CN105132538A - 一种检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重pcr扩增试剂盒及其扩增引物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重PCR扩增试剂盒及其扩增引物，包括PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液包括：Tris-HCl？10mmol/L，KCl？50mmol/L，MgCl2？1.5mmol/L，dNTPs？0.64mmol/L，简单异尖线虫正、反向扩增引物0.32μmol/L，华支睾吸虫囊蚴正、反向扩增引物0.32μmol/L，简单异尖线虫DNA模板10-24ng/μL，华支睾吸虫囊蚴DNA模板10-24ng/μL，Taq酶1U/μL。本发明不但保持了较高的特异性和敏感性，而且更加方便、快捷和经济，一次反应可检测两个基因。<!-- 2 -->

Description

一种检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重PCR扩增试剂盒及其扩增引物
技术领域
本发明涉及一种寄生虫检测试剂盒，特别涉及一种检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重PCR扩增试剂盒及其扩增引物。
背景技术
随着吃海鲜、生鱼片等饮食时尚的兴起和渔业、旅游业的发展，食源性寄生虫病已成为我国的新“富贵病”，我国城镇居民特别是沿海经济发达地区的感染人数呈上升势头。据调查，由于市场开放，鱼类、肉类等食品供应渠道增加，城乡食品卫生监督难以跟上，疫区鱼类、活畜及畜产品大量流入非疫区，加上风行的生、冷猎奇的饮食方式，寄生虫病可能出现在生食生鲜水产品的人群中。因此有必要开展对生鲜水产品中主要食源性寄生虫感染现状调查，并研究寄生虫快速、准确、灵敏的病原鉴别方法，用于规范水产品生产和流通，保障居民餐桌上的鱼虾肉食品安全健康。
华支睾吸虫囊蚴主要存在于淡水鱼种，简单异尖线虫存在于海水鱼种，生鲜淡海水鱼均可能加工成鱼肉，淡海鱼种无法区分，此时直接运用生食，且加工刀具存在互相交叉污染的可能，鱼肉中存在同时感染这两种致病虫种的可能。目前，华支睾吸虫的鉴定方法还没有统一的标准，目前对华支睾吸虫囊蚴的诊断依赖于显微镜检查。众所周知，显微镜检查耗费时间长，检查效率低，对检查者临床工作经验要求较高，而且对于与华支睾吸虫亲缘关系相近的囊蚴，虫卵形态相似，普通光镜无法区分，使用这种方法往往会出现误判。免疫诊断法虽然较显微镜检查法效率高，但也常常为灵敏度和特异性所局限。此外，简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴一般都是分开检测的，耗时长，检测成本高。多重PCR可以同时检测两种病原生物，但传统的多重PCR体系中，由于存在多对引物，引物之间的干扰以及引物与模板的错配而造成灵敏度下降与非特异性扩增反应增加等问题，制约多重PCR技术的发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重PCR扩增试剂盒，不但保持了较高的特异性和敏感性，而且更加方便、快捷和经济，一次反应可检测两个基因。
本发明还提供了上述检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重PCR扩增引物。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重PCR扩增试剂盒，包括PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液包括：Tris-HCl10mmol/L，KCl50mmol/L，MgCl21.5mmol/L，dNTPs0.64mmol/L，简单异尖线虫正向扩增引物0.32μmol/L，简单异尖线虫反向扩增引物0.32μmol/L，华支睾吸虫囊蚴正向扩增引物0.32μmol/L，华支睾吸虫囊蚴反向扩增引物0.32μmol/L，简单异尖线虫DNA模板10-24ng/μL，华支睾吸虫囊蚴DNA模板10-24ng/μL，Taq酶1U/μL。
本发明以华支睾吸虫囊蚴和简单异尖线虫的核糖体DNA内转录区(18SrRNA,ITS-1,5.8SrRNA,ITS-2,28SrRNA)序列为目标，专门设计了针对性的两对特异性引物，引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既提高检测速度降又降低了检验成本。进一步的设计了检测试剂盒，检测结果特异，结果易判断，灵敏度高，特异性强，检测快速、准确、经济，为华支睾吸虫和简单异尖线虫同时感染的诊治和预防提供有效的技术手段。
作为优选，所述简单异尖线虫正向扩增引物序列为：5'-CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT-3'(SEQIDNO.1)。
作为优选，所述简单异尖线虫反向扩增引物序列为：5'-CCCTACGAAATGGCATACTTG-3'(SEQIDNO.2)。
作为优选，所述华支睾吸虫囊蚴正向扩增引物序列为：5'-ATGCTCTCGGTATGCTCGCTT-3'(SEQIDNO.3)。
作为优选，所述华支睾吸虫囊蚴反向扩增引物序列为：5'-GTCGTACCCGGGATAAGGCA-3'(SEQIDNO.4)。
作为优选，所述Tris-HCl的pH为8.3。
一种检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重PCR扩增引物，包括简单异尖线虫扩增引物和华支睾吸虫囊蚴扩增引物，所述简单异尖线虫扩增引物包括简单异尖线虫正向扩增引物和简单异尖线虫反向扩增引物，所述简单异尖线虫正向扩增引物序列为：5'-CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT-3'，所述简单异尖线虫反向扩增引物序列为：5'-CCCTACGAAATGGCATACTTG-3'，所述华支睾吸虫囊蚴正向扩增引物序列为：5'-ATGCTCTCGGTATGCTCGCTT-3'，所述华支睾吸虫囊蚴反向扩增引物序列为：5'-GTCGTACCCGGGATAAGGCA-3'。采用本发明设计的特异性扩增引物，引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既提高检测速度降又降低了检验成本。
本发明的有益效果是：
1、引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既提高检测速度降又降低了检验成本。
2、与常规PCR相比，本发明的双重PCR不但保持了较高的特异性和敏感性，而且更加方便、快捷和经济，一次反应可检测两个基因。
附图说明
图1是简单异尖线虫单重PCR结果，图中：M：DL2000DNAMarker；1：阴性对照；2：简单异尖线虫DNA；3-5：鲭鱼鱼肉DNA。
图2是华支睾吸虫囊蚴单重PCR结果，图中：M：DL2000DNAMarker；1：阴性对照；2：华支睾吸虫囊蚴DNA；3-4：麦穗鱼鱼肉DNA。
图3是双重PCR检测结果，图中：M：DL2000DNAMarker；1：阴性对照；2：简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴DNA；3-5：伪地新线虫DNA、刺激隐核虫和棘颚口线虫DNA；6-7：鲭鱼鱼肉DNA和麦穗鱼鱼肉DNA。
图4是敏感性试验结果，图中：M：DL2000DNAMarker；1：阴性对照；2：50ng/μL混合虫DNA；3：5ng/μL混合虫DNA；4：500pg/μL混合虫DNA；5：50pg/μL混合虫DNA；6：5pg/μL混合虫DNA；7：0.5pg/μL混合虫DNA；8：0.05pg/μL混合虫DNA。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
本发明实施如下：
1、材料与方法
1.1材料：
囊蚴和华支睾吸虫DNA阳性对照来源：2013年5月底采集舟山市场上销售的麦穗鱼，用消化法从鱼肉组织中分离获得华支睾吸虫囊蚴。简单异尖线虫、伪地新线虫、刺激隐核虫和棘颚口线虫由舟山出入境检验检疫局提供。
dNTPs、Taq酶均购自大连宝生物公司。
1.2方法
1.2.1囊蚴的分离
将麦穗鱼用清水洗净，去除鱼头、鱼尾、鱼鳍、鱼刺及内脏,将鱼肉用绞肉机加工成肉泥，放入玻璃杯。按每克鱼肉加入10mL人工胃液(盐酸浓度为8mL/L，胃蛋白酶浓度8g/L，氯化钠浓度为9g/L)，37℃孵箱作用2h，将消化完全的鱼肉消化液经80目分离筛过滤集中于2L的分液漏斗中沉淀0.5h，放出约300mL的消化液至500mL的烧杯中，沉淀10-30min后，弃去上面的浊液，用清水反复清洗至液体清亮，随后将含虫体的液体转移至15mL尖底离心管内，沉淀1min后将含囊蚴的上清液体吸至另一新管内，反复沉淀几次，显微镜下检查囊蚴纯净度。将剩余的囊蚴保存在Alsever’s溶液(Alsever'sSolution，市售)中，置于4℃冰箱备用。
1.2.2囊蚴的形态学和DNA提取
取少量上述收集到的囊蚴置于显微镜下观察，并对其进行了形态学鉴定。随后按照TakarauniversalGenomicDNAExtractionkit(市售，购自大连宝生物公司)说明书中提供的方法提取囊蚴的基因组DNA。
简单异尖线虫基因组DNA按照TakarauniversalGenomicDNAExtractionkit说明书中提供的方法进行DNA的提取，作为对照的伪地新线虫、刺激隐核虫和棘颚口线虫基因组DNA也参照TakarauniversalGenomicDNAExtractionkit说明书中提供的方法进行DNA的提取。
上述提取到基因组DNA的测定核酸浓度后保存于-20℃备用。
1.2.3引物设计与合成
参考Genbank上公布的华支睾吸虫囊蚴和简单异尖线虫的核糖体DNA内转录区(18SrRNA,ITS-1,5.8SrRNA,ITS-2,28SrRNA)序列，应用MegAlign软件将几种线虫的序列进行比对，分析内转录区序列中的各种线虫相互之间的相同区域和不同区域，从而进行特异性引物的设计，最后由生工生物(上海)有限公司合成。
在PCR引物设计中除了按常规PCR引物设计通用准则外，要求引物与靶基因具有高度的特异性，引物之间彼此无同源性，不会出现交叉错配、引物二聚体等。设计的扩增片段一般在150bp以上，不同扩增产物长度差最好在50bp以上。同时，设计的量对引物退火温度都要相近。所设计的引物见表1(其中，ANF为简单异尖线虫正向扩增引物，ANR为简单异尖线虫反向扩增引物，CSF为华支睾吸虫囊蚴正向扩增引物，CSR为华支睾吸虫囊蚴反向扩增引物)：
表1华支睾吸虫囊蚴和简单异尖线虫PCR扩增引物
1.2.4单重PCR反应
20μL的PCR反应体系中组分如下：
pH8.3的Tris-HCl10mmol/L，KCl50mmol/L，MgCl21.5mmol/L，dNTPs0.64mmol/L，正向引物0.32μmol/L，反向引物0.32μmol/L，DNA模板(1.2.2节提取获得)10-24ng/μL，Taq酶1U/μL，ddH2O补足至20μL。
简单异尖线虫单重PCR引物采用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。华支睾吸虫囊蚴单重PCR引物采用SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。
简单异尖线虫PCR检测扩增程序：94℃5min→94℃30sec，53.6℃30sec，72℃1min，30个循环→72℃10min。
华支睾吸虫囊蚴单重PCR检测扩增程序：94℃5min→94℃30sec，55.6℃30sec，72℃1min，30个循环→72℃10min。
电泳观察PCR检测结果，根据大小初步确定为检测目的条带。
1.2.5双重PCR反应
25μL的PCR反应体系中组分如下：
pH8.3的Tris-HCl10mmol/L，KCl50mmol/L，MgCl21.5mmol/L，dNTPs0.64mmol/L，简单异尖线虫正向扩增引物(SEQIDNO.1)0.32μmol/L，简单异尖线虫反向扩增引物(SEQIDNO.2)0.32μmol/L，华支睾吸虫囊蚴正向扩增引物(SEQIDNO.3)0.32μmol/L，华支睾吸虫囊蚴反向扩增引物(SEQIDNO.4)0.32μmol/L，简单异尖线虫DNA模板(1.2.2节提取获得)10-24ng/μL，华支睾吸虫囊蚴DNA模板(1.2.2节提取获得)10-24ng/μL，Taq酶1U/μL，ddH2O补足至25μL。
双重PCR检测扩增程序：94℃5min→94℃30sec，56.0℃30sec，72℃1min，30个循环→72℃10min。
1.2.6敏感性与特异性试验
特异性试验：用华支睾吸虫囊蚴和简单异尖线虫作为模板，按照建立的双重PCR检测体系(1.2.5)进行扩增，同时设立伪地新线虫DNA、刺激隐核虫和棘颚口线虫DNA作为对照，验证双重PCR的特异性试验结果。
敏感性试验：应用已知的相同浓度的两种虫(华支睾吸虫囊蚴和简单异尖线虫)混合DNA为模板，连续十倍浓度梯度稀释。按照1.2.5建立的检测方法，将不同浓度的DNA进行PCR扩增，电泳分析结果。
2、结果
2.1囊蚴的形态学鉴定
囊蚴是扁形动物门吸虫纲幼虫发育过程中的一个阶段,华支睾吸虫囊蚴主要寄生在淡水鱼的鳃和肌肉中，以麦穗鱼最为常见。其囊壁呈椭圆形,长度大约为0.16mm-0.20mm，外侧由一层包囊包裹，高倍镜下可以观察到口吸盘和腹吸盘。本试验中将收集到的囊蚴置于100倍光学显微镜下，可观察到囊蚴在包囊内运动活跃，在排泄囊内充满大量的黑色颗粒，且形态符合华支睾吸虫的特点。
2.2单重PCR反应结果
应用相应的检测引物对华支睾吸虫囊蚴和简单异尖线虫分别进行单重PCR扩增。电泳结果显示，简单异尖线虫在500bp左右出现特异性条带(图1)，华支睾吸虫囊蚴在250bp左右出现特异性条带(图2)，且两种检测方法均无杂带。
2.3双重PCR反应结果及特异性试验结果
应用1.2.5双重PCR反应体系，对简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴这两种虫的混合DNA扩增，同时设立其他三种线虫和鱼肉DNA作为对照进行双重PCR反应，试验结果如下：从图3中可以发现，在对简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴这两种虫的混合DNA以及其他对照DNA进行双重PCR反应中，其实验结果均显示特异性条带，与预期相符。同时，对照组检测结果均未出现特异性条带。双重PCR的结果符合预期试验设计。
2.4敏感性试验结果
分别将不同浓度的简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的DNA浓度稀释至500ng/μL，将该两种虫的DNA进行混合，简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的DNA浓度均为250ng/μL，用于PCR扩增。同时，进行10倍浓度梯度稀释，分别稀释至7个不同的浓度，应用1.2.5建立的双重PCR检测体系进行扩增。
从图4可以看出，两种混合虫DNA能够检测到的最低浓度为50pg/μL，当混合虫DNA为5pg/μL时华支睾吸虫囊蚴DNA已经无法检测到，试验结果证明，该双重PCR检测体系具有良好的敏感性。
具体实施例：
一种检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重PCR扩增试剂盒，包括PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液包括：pH8.3的Tris-HCl10mmol/L，KCl50mmol/L，MgCl21.5mmol/L，dNTPs0.64mmol/L，简单异尖线虫正向扩增引物(SEQIDNO.1)0.32μmol/L，简单异尖线虫反向扩增引物(SEQIDNO.2)0.32μmol/L，华支睾吸虫囊蚴正向扩增引物(SEQIDNO.3)0.32μmol/L，华支睾吸虫囊蚴反向扩增引物(SEQIDNO.4)0.32μmol/L，简单异尖线虫DNA模板10-24ng/μL，华支睾吸虫囊蚴DNA模板10-24ng/μL，Taq酶1U/μL，ddH2O补足至所需要扩增体系的体积。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (7)

1.一种检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重PCR扩增试剂盒，包括PCR扩增反应液，其特征在于：所述PCR扩增反应液包括：Tris-HCl10mmol/L，KCl50mmol/L，MgCl21.5mmol/L，dNTPs0.64mmol/L，简单异尖线虫正向扩增引物0.32μmol/L，简单异尖线虫反向扩增引物0.32μmol/L，华支睾吸虫囊蚴正向扩增引物0.32μmol/L，华支睾吸虫囊蚴反向扩增引物0.32μmol/L，简单异尖线虫DNA模板10-24ng/μL，华支睾吸虫囊蚴DNA模板10-24ng/μL，Taq酶1U/μL。
2.根据权利要求1所述的双重PCR扩增试剂盒，其特征在于：所述简单异尖线虫正向扩增引物序列为：5'-CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT-3'。
3.根据权利要求1所述的双重PCR扩增试剂盒，其特征在于：所述简单异尖线虫反向扩增引物序列为：5'-CCCTACGAAATGGCATACTTG-3'。
4.根据权利要求1所述的双重PCR扩增试剂盒，其特征在于：所述华支睾吸虫囊蚴正向扩增引物序列为：5'-ATGCTCTCGGTATGCTCGCTT-3'。
5.根据权利要求1所述的双重PCR扩增试剂盒，其特征在于：所述华支睾吸虫囊蚴反向扩增引物序列为：5'-GTCGTACCCGGGATAAGGCA-3'。
6.根据权利要求1所述的双重PCR扩增试剂盒，其特征在于：所述Tris-HCl的pH为8.3。
7.一种检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重PCR扩增引物，包括简单异尖线虫扩增引物和华支睾吸虫囊蚴扩增引物，其特征在于：所述简单异尖线虫扩增引物包括简单异尖线虫正向扩增引物和简单异尖线虫反向扩增引物，所述简单异尖线虫正向扩增引物序列为：5'-CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT-3'，所述简单异尖线虫反向扩增引物序列为：5'-CCCTACGAAATGGCATACTTG-3'，所述华支睾吸虫囊蚴正向扩增引物序列为：5'-ATGCTCTCGGTATGCTCGCTT-3'，所述华支睾吸虫囊蚴反向扩增引物序列为：5'-GTCGTACCCGGGATAAGGCA-3'。
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CN117568494A (zh) * 2024-01-17 2024-02-20 黑龙江八一农垦大学 一种淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重pcr检测引物组、试剂盒及检测方法
CN117568494B (zh) * 2024-01-17 2024-03-29 黑龙江八一农垦大学 一种淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重pcr检测引物组、试剂盒及检测方法

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