400> 52
agtgtgctta ggttgtagtg tgtgggctca tc 32
<210> 53
<211> 31
<212> DNA
<213> 缩小膜壳绦虫（Hymenolepis diminuta）
<400> 53
tgtttgccat gttttctatt gtttgtttag g 31
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> 布氏姜片虫（Fasciolopsis buski）
<400> 54
ttcgcccatt ctttgccatt gccc 24
<210> 55
<211> 27
<212> DNA
<213> 肠脑炎微孢子虫（E. intestinalis）
<400> 55
ctgatcctgc tgctggttct ccaacag 27
<210> 56
<211> 29
<212> DNA
<213> 家兔脑胞内原虫（E. cuniculi）
<400> 56
atgatcctgc taatggttct ccaacagca 29
<210> 57
<211> 29
<212> DNA
<213> 脑细胞内原虫（E. hellem）
<400> 57
atgatcctgc taatggttct ccaacagca 29
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 比氏肠孢子虫（Enterocytozoon bieneusi）
<400> 58
agtgtcgcct tcgcctccgt tag 23
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 蠕形住肠蛲虫（Enterobius vermicularis）
<400> 59
tccggctcag acatgaacat cagtgagtct 30
<210> 60
<211> 24
<212> DNA
<213> 阔节裂头绦虫（Diphyllobothrium latum）
<400> 60
acacgacgtg gtaaaccgca caca 24
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 阔节裂头绦虫（Diphyllobothrium latum）
<400> 61
acacgacgtg gtaaaccgca caca 24
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> 阔节裂头绦虫（Diphyllobothrium latum）
<400> 62
acacgacgtg gtaaaccgca caca 24
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 日本海裂头绦虫（Diphyllobothrium nihonkaiense）
<400> 63
acacgacgtg gtaaaccgca caca 24
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 曼氏裂体吸虫（Schistosoma mansoni）
<400> 64
cccctgtgac accaccaacc gt 22
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人芽囊原虫（Blastocystis hominis）
<400> 65
aaattcttcg ttacccgtta ctgccatggt 30
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人芽囊原虫（Blastocystis hominis）
<400> 66
aaattcttcg ttacccgtta ctgccatggt 30
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> 华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）
<400> 67
ttgctcgtat tcctggcctg gttca 25
Claims (24)
1.用于确定生物样品中一种或多种肠道寄生虫的存在的方法，其包括以下步骤：
i)在扩增测定中使所述样品或从所述样品中分离的核酸与寡核苷酸引物接触，以提供用于核酸扩增的反应混合物；
ii)使用从步骤i)中获得的包含来自所述生物样品的DNA作为模板的所述反应混合物进行核酸扩增反应，使得只要所述一种或多种肠道寄生虫的靶序列存在于所述样品中，所述序列就被特异性扩增；和
iii)检测所述反应混合物中扩增的靶序列的存在，其中所述靶序列的存在表明所述样品中存在肠道寄生虫；
其中所述一种或多种肠道寄生虫选自由以下组成的组：短膜壳绦虫、缩小膜壳绦虫、布氏姜片虫、脑胞内原虫属(诸如肠脑炎微孢子虫、家兔脑胞内原虫和脑细胞内原虫)、比氏肠孢子虫、蠕形住肠蛲虫、阔节裂头绦虫、日本海裂头绦虫、曼氏裂体吸虫、人芽囊原虫、十二指肠钩虫和肝蠕虫诸如华支睾吸虫、后睾吸虫属和次睾吸虫属；
其中所述一种或多种靶序列选自由如SEQ ID NO:1-16和46-47所定义的序列组成的组，并且其中所述寡核苷酸引物包含与由如SEQ ID NO:1-16和46-47定义的靶序列之一结合的引物对并且允许在步骤ii)中扩增至少部分所述靶序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤i)中，使所述样品或从所述样品中分离的核酸与一个或多个引物对接触，所述一个或多个引物对包含以下序列中的一个或若干个的至少15个连续核苷酸或由其组成：
引物对A)，膜壳绦虫属cox1
正向引物：AATTCCTGATGCTTTTGGGTTTTATG(SEQ ID NO:17)
反向引物：AGAACACTGCCGTCTTTACATCTAA(SEQ ID NO:18)
引物对B)，膜壳绦虫属cox1、v2
正向引物：AATTCCTGATGCTTTTGGGTTTTATG(SEQ ID NO:17)
反向引物：AAATACAGCCGTCTTAACATCCAA(SEQ ID NO:19)
引物对C)，布氏姜片虫ITS1
正向引物：CACTGTTCAAGTGGTATTGATTG(SEQ ID NO:20)
反向引物：CCAGGTTATCAGTCCTACCC(SEQ ID NO:21)
引物对D)，脑胞内原虫属18S
正向引物：CTGAGTCCTGAGTGTTAGATAAGA(SEQ ID NO:22)
反向引物：CTAATGCCAATCAATCCCGTG(SEQ ID NO:23)
引物对E)，脑胞内原虫属18S v2
正向引物：GTCCTTCGTGTTAGATAAGATATAAGTC(SEQ ID NO:24)
反向引物：AGATAATGCCAATCAATCCCATG(SEQ ID NO:25)
引物对F)，脑胞内原虫属18S v3
正向引物：GACGAAGATTGAGAGGTCTGA(SEQ ID NO:26)
反向引物：CTAATGCCTATCAATCCCGTG(SEQ ID NO:27)
引物对G)，比氏肠孢子虫18S
正向引物：GAGTGTAGTATAGACTGGCGAA(SEQ ID NO:28)
反向引物：TCGTCCTTGATCCTAAGATACG(SEQ ID NO:29)
引物对H)，蠕形住肠蛲虫ITS
正向引物：GCAGAGCTTTCCAAAATTTATTTCC(SEQ ID NO:30)
反向引物：CCCAAGTTTGAGGGTAATTTCTCG(SEQ ID NO:31)
引物对I)，阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1
正向引物：CCAGTTATTACTGGTGTAAGATTGAA(SEQ ID NO:32)
反向引物：TCAAGCATAACCTGACTCATATAC(SEQ ID NO:33)
引物对J)，阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1 v2
正向引物：CCAGTTATTACTGGTGTAAGATTGAA(SEQ ID NO:34)
反向引物：TCAAGCATAACCTGACTCATATAC(SEQ ID NO:35)
引物对K)，阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1 v3
正向引物：CCAGTTATTACAGGTGTGAGATTG(SEQ ID NO:36)
反向引物：CAAGCATAACCCGACTCGTA(SEQ ID NO:37)
引物对L)，阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1 v4
正向引物：CCAGTTATTACAGGTGTGAGATTG(SEQ ID NO:36)
反向引物：CAAGCATAACCCGACTCGTA(SEQ ID NO:37)
引物对M)，曼氏裂体吸虫cox1
正向引物：AGGTGTTTTCATGACTTTATATGTTGA(SEQ ID NO:38)
反向引物：AGCAGATGCAGATAAAGCCA(SEQ ID NO:39)
引物对N)，人芽囊原虫18S
正向引物：CAGCTTTCGATGGTAGTGTATTG(SEQ ID NO:40)
反向引物：GGCTCCCTCTCCGAAATC(SEQ ID NO:41)
引物对O)，人芽囊原虫18S v2
正向引物：TCAGCTTTCGATGGTAGTATATGG(SEQ ID NO:42)
反向引物：GGCTCCCTCTCCGAAATC(SEQ ID NO:43；
引物对P)，华支睾吸虫/后睾吸虫属/次睾吸虫属18S
正向引物：AGCTCGTAGTTGGATCTGG(SEQ ID NO:44)
反向引物：CCACCAATCATGCTAACACC(SEQ ID NO:45；
引物对Q)，十二指肠钩虫ITS.3.1
正向引物：CAGTGTAGCTTGTGGCAC(SEQ ID NO:48)
反向引物：CAGCTAACGTACATGTTGCAATA(SEQ ID NO:49)；和
引物对R)，十二指肠钩虫ITS.3.2
正向引物：ACAGTGCAGCTTGTGGCA(SEQ ID NO:50)
反向引物：CAGCCAACGTACATGTTGCAATA(SEQ ID NO:51)
其中所述一个或多个引物对与由如SEQ ID No:1-16和46-47定义的靶序列中的至少一个结合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中使所述样品或从所述样品中分离的核酸与引物接触，所述引物各自包含存在于如SEQ ID NO:17-45所示的核苷酸序列中的至少15个连续核苷酸或由其组成。
4.根据权利要求3所述的方法，其中每个所述核酸引物由存在于如SEQ ID NO:17-45所示的核苷酸序列中的至少15个连续核苷酸组成。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述PCR反应中每个引物对的扩增的靶序列即产物的存在以如下方式表明在所述样品中存在肠道病原体：
-引物对A)或B)的产物表明存在短膜壳绦虫或缩小膜壳绦虫；
-引物对C)的产物表明存在布氏姜片虫；
-引物对D)、E)或F)的产物表明存在肠脑炎微孢子虫、家兔脑胞内原虫和脑细胞内原虫；
-引物对G)的产物表明存在比氏肠孢子虫；
-引物对H)的产物表明存在蠕形住肠蛲虫；
-引物对I)、J)、K)或L)的产物表明存在阔节裂头绦虫或日本海裂头绦虫；
-引物对M)的产物表明存在曼氏裂体吸虫；
-引物对N)或O)的产物表明存在人芽囊原虫；
-引物对P)的产物表明存在肝蠕虫，例如华支睾吸虫、后翅目虫属和梅托氏虫属；并且
-引物对Q)或R)的产物表明存在十二指肠钩虫。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述生物样品为粪便样品或食物样品，优选为粪便样品。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述引物包含引物对的序列，并且所述引物对的每个引物的长度小于30个核苷酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述方法是作为实时聚合酶链反应进行的多重PCR测定，并且包含以下序列或由其组成的核酸探针只要存在于所述反应中就与每个引物对一起特异性地使用：
-引物对A)的探针：
5'-AGTGTGCTTAGGTTGTAGTGTGTGGGCTCATC-3'(SEQ ID NO:52)
-引物对B)的探针：
5'-TGTTTGCCATGTTTTCTATTGTTTGTTTAGG-3'(SEQ ID NO:53)
-引物对C)的探针：
5'-TTCGCCCATTCTTTGCCATTGCCC-3'(SEQ ID NO:54)
-引物对D)的探针：
5'-CTGATCCTGCTGCTGGTTCTCCAACAG-3'(SEQ ID NO:55)
-引物对E)的探针：
5'-ATGATCCTGCTAATGGTTCTCCAACAGCA-3'(SEQ ID NO:56)
-引物对F)的探针：
5'-ATGATCCTGCTAATGGTTCTCCAACAGCA-3'(SEQ ID NO:57)
-引物对G)的探针：
5'-AGTGTCGCCTTCGCCTCCGTTAG-3'(SEQ ID NO:58)
-引物对H)的探针：
5'-TCCGGCTCAGACATGAACATCAGTGAGTCT-3'(SEQ ID NO:59)
-引物对I)的探针：
5'-ACACGACGTGGTAAACCGCACACA-3'(SEQ ID NO:60)
-引物对J)的探针：
5'-ACACGACGTGGTAAACCGCACACA -3'(SEQ ID NO:61)
-引物对K)的探针：
5'-ACACGACGTGGTAAACCGCACACA-3'(SEQ ID NO:62)
-引物对L)的探针：
5'-ACACGACGTGGTAAACCGCACACA-3'(SEQ ID NO:63)
-引物对M)的探针：
5'-CCCCTGTGACACCACCAACCGT-3'(SEQ ID NO:64)
-引物对N)的探针：
5'-AAATTCTTCGTTACCCGTTACTGCCATGGT-3'(SEQ ID NO:65)
-引物对O)的探针：
5'-AAATTCTTCGTTACCCGTTACTGCCATGGT-3'(SEQ ID NO:66)，和
-引物对P)的探针：
5'-TTGCTCGTATTCCTGGCCTGGTTCA-3'(SEQ ID NO:67)，
或其互补序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述核酸探针中的每一个由存在于如SEQ ID NO:52-67所示的核苷酸序列中的至少一个中的至少10个连续核苷酸组成。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测到的肠道寄生虫至少为短膜壳绦虫、缩小膜壳绦虫和肝蠕虫华支睾吸虫、后睾吸虫属和次睾吸虫属，其中所述寡核苷酸引物包括与如SEQ ID No:1、2和16所定义的靶序列结合的引物对，并允许在步骤ii)中扩增至少部分所述靶序列。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述引物对包含以下序列的至少15个连续核苷酸或由其组成：
引物对A)，膜壳绦虫属cox1
正向引物：AATTCCTGATGCTTTTGGGTTTTATG(SEQ ID NO:17)
反向引物：AGAACACTGCCGTCTTTACATCTAA(SEQ ID NO:18)
引物对B)，膜壳绦虫属cox1、v2
正向引物：AATTCCTGATGCTTTTGGGTTTTATG(SEQ ID NO:17)
反向引物：AAATACAGCCGTCTTAACATCCAA(SEQ ID NO:19)；和
引物对P)，华支睾吸虫/后睾吸虫属/次睾吸虫属18S
正向引物：AGCTCGTAGTTGGATCTGG(SEQ ID NO:44)
反向引物：CCACCAATCATGCTAACACC(SEQ ID NO:45。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测到的肠道寄生虫至少为比氏肠孢子虫、蠕形住肠蛲虫和曼氏裂体吸虫，其中所述寡核苷酸引物包括与如SEQ ID No:7、8和13所定义的靶序列结合的引物对，并允许在步骤ii)中扩增至少部分所述靶序列。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述引物对包含以下序列的至少15个连续核苷酸或由其组成：
引物对G)，比氏肠孢子虫18S
正向引物：GAGTGTAGTATAGACTGGCGAA(SEQ ID NO:28)
反向引物：TCGTCCTTGATCCTAAGATACG(SEQ ID NO:29)
引物对H)，蠕形住肠蛲虫ITS
正向引物：GCAGAGCTTTCCAAAATTTATTTCC(SEQ ID NO:30)
反向引物：CCCAAGTTTGAGGGTAATTTCTCG(SEQ ID NO:31)
引物对M)，曼氏裂体吸虫cox1
正向引物：AGGTGTTTTCATGACTTTATATGTTGA(SEQ ID NO:38)
反向引物：AGCAGATGCAGATAAAGCCA(SEQ ID NO:39。
14.引物对用于检测样品中的肠道寄生虫的用途，其中所述引物对的引物包含以下序列中的任一种或由其组成：
引物对A)，膜壳绦虫属cox1
正向引物：AATTCCTGATGCTTTTGGGTTTTATG(SEQ ID NO:17)
反向引物：AGAACACTGCCGTCTTTACATCTAA(SEQ ID NO:18)
引物对B)，膜壳绦虫属cox1、v2
正向引物：AATTCCTGATGCTTTTGGGTTTTATG(SEQ ID NO:17)
反向引物：AAATACAGCCGTCTTAACATCCAA(SEQ ID NO:19)
引物对C)，布氏姜片虫ITS1
正向引物：CACTGTTCAAGTGGTATTGATTG(SEQ ID NO:20)
反向引物：CCAGGTTATCAGTCCTACCC(SEQ ID NO:21)
引物对D)，脑胞内原虫属18S
正向引物：CTGAGTCCTGAGTGTTAGATAAGA(SEQ ID NO:22)
反向引物：CTAATGCCAATCAATCCCGTG(SEQ ID NO:23)
引物对E)，脑胞内原虫属18S v2
正向引物：GTCCTTCGTGTTAGATAAGATATAAGTC(SEQ ID NO:24)
反向引物：AGATAATGCCAATCAATCCCATG(SEQ ID NO:25)
引物对F)，脑胞内原虫属18S v3
正向引物：GACGAAGATTGAGAGGTCTGA(SEQ ID NO:26)
反向引物：CTAATGCCTATCAATCCCGTG(SEQ ID NO:27)
引物对G)，比氏肠孢子虫18S
正向引物：GAGTGTAGTATAGACTGGCGAA(SEQ ID NO:28)
反向引物：TCGTCCTTGATCCTAAGATACG(SEQ ID NO:29)
引物对H)，蠕形住肠蛲虫ITS
正向引物：GCAGAGCTTTCCAAAATTTATTTCC(SEQ ID NO:30)
反向引物：CCCAAGTTTGAGGGTAATTTCTCG(SEQ ID NO:31)
引物对I)，阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1
正向引物：CCAGTTATTACTGGTGTAAGATTGAA(SEQ ID NO:32)
反向引物：TCAAGCATAACCTGACTCATATAC(SEQ ID NO:33)
引物对J)，阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1 v2
正向引物：CCAGTTATTACTGGTGTAAGATTGAA(SEQ ID NO:34)
反向引物：TCAAGCATAACCTGACTCATATAC(SEQ ID NO:35)
引物对K)，阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1 v3
正向引物：CCAGTTATTACAGGTGTGAGATTG(SEQ ID NO:36)
反向引物：CAAGCATAACCCGACTCGTA(SEQ ID NO:37)
引物对L)，阔节裂头绦虫/日本海裂头绦虫cox1 v4
正向引物：CCAGTTATTACAGGTGTGAGATTG(SEQ ID NO:36)
反向引物：CAAGCATAACCCGACTCGTA(SEQ ID NO:37)
引物对M)，曼氏裂体吸虫cox1
正向引物：AGGTGTTTTCATGACTTTATATGTTGA(SEQ ID NO:38)
反向引物：AGCAGATGCAGATAAAGCCA(SEQ ID NO:39)
引物对N)，人芽囊原虫18S
正向引物：CAGCTTTCGATGGTAGTGTATTG(SEQ ID NO:40)
反向引物：GGCTCCCTCTCCGAAATC(SEQ ID NO:41)
引物对O)，人芽囊原虫18S v2
正向引物：TCAGCTTTCGATGGTAGTATATGG(SEQ ID NO:42)
反向引物：GGCTCCCTCTCCGAAATC(SEQ ID NO:43)
引物对P)，华支睾吸虫/后睾吸虫属/次睾吸虫属18S
正向引物：AGCTCGTAGTTGGATCTGG(SEQ ID NO:44)
反向引物：CCACCAATCATGCTAACACC(SEQ ID NO:45)；
引物对Q)，十二指肠钩虫ITS.3.1
正向引物：CAGTGTAGCTTGTGGCAC(SEQ ID NO:48)
反向引物：CAGCTAACGTACATGTTGCAATA(SEQ ID NO:49)；和
引物对R)，十二指肠钩虫ITS.3.2
正向引物：ACAGTGCAGCTTGTGGCA(SEQ ID NO:50)
反向引物：CAGCCAACGTACATGTTGCAATA(SEQ ID NO:51)；
其中所述检测是多重PCR测定。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述样品是粪便样品或食物样品。
16.一种核苷酸引物，其包含SEQ ID NO:17-45和48-51中所示的任何引物序列的至少15个连续核苷酸或由其组成。
17.一种核苷酸引物对集合，其包含来自如SEQ ID NO:17-45和48-51中定义的任何引物的序列的至少15个连续核苷酸或由其组成，其中所述引物对集合扩增如SEQ ID No:1-16和46-47定义的至少一种靶序列。
18.根据权利要求17所述的核苷酸引物对集合，其包含如SEQ ID NO:17、18、19、44和45所定义的序列的至少15个连续核苷酸或由其组成，其中所述引物对集合包括与如SEQ IDNo:1、2和16定义的靶序列结合的引物，并允许扩增至少部分所述靶序列。
19.根据权利要求17所述的核苷酸引物对集合，其包含如SEQ ID NO:28、29、30、31、38和39所定义的序列的至少15个连续核苷酸或由其组成，其中所述引物对集合包括与如SEQID No:7、8和13定义的靶序列结合的引物对，并允许扩增至少部分所述靶序列。
20.一种核苷酸探针，由如SEQ ID NO:52-67所示的任何探针序列或其互补序列组成。
21.根据权利要求16-20中任一项所定义的核苷酸引物、引物对或探针用于确定样品中肠道寄生虫的存在的用途。
22.一种用于确定样品中肠道寄生虫的存在的试剂盒，其中所述试剂盒包含根据权利要求16所述的核苷酸引物、根据权利要求17-19中任一项所述的核苷酸引物对或根据权利要求20所述的核苷酸探针。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其包括选自由以下组成的组的其他PCR试剂组分：聚合酶、核苷酸、缓冲液、盐、去污剂和/或其他添加剂。
24.根据权利要求22或23所述的试剂盒，其还包括一种或多种对照引物、探针或核苷酸序列。
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