CN103773861A - 华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光pcr检测试剂、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光pcr检测试剂、试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法，所述检测试剂是针对以华支睾吸虫ITS1基因和广州管圆线虫ITS2基因的保守片段为靶目标的两组组分，两组组分各自包括一对特异性引物、一条特异性探针和一条内标探针。试剂盒包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、DEPC-H2O、阳性质控品、阴性质控品和假病毒内标溶液；PCR混合液中含有检测试剂。检测方法包括：总DNA提取、反应组分配制、扩增、结果判定。本发明的试剂和试剂盒特异性强、灵敏度高、无污染、高通量、可对食品中肉眼不可见的寄生虫幼虫进行准确检测，检测方法快速、特异、敏感、可同时检测大量样品。

Description

华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法。 
背景技术
华支睾吸虫（Clonorchis sinensis），又称肝吸虫，成虫寄生于肝的胆管内，可引起华支睾吸虫病（clonorchiasis），又称肝吸虫病。曾在中国、日本、韩国、菲律宾、新加坡和马来西亚、俄罗斯等国有华支睾吸虫感染的报道。近年来，由于食物的多样化和国外饮食习惯的引入，本病在我国的感染率逐步增高，人群感染率从1～30%不等。根据全国首次寄生虫病调查表明，全国感染率平均为0.356%，以此推算，全国大约有470万感染者。其主要原因是食生鱼的习惯所致。据1988年的调查资料表明在黑龙江佳木斯地区的麦穗鱼感染率也为100%；在台湾省日月潭地区，上述两种小鱼华支睾吸虫囊蚴的感染率甚至高达100%。华支睾吸虫囊蚴主要分布在鱼体的各部分，如肌肉、皮、头、鳃、鳍及鳞等，一般以鱼肌肉最多，尤其在鱼体中部的背部和尾部较多。也可因鱼的种属不同，囊蚴的分布亦不同。除淡水鱼外，淡水虾如细足米虾、巨掌沼虾等也可有囊蚴寄生，因此，水产品、特别是淡水鱼中囊蚴的检测已经成为食品 安全的首要问题。 
广州管圆线虫病是一种新发食源性人畜共患传染病。人们由于误食带疫福寿螺、田螺、环棱螺等贝类，导致了本病的频繁暴发。到目前为止仍没有从中间宿主中检测广州管圆线虫的报道。 
传统的华支睾吸虫和广州管圆线虫检测仍停留在人工分离、显微镜检查、专家鉴定等阶段，但检测周期长、且灵敏度极低等缺点不能被广泛应用。 
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、无污染、高通量、可对低含量华支睾吸虫感染宿主和广州管圆线虫感染宿主进行准确检测的华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂、华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂盒。 
本发明进一步要解决的问题在于，提供一种快速、特异、敏感、可同时检测大量样品的华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测检测方法。 
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 
一种华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂，所述检测试剂包括华支睾吸虫检测组分、广州管圆线虫检测组分和内标序列检测组分； 
其中，华支睾吸虫检测组分是针对以华支睾吸虫ITS1基因的保守片 
段为靶目标的，包括： 
引物：CS-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′CS-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′ 
探针：CS-Pb229：5′-CTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAG-3′； 
所述华支睾吸虫ITS1基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为： 
CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTCTTGCAGCATTGTCTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAGTTCCGTCATGTTCTACATGTATGTTCCGCATGCATGCTG； 
所述广州管圆线虫检测组分包括： 
广州管圆线虫检测组分是针对以广州管圆线虫ITS2基因的保守片段为靶目标的，包括： 
引物：Can-PF：5′-CGCATGATATTAAAAGACGTTGCT-3′ 
      Can-PR：5′-GTAAACGCACAAAACGCACG-3′ 
探针：Can-Pb：5′-CCGCGGCGCATTCGACCAT-3′； 
所述广州管圆线虫ITS2基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为： 
CGCATGATATTAAAAGACGTTGCTGCCGCGGCGCATTCGACCATGGCTTGTCGTCGGCTGTCGAATGGTGGCGTGCGTTTTGTGCGTTTAC； 
所述内标序列检测组分包括： 
IC-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′ 
IC-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′； 
IC-PB：5′-CTCTCTCGCTCGCAACGATCGTCG-3′ 
用于制作假病毒内标的扩增目标核苷酸序列为： 
CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTCTTGCAGCATTGTCTCTCTCGCTCGCAACGATCGTCGTTCCGTCATGTTCTACATGTATGTTCCGCATGCATGCTG； 
所述华支睾吸虫检测组分的探针和广州管圆线虫检测组分的探针以及内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述华支睾吸虫检测组分的探针和广州管圆线虫检测组分的探针以及内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团。 
所述的华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂，所述华 支睾吸虫检测组分的探针5′端标记的荧光报告基团是FAM、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述广州管圆线虫检测组分的探针5′端标记的荧光报告基团是HEX、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是ROX、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ2。 
一种华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂盒，包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、DEPC-H2O、阳性质控品、阴性质控品和假病毒内标溶液；其中，所述PCR混合液中包含华支睾吸虫检测组分、广州管圆线虫检测组分和内标序列检测组分： 
其中，华支睾吸虫检测组分是针对以华支睾吸虫ITS1基因的保守片 
段为靶目标的，包括： 
引物：CS-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′ 
      CS-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′ 
探针：CS-Pb229：5′-CTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAG-3′； 
所述华支睾吸虫ITS1基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为： 
CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTCTTGCAGCATTGTCTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAGTTCCGTCATGTTCTACATGTATGTTCCGCATGCATGCTG； 
所述广州管圆线虫检测组分包括： 
广州管圆线虫检测组分是针对以广州管圆线虫ITS2基因的保守片段为靶目标的，包括： 
引物：Can-PF：5′-CGCATGATATTAAAAGACGTTGCT-3′ 
      Can-PR：5′-GTAAACGCACAAAACGCACG-3′ 
探针：Can-Pb：5′-CCGCGGCGCATTCGACCAT-3′； 
所述广州管圆线虫ITS2基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为： 
CGCATGATATTAAAAGACGTTGCTGCCGCGGCGCATTCGACCATGGCTTGTCGTCGGCTGTCGAATGGTGGCGTGCGTTTTGTGCGTTTAC； 
所述的内标序列检测组分包括： 
内标引物：IC-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′ 
          IC-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′ 
内标探针：5′-CTCTCTCGCTCGCAACGATCGTCG-3′； 
所述假病毒内标溶液中含有：内标核苷酸序列制作的假病毒； 
用于制作假病毒的内标扩增核苷酸序列为： 
CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTCTTGCAGCATTGTCTCTCTCGCTCGCAACGATCGTCGTTCCGTCATGTTCTACATGTATGTTCCGCATGCATGCTG； 
所述华支睾吸虫检测组分的探针和广州管圆线虫检测组分的探针以及内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述华支睾吸虫检测组分的探针和广州管圆线虫检测组分的探针以及内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团。 
所述的华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂盒中，所述华支睾吸虫检测组分的探针5′端标记的荧光报告基团是FAM、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述广州管圆线虫检测组分的探针5′端标记的荧光报告基团是HEX、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是ROX、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ2。 
所述的华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂盒中各种试剂的含量优选为： 
Figure BDA0000456254680000051
Figure BDA0000456254680000061
一种华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测方法，采用上述试剂和试剂盒，检测方法包括以下步骤： 
（1）、总DNA提取：在待测样品中加入假病毒内标溶液后，提取待测样品的DNA，得到模板DNA溶液； 
（2）、反应组分配制：分别配制检测物、阳性对照物和阴性对照物，其中，加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、模板DNA溶液和DEPC-H2O制成检测物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、阳性质控品和DEPC-H2O制成阳性对照物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、阴性质控品和DEPC-H2O制成阴性对照物； 
（3）、扩增：分别将检测物、阳性对照物和阴性对照物放入荧光PCR仪进行扩增，首先95℃预变性3min，95℃下变性10sec，在60℃下退火延伸45sec，采集荧光信号，进行40个PCR循环； 
（4）结果判定：根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果。 
所述的华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测方法，所述步骤（4）中，判定结果的标准为： 
Ct值＞40.0或无扩增曲线，表示样品中无华支睾吸虫和广州管圆线虫； 
FAM信号Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在华支睾 吸虫； 
HEX信号Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在广州管圆线虫； 
Ct值在35.0-40.0之间的重做检测，重做结果Ct值大于40.0或无扩增曲线者为阴性，否则为阳性。 
本发明的检测试剂选用了针对华支睾吸虫ITS1基因和广州管圆线虫ITS2基因各自的保守片段的引物和探针，与常规的PCR相比较，采用这种引物和探针的检测试剂具有快速、特异、敏感、无污染、高通量、且可同时检测大量样品的特性。本发明的试剂尤其可对样品中低含量的华支睾吸虫和广州管圆线虫感染宿主进行准确检测，是一种用于检测华支睾吸虫和广州管圆线虫感染的良好试剂，本试剂可对分泌物、血液、组织等多种样品中的华支睾吸虫和广州管圆线虫进行快速检测，样品适用范围广，没有生物安全隐患，使用安全的优点。 
本发明的试剂盒将进行荧光定量PCR检测的各种试剂置放在一个试剂盒中，其中试剂盒中的试剂---PCR混合液含有针对华支睾吸虫ITS1基因和广州管圆线虫ITS2基因的保守片段进行检测的特殊引物和探针，含有该引物和探针的PCR混合液与其他试剂配合，可在收到样品后2小时内做出定性检测结果，快速、便捷。该荧光定量PCR试剂盒是一种检测临床样品中华支睾吸虫和广州管圆线虫的敏感和可靠的试剂盒。 
本发明的试剂和试剂盒将靶基因DNA序列包裹在假病毒内代替常规的质粒作为阳性质控品（假病毒内标），解决了质粒质控品容易降解和污染的问题。而且本发明使用了假病毒内标溶液作为内标质控品对提取和检测过程进行监 控，可以有效避免样本中抑制物或操作不当等原因引起的假阴性结果，大大提高了检测结果的可靠性。本发明在检疫、诊断、分子流行病学研究具有重要的实际应用价值。 
本发明的检测方法采用具有特性的检测试剂和试剂盒，该方法可以减少DNA或PCR产物污染的风险，比常规PCR快速，无需扩增后的电泳分析。克服了常规PCR和巢式产生的产物须电泳检测、费时、不敏感的缺点。与常规PCR相比，本发明的荧光定量PCR可以作出客观的估计，对检测样品能进行出阳性、阴性和可疑的准确判定。其中Ct值为40.00可确定为阳性和阴性的临界值（cut-off)。 
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中： 
图1是本发明实施例的扩增曲线。 
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。 
一种华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂，所述检测试剂包括华支睾吸虫检测组分和广州管圆线虫检测组分； 
其中，华支睾吸虫检测组分是针对以华支睾吸虫ITS1基因的保守片 
段为靶目标的，包括： 
引物：序列1CS-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′ 
      序列2CS-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′ 
探针：序列3CS-Pb229：5′-CTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAG-3′； 
所述华支睾吸虫ITS1基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列（序列4）为：CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTCTTGCAGCATTGTCTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAGTTCCGTCATGTTCTACATGTATGTTCCGCATGCATGCTG； 
所述广州管圆线虫检测组分包括： 
广州管圆线虫检测组分是针对以广州管圆线虫ITS2基因的保守片段为靶目标的，包括： 
引物：序列5Can-PF：5′-CGCATGATATTAAAAGACGTTGCT-3′ 
      序列6Can-PR：5′-GTAAACGCACAAAACGCACG-3′ 
探针：序列7Can-Pb：5′-CCGCGGCGCATTCGACCAT-3′； 
所述广州管圆线虫ITS2基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列（序列8）为：CGCATGATATTAAAAGACGTTGCTGCCGCGGCGCATTCGACCATGGCTTGTCGTCGGCTGTCGAATGGTGGCGTGCGTTTTGTGCGTTTAC； 
所述内标序列检测组分包括： 
内标引物：序列9IC-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′ 
          序列10IC-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′； 
内标探针：序列11IC-PB：5′-CTCTCTCGCTCGCAACGATCGTCG-3′ 
用于制作假病毒的内标扩增核苷酸序列（序列12）为： 
CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTCTTGCAGCATTGTCTCTCTCGCTCGCAACGATCGTCGTTCCGTCATGTTCTACATGTATGTTCCGCATGCATGCTG； 
所述华支睾吸虫检测组分的探针和广州管圆线虫检测组分的探针以及内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述华支睾吸虫检测组分的探针和广州管圆线虫检测组分的探针以及内标探针的3′端有用淬灭荧光染料 标记的荧光淬灭基团。 
所述的华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂，所述华支睾吸虫检测组分的探针5′端标记的荧光报告基团是FAM、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述广州管圆线虫检测组分的探针5′端标记的荧光报告基团是HEX、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是ROX、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ2。 
一种华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂盒，包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、DEPC-H2O、阳性质控品、阴性质控品和假病毒内标溶液； 
其中所述PCR混合液中包含华支睾吸虫检测组分和广州管圆线虫检测组分： 
其中，华支睾吸虫检测组分是针对以华支睾吸虫ITS1基因的保守片 
段为靶目标的，包括： 
引物：序列1CS-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′ 
      序列2CS-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′ 
探针：序列3CS-Pb229：5′-CTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAG-3′； 
所述华支睾吸虫ITS1基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列（序列4）为：CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTCTTGCAGCATTGTCTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAGTTCCGTCATGTTCTACATGTATGTTCCGCATGCATGCTG； 
所述广州管圆线虫检测组分包括： 
广州管圆线虫检测组分是针对以广州管圆线虫ITS2基因的保守片段为靶目标的，包括： 
引物：序列5Can-PF：5′-CGCATGATATTAAAAGACGTTGCT-3′ 
      序列6Can-PR：5′-GTAAACGCACAAAACGCACG-3′ 
探针：序列7Can-Pb：5′-CCGCGGCGCATTCGACCAT-3′； 
所述广州管圆线虫ITS2基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列（序列8）为：CGCATGATATTAAAAGACGTTGCTGCCGCGGCGCATTCGACCATGGCTTGTCGTCGGCTGTCGAATGGTGGCGTGCGTTTTGTGCGTTTAC； 
所述内标序列检测组分包括： 
内标引物：序列9IC-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′ 
          序列10IC-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′； 
内标探针：序列11IC-PB：5′-CTCTCTCGCTCGCAACGATCGTCG-3′ 
所述假病毒内标溶液中含有：内标核苷酸序列制作的假病毒； 
用于制作假病毒的内标扩增核苷酸序列（序列12）为： 
CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTCTTGCAGCATTGTCTCTCTCGCTCGCAACGATCGTCGTTCCGTCATGTTCTACATGTATGTTCCGCATGCATGCTG； 
所述华支睾吸虫检测组分和广州管圆线虫检测组分的探针以及内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述华支睾吸虫检测组分和广州管圆线虫检测组分的探针以及内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团。 
所述的华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂盒，所述华支睾吸虫检测组分的探针5′端标记的荧光报告基团是FAM、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述广州管圆线虫检测组分的探针5′端标记的荧光报告基团是HEX、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是ROX、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ2。 
所述检测试剂盒中各种试剂的含量为： 
Figure BDA0000456254680000121
一种华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测方法，采用上述试剂和试剂盒，检测方法包括以下步骤： 
（1）、总DNA提取：在待测样品中加入假病毒内标溶液后，提取待测样品的DNA，得到模板DNA溶液； 
（2）、反应组分配制：分别配制检测物、阳性对照物和阴性对照物，其中，加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、模板DNA溶液和DEPC-H2O制成检测物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、阳性质控品和DEPC-H2O制成阳性对照物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、阴性质控品和DEPC-H2O制成阴性对照物； 
（3）、扩增：分别将检测物、阳性对照物和阴性对照物放入PCR仪进行扩增，首先95℃预变性3min，95℃下变性10sec，在60℃下退火延伸45sec，采集荧光信号，进行40个PCR循环； 
（4）结果判定：根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果。 
所述的华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测方法，所述步骤（4）中，判定结果的标准为： 
Ct值＞40.0或无扩增曲线，表示样品中无华支睾吸虫和广州管圆线虫； 
FAM信号Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在华支睾吸虫； 
HEX信号Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在广州管圆线虫； 
Ct值在35.0-40.0之间的重做检测，重做结果Ct值大于40.0或无扩增曲线者为阴性，否则为阳性。 
以下通过具体的实施例对于检测试剂、检测试剂盒和检测方法进行详细描述。 
一、本发明中同时检测华支睾吸虫和广州管圆线虫，因此分别以华支睾吸虫ITS1基因和广州管圆线虫ITS2基因的保守片段为靶目标， 
其中，华支睾吸虫ITS1基因片段的扩增目标核苷酸序列（序列4）为： 
CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTCTTGCAGCATTGTCTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAGTTCCGTCATGTTCTACATGTATGTTCCGCATGCATGCTGC； 
所述广州管圆线虫ITS2基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列（序列8）为： 
CGCATGATATTAAAAGACGTTGCTGCCGCGGCGCATTCGACCATGGCTTGTCGTCGGCTGTCGAATGGTGGCGTGCGTTTTGTGCGTTTAC； 
对华支睾吸虫ITS1基因和广州管圆线虫ITS2基因DNA假病毒表达质粒的构建： 
按照《分子克隆实验指南第三版》，进行华支睾吸虫ITS1基因和广州管圆线虫ITS2基因克隆和测序，将ITS1和ITS2部分序列（含扩增序列）分别克隆至M13噬菌体克隆载体M13mp18的多克隆位点处，构建假病毒表达载体，分别命名为M13-CS和M13-Can，该方法为常规技术，在此不再赘述。 
二、引物和探针的设计和制备： 
针对上述华支睾吸虫ITS1基因和广州管圆线虫ITS2基因的保守片段，应用primer Express软件和primer prepre5.0软件设计引物和探针： 
其中，针对以华支睾吸虫ITS1基因的保守片段为靶目标的华支睾吸虫检测组分包括： 
引物：序列1CS-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′ 
      序列2CS-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′ 
探针：序列3CS-Pb229：5′-CTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAG-3′； 
以广州管圆线虫ITS2基因的保守片段为靶目标的广州管圆线虫检测组分中包括： 
引物：序列5Can-PF：5′-CGCATGATATTAAAAGACGTTGCT-3′ 
      序列6Can-PR：5′-GTAAACGCACAAAACGCACG-3′ 
探针：序列7Can-Pb：5′-CCGCGGCGCATTCGACCAT-3′； 
上述引物、探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成，在探针合成同时进行两端荧光标记。设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选后，初步定候选引物和探针。 
引物和探针检测试剂的制备和选择： 
检测试剂的制备都采用常规技术手段，在此不再赘述。本发明通过检测样品用标准样品及一系列经过稀释的引物和探针样品，选用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的引物和探针终浓度，采用矩阵法优选引物探针的最佳浓度，制成引物和探针溶液，该溶液作为检测试剂。 
本发明上述引物和探针是经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验， 并经过大量的临床样本的评估才得到的，该引物和探针具有高扩增效率和特异性好的特点。 
三、内标溶液的制备： 
根据以下内标序列制备假病毒内部标准品（简称假病毒内标）：制成假病毒内标溶液用于对病毒样本的核酸提取和PCR检测过程进行监控。 
用于制备假病毒的内标扩增核苷酸序列（序列12）为： 
CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTCTTGCAGCATTGTCTCTCTCGCTCGCAACGATCGTCGTTCCGTCATGTTCTACATGTATGTTCCGCATGCATGCTG；； 
内标引物：序列9IC-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′ 
          序列10IC-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′； 
内标探针：序列11IC-PB：5′-CTCTCTCGCTCGCAACGATCGTCG-3′ 
所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是ROX，所述内标探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ2。内标引物和内标探针的设计同引物和探针，在此不再赘述。 
人工合成假病毒内标DNA序列，将此序列克隆至载体M13mp18的多克隆位点处，构建的质粒名称为M13-CS。转化大肠杆菌JM109，通过液体培养得到假病毒内标溶液并测定浓度，该技术为常规技术，在此不再赘述。将假病毒内标溶液稀释至103Copies/mL，作为工作液。 
四、试剂盒： 
本发明的试剂盒包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、DEPC-H2O、阳性质控品、阴性质控品和假病毒内标溶液。 
其中，PCR混合液：具体参见引物和探针设计和制备，其余为常规技术，在此不再赘述。 
Taq DNA聚合酶、DEPC-H2O为现有技术。 
阳性质控品：采用靶基因DNA序列包裹在假病毒内代替常规的质粒作为阳性质控品。将构建好的质粒M13-CS-Can转化大肠杆菌JM109。观察转化的平板，挑取白斑，接种于OD值为1.0的JM109LB液体培养基中，230rpm，37℃，培养5h；收集培养的菌液，5000rpm，离心10min，转移上清至新的离心管中。对假病毒溶液进行10倍梯度稀释，各取10μL病毒稀释液涂布大肠杆菌平板，通过噬菌斑计数的方法计算假病毒原液的浓度，从而获得阳性质控品。 
阴性质控品：采用水为阴性对照。 
本实施例中，试剂盒组成(25μL反应×50次)：根据上述试验结果，按照反应条件优选、对比试验和验证试验确定的反应条件，配制如下试剂盒组份： 
Figure BDA0000456254680000161
一种华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测方法，具体包括以下步骤： 
（1）、总DNA提取：在待测样品中加入假病毒内标溶液后，提取待测样品的DNA，得到模板DNA溶液； 
本实施例中，每个待测样品加入10μL假病毒内标溶液，采用酚/氯仿核酸抽提法提取DNA，用无DEPC水溶解总DNA；具体提取方法参照李永明主编 《实用分子生物学方法手册》，科学出版社(1998第166-168页。也可从生物试剂公司购买商品化的动物组织基因DNA提取和纯化试剂盒，提取样品DNA。（2）、反应组分配制：分别配制检测物、阳性对照物和阴性对照物，其中，加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、模板DNA溶液和DEPC-H2O制成检测物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、阳性质控品和DEPC-H2O制成阳性对照物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、阴性质控品和DEPC-H2O制成阴性对照物； 
本实施例中，取一支0.2mL光学PCR反应管，反应总体积为25μL，向反应管中加下列反应物： 
Figure BDA0000456254680000171
上述阳性对照和阴性对照各设置2管。 
（3）、扩增：分别将检测管、阳性对照管和阴性对照管放入PCR仪进行扩增，首先95℃预变性3min，95℃下变性10sec，在60℃下退火延伸45sec，采集荧光信号，进行40个PCR循环； 
（4）结果判定：根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果。 
直接读取检测结果，基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。 
当内标检测结果的Ct值小于35或者靶基因检测结果为阳性时结果有效。若内标检测和靶基因检测结果均为阴性时，结果无效，需重复此样本的检测，。具体判定结果的标准为： 
Ct值＞40.0或无扩增曲线，表示样品中无华支睾吸虫和广州管圆线虫； 
FAM信号Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在华支睾吸虫； 
HEX信号Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在广州管圆线虫； 
Ct值在35.0-40.0之间的重做检测，重做结果Ct值大于40.0或无扩增曲线者为阴性，否则为阳性。 
阴性对照无Ct值，并且无扩增曲线，一直为水平线。 
阳性对照的Ct值应小于30.0，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照扩增曲线基本重合，特别是在Threshold(荧光临界值)附近。否则此次实验视为无效。 
内标探针与靶基因检测探针是非竞争性的，阳性样品的检测得到如图1所示的扩增曲线。 
特异性比较检测试验： 
用华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR对华支睾吸虫、广州管圆线虫、卫氏并殖吸虫、猪弓形虫、日本血吸虫、布氏姜片吸虫以及正常的野外采集的组织样品进行特异性比较检测。 
在每份待检样本中加入10μL假病毒内标溶液，采用QIAGEN的DNA提取试剂盒提取样品的基因组DNA，根据用华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR标准化试剂和检测程序，配制相应的反应液对样品DNA进行上机检测，具体步骤同上，在此不再赘述。 
结果分析：实验结果如下表所示，华支睾吸虫和广州管圆线虫样本的检测结果为阳性，Ct值为28.3内标为32.4，其余样品的检测结果均为阴性。 
Figure BDA0000456254680000191
从上述试验结果可以看出：华支睾吸虫和广州管圆线虫样品的检测结果为阳性，华支睾吸虫Ct值为28.3，广州管圆线虫Ct值为27.3，内标为32.4，其余样品的检测结果均为阴性。本发明的试剂和试剂盒具有良好的特异性。 
测量精密度： 
配制三个批次试剂盒，分别用107copies/ml和103copies/ml2个浓度水平的样本各重复检测6次，计算Ct值的平均值和变异系数（CV,%）。根据用华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR标准化试剂和检测程序，配制相应的反应液对样品DNA进行上机检测，具体步骤同上，在此不再赘述。 
结果分析： 
Figure BDA0000456254680000192
从实验结果可看出高低两个浓度的检测结果的批间和批内变异系数基本都在1％左右，表明本实验建立的方法具有较好的稳定性和重复性。 
灵敏度试验： 
分别处理华支睾吸虫和广州管圆线虫1、2、4、8条囊蚴，再提取DNA上机检测。每组实验各做8份平行。结果显示所有样本的检测结果均为阳性，Ct值随囊蚴条数的增加逐渐降低。 
Figure IDA0000456254750000021
Figure IDA0000456254750000051
Figure IDA0000456254750000071

Claims (7)

1.一种华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括华支睾吸虫检测组分、广州管圆线虫检测组分和内标序列检测组分；
其中，华支睾吸虫检测组分是针对以华支睾吸虫 ITS1基因的保守片段为靶目标的，包括：
引物：CS-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′
CS-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′
探针： CS-Pb229：5′-CTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAG-3′；
所述华支睾吸虫 ITS1基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为：
CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTCTTGCAGCATTGTCTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAGTTCCGTCATGTTCTACATGTATGTTCCGCATGCATGCTG；
所述广州管圆线虫检测组分包括：
广州管圆线虫检测组分是针对以广州管圆线虫ITS2基因的保守片段为靶目标的，包括：
引物：Can-PF：5′-CGCATGATATTAAAAGACGTTGCT-3′
Can-PR：5′-GTAAACGCACAAAACGCACG-3′
探针：Can-Pb：5′-CCGCGGCGCATTCGACCAT-3′；
所述广州管圆线虫 ITS2基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为：
CGCATGATATTAAAAGACGTTGCTGCCGCGGCGCATTCGACCATGGCTTGTCGTCGGCTGTCGAATGGTGGCGTGCGTTTTGTGCGTTTAC；
所述内标序列检测组分包括：
内标引物：IC-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′
IC-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′；
内标探针：IC-PB：5′-CTCTCTCGCTCGCAACGATCGTCG-3′
用于制作假病毒内标的扩增核苷酸序列为：
CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTCTTGCAGCATTGTCTCTCTCGCTCGCAACGATCGTCGTTCCGTCATGTTCTACATGTATGTTCCGCATGCATGCTG；
所述华支睾吸虫检测组分的探针和广州管圆线虫检测组分的探针以及内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述华支睾吸虫检测组分的探针和广州管圆线虫检测组分的探针以及内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂，其特征在于，所述华支睾吸虫检测组分的探针5′端标记的荧光报告基团是FAM、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述广州管圆线虫检测组分的探针5′端标记的荧光报告基团是HEX、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是ROX、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ2。
3. 一种华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、DEPC-H2O、阳性质控品、阴性质控品和假病毒内标溶液；
其中，所述PCR混合液中包含华支睾吸虫检测组分、广州管圆线虫检测组分和内标序列检测组分：
其中，华支睾吸虫检测组分是针对以华支睾吸虫 ITS1基因的保守片段为靶目标的，包括：
引物：CS-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′
CS-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′
探针： CS-Pb229：5′-CTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAG-3′；
所述华支睾吸虫 ITS1基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为：
CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTCTTGCAGCATTGTCTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAGTTCCGTCATGTTCTACATGTATGTTCCGCATGCATGCTG；
所述广州管圆线虫检测组分是针对以广州管圆线虫ITS2基因的保守片段为靶目标的，包括：
引物：Can-PF：5′-CGCATGATATTAAAAGACGTTGCT-3′
Can-PR：5′-GTAAACGCACAAAACGCACG-3′
探针：Can-Pb：5′-CCGCGGCGCATTCGACCAT-3′；
所述广州管圆线虫 ITS2基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为：
CGCATGATATTAAAAGACGTTGCTGCCGCGGCGCATTCGACCATGGCTTGTCGTCGGCTGTCGAATGGTGGCGTGCGTTTTGTGCGTTTAC；
所述的内标序列检测组分包括：
内标引物：IC-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′
IC-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′
内标探针：5′-CTCTCTCGCTCGCAACGATCGTCG-3′；
所述假病毒内标溶液中含有：内标核苷酸序列制作的假病毒；
用于制作假病毒的内标扩增核苷酸序列为：
CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTCTTGCAGCATTGTCTCTCTCGCTCGCAACGATCGTCGTTCCGTCATGTTCTACATGTATGTTCCGCATGCATGCTG；
所述华支睾吸虫检测组分的探针和广州管圆线虫检测组分的探针以及内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述华支睾吸虫检测组分的探针和广州管圆线虫检测组分的探针以及内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述华支睾吸虫检测组分的探针5′端标记的荧光报告基团是FAM、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述广州管圆线虫检测组分的探针5′端标记的荧光报告基团是HEX、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是ROX、3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ2。
5.根据权利要求4所述的华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中各种试剂的含量为：
PCR混合液                               400μL
Taq DNA聚合酶（5U/μL）           25μL
DEPC-H2O                                  1mL
阳性质控品                                1.2mL
阴性质控品                                1.2mL
假病毒内标溶液                           500μL。
6.一种华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，采用权利要求3的试剂盒，检测方法包括以下步骤：
（1）、总DNA提取：在待测样品中加入假病毒内标溶液后，提取待测样品的DNA，得到模板DNA溶液；
（2）、反应组分配制：分别配制检测物、阳性对照物和阴性对照物，其中，加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、模板DNA溶液和DEPC-H2O制成检测物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、阳性质控品和DEPC-H2O制成阳性对照物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、阴性质控品和DEPC-H2O制成阴性对照物；
（3）、扩增：分别将检测物、阳性对照物和阴性对照物放入PCR仪进行扩增， 首先95℃预变性3min，95℃下变性10sec，在60℃下退火延伸45sec，采集荧光信号，进行40个PCR循环；
（4）结果判定：根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果。
7.根据权利要求6所述的华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中，判定结果的标准为：
Ct值＞40.0或无扩增曲线，表示样品中无华支睾吸虫和广州管圆线虫；
FAM信号Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在华支睾吸虫；
HEX信号Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在广州管圆线虫；
Ct值在35.0-40.0之间的重做检测，重做结果Ct值大于40.0或无扩增曲线者为阴性，否则为阳性。
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