CN105132414A

CN105132414A - 一种基于线粒体coi基因检测华支睾吸虫囊蚴的pcr扩增试剂盒及扩增引物

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Publication number: CN105132414A
Application number: CN201510512094.5A
Authority: CN
Inventors: 李孝军; 周圆; 白颉; 单长林; 沈飚; 杨赛军; 胡兴娟; 王素华
Original assignee: Complex Art Service Centre Of Zhoushan Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Current assignee: Complex Art Service Centre Of Zhoushan Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Priority date: 2015-08-19
Filing date: 2015-08-19
Publication date: 2015-12-09

Abstract

本发明公开了一种基于线粒体COI基因检测华支睾吸虫囊蚴的PCR扩增试剂盒及扩增引物，包括PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液包括：Tris-HCl？10mmol/L，KCl？50mmol/L，MgCl₂？1.5mmol/L，dNTPs？0.8mmol/L，正向引物0.4μmol/L，反向引物0.4μmol/L，DNA模板20ng/μL，Taq酶0.075U/μL。本发明灵敏度高，特异性强，检测快速、准确，为华支睾吸虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段。

Description

一种基于线粒体COI基因检测华支睾吸虫囊蚴的PCR扩增试剂盒及扩增引物

技术领域

本发明涉及寄生虫检测技术领域，特别涉及一种基于线粒体COI基因检测华支睾吸虫囊蚴的PCR扩增试剂盒及扩增引物。

背景技术

华支睾吸虫病(Clonorchiasis)是由于感染华支睾吸虫(Clonorchissinensis，Cs)引起的食源性人兽共患寄生虫病，严重危害人类的健康。该病主要分布在东亚、东南亚和东欧的部分国家，如中国、韩国、老挝和越南等。据统计全球约有3500万人感染这种吸虫，其中1500万人分布在我国的各个省市区(除内蒙古、青海、西藏和新疆外均有发现)，以广东、广西和东北三省尤为严重。目前，华支睾吸虫的鉴定方法还没有统一的标准，目前对华支睾吸虫囊蚴的诊断依赖于显微镜检查。众所周知，显微镜检查耗费时间长，检查效率低，对检查者临床工作经验要求较高，而且对于与华支睾吸虫亲缘关系相近的囊蚴，虫卵形态相似，普通光镜无法区分，使用这种方法往往会出现误判。免疫诊断法虽然较显微镜检查法效率高，但也常常为灵敏度和特异性所局限。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于线粒体COI基因检测华支睾吸虫囊蚴的PCR扩增试剂盒，灵敏度高，特异性强，检测快速、准确，为华支睾吸虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段。

本发明还提供了一种基于线粒体COI基因检测华支睾吸虫囊蚴的扩增引物，特异性强。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基于线粒体COI基因检测华支睾吸虫囊蚴的PCR扩增试剂盒，包括PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液包括：Tris-HCl10mmol/L，KCl50mmol/L，MgCl₂1.5mmol/L，dNTPs0.8mmol/L，正向引物0.4μmol/L，反向引物0.4μmol/L，DNA模板20ng/μL，Taq酶0.075U/μL。

本发明以华支睾吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(COI)基因为目标，专门设计了针对性的特异性引物，进一步的设计了检测试剂盒，检测结果特异，结果易判断，灵敏度高，特异性强，检测快速、准确，为华支睾吸虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段。

作为优选，所述正向引物序列为：5'-GAGTTCCAGCAAGCATATATAATC-3'(SEQIDNO.1)。

作为优选，所述反向引物序列为：5'-GTCACATTTGTACTACTTTAACAGGTA-3'(SEQIDNO.2)。

作为优选，所述Tris-HCl的pH为8.3。

一种基于线粒体COI基因检测华支睾吸虫囊蚴的扩增引物所述扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物序列为：5'-GAGTTCCAGCAAGCATATATAATC-3'(SEQIDNO.1)，所述反向引物序列为：5'-GTCACATTTGTACTACTTTAACAGGTA-3'(SEQIDNO.2)。采用本发明设计的特异性扩增引物，检测灵敏度高，特异性强。

本发明的有益效果是：灵敏度高，特异性强，检测快速、准确，为华支睾吸虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段。

附图说明

图1是本发明试剂盒对华支睾吸虫DNA的PCR扩增结果图，

图中：M：100bpDNAmarker，1-2:目的扩增条带。

图2是本发明试剂盒的特异性试验结果图，

图中：M：100bpDNAmarker；1:目的扩增条带；2-4:简单异尖线虫、刺激隐核虫和棘颚口线虫。

图3是本发明试剂盒的敏感性试验结果图，

图中：M：100bpDNAMarker；1：40ng/μL华支睾吸虫DNA；2：4ng/μL华支睾吸虫DNA；3：400pg/μL华支睾吸虫DNA；4：40pg/μL华支睾吸虫DNA；5：4pg/μL华支睾吸虫DNA；6：0.4pg/μL华支睾吸虫DNA。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明实施如下：

1、材料与方法

1.1材料：

囊蚴和华支睾吸虫DNA阳性对照来源：2013年5月底采集舟山市场上销售的麦穗鱼，用消化法从鱼肉组织中分离获得华支睾吸虫囊蚴。华支睾吸虫DNA阳性对照品由舟山出入境检验检疫局提供。简单异尖线虫、刺激隐核虫和棘颚口线虫由舟山出入境检验检疫局提供。

dNTPs、Taq酶均购自大连宝生物公司。

1.2方法

1.2.1囊蚴的分离

将麦穗鱼用清水洗净，去除鱼头、鱼尾、鱼鳍、鱼刺及内脏,将鱼肉用绞肉机加工成肉泥，放入玻璃杯。按每克鱼肉加入10mL人工胃液(盐酸浓度为8mL/L，胃蛋白酶浓度8g/L，氯化钠浓度为9g/L)，37℃孵箱作用2h，将消化完全的鱼肉消化液经80目分离筛过滤集中于2L的分液漏斗中沉淀0.5h，放出约300mL的消化液至500mL的烧杯中，沉淀10-30min后，弃去上面的浊液，用清水反复清洗至液体清亮，随后将含虫体的液体转移至15mL尖底离心管内，沉淀1min后将含囊蚴的上清液体吸至另一新管内，反复沉淀几次，显微镜下检查囊蚴纯净度。将剩余的囊蚴保存在Alsever’s溶液(Alsever'sSolution，市售)中，置于4℃冰箱备用。

1.2.2囊蚴的形态学和DNA提取

取少量上述收集到的囊蚴置于显微镜下观察，并对其进行了形态学鉴定。随后按照TakarauniversalGenomicDNAExtractionkit(市售，购自大连宝生物公司)说明书中提供的方法提取囊蚴的基因组DNA。

1.2.3引物设计与合成

针对华支睾吸虫线粒体COI基因(GenBank:AF096229)序列设计特异性引物1对：正向引物序列为：5'-GAGTTCCAGCAAGCATATATAATC-3'(SEQIDNO.1)，反向引物序列为：5'-

GTCACATTTGTACTACTTTAACAGGTA-3'(SEQIDNO.2)。引物设计采用DNASTAR5.0软件程序设计完成，由生工生物(上海)有限公司合成，对上述2.2提取的DNA进行PCR扩增，获得228kb目标产物。

1.2.4目的基因扩增与序列测定

20μL的PCR反应体系中组分如下：

pH8.3的Tris-HCl10mmol/L，KCl50mmol/L，MgCl₂1.5mmol/L，dNTPs0.8mmol/L，正向引物(SEQIDNO.1)0.4μmol/L，反向引物(SEQIDNO.2)0.4μmol/L，DNA模板(1.2.2节提取获得)20ng/μL，Taq酶0.075U/μL，ddH₂O补足至20μL。

PCR扩增条件：94℃5min→94℃30sec，(54℃、56℃、58℃)60sec，72℃60sec，35个循环→72℃3min。应用1.2.3设计的引物对华支睾吸虫DNA进行PCR反应，反应完毕后，取5μL反应产物在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，观察结果。

将上述获得的线粒体COI目的基因PCR产物直接送生工生物(上海)有限公司测序，并将测序后的序列分别与NCBI核酸数据库中提供的序列进行比对，分析比对结果。

1.2.5灵敏性与特异性试验

特异性试验：对华支睾吸虫进行PCR检测的同时，还对简单异尖线虫、刺激隐核虫和棘颚口线虫(DNA提取方法与1.2.2相同)，均分别用华支睾吸虫特异性引物(本发明的扩增引物)在同样反应条件下进行PCR扩增，以确定是否有交叉反应。

灵敏性试验：用核酸测定仪(NanoDrop2000)测定所提取的华支睾吸虫DNA浓度，连续十倍浓度梯度稀释。按照1.2.4的扩增方法，将不同浓度的DNA进行PCR扩增，电泳分析结果。

2、结果

2.1囊蚴的形态学鉴定

囊蚴是扁形动物门吸虫纲幼虫发育过程中的一个阶段,华支睾吸虫囊蚴主要寄生在淡水鱼的鳃和肌肉中,以麦穗鱼最为常见。其囊壁呈椭圆形,长度大约为0.16mm-0.20mm，外侧由一层包囊包裹，高倍镜下可以观察到口吸盘和腹吸盘。本试验中将收集到的囊蚴置于100倍光学显微镜下，可观察到囊蚴在包囊内运动活跃，在排泄囊内充满大量的黑色颗粒，且形态符合华支睾吸虫的特点。

2.2华支睾吸虫目的基因扩增与测序分析结果

2.2.1线粒体COI基因PCR扩增结果

用1.2.4方法对华支睾吸虫DNA进行扩增，电泳结果显示，在230bp左右出现特异性条带，且无杂带，片段大小与预期相符合(见图1)。

2.2.2线粒体COI基因测序结果

测序结果片段大小为228bp。比对分析后，证明该基因片段与预计扩增片段序列同源性达到100％。

具体序列信息如下：

GAGTTCCAGCAAGCATATATAATCATGAAAAAACCTTGATCCCCGTAGGCACACCTATAATCATAGTAACCGAGCTAAAAAAAACAGCAGTCCCCAAATCCAGCCCAACAGTAAACATATGATGAGCTCAAACCACCCTACCCAGACAAACTATAGCAAACATAGCCAACACCAAGCCCCCATAACCAAACAACGAATCTTTACCTGTTAAAGTAGTACAAATGTGAC(SEQIDNO.3)。

2.3特异性试验结果

结果显示，以华支睾吸虫DNA为模板可以扩增出特异性条带，而以简单异尖线虫、刺激隐核虫和棘颚口线虫DNA为模板不能扩增出目的条带(见图2)。

2.4敏感性试验结果

已知华支睾吸虫的DNA浓度为400ng/μL，将其进行10倍浓度梯度稀释后，应用1.2.4方法进行扩增，本发明的扩增引物最低可检测到DNA含量为4pg的华支睾吸虫(见图3)。

从试验结果来看，因为采用了华支睾吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(COI)基因设计引物，该引物能够准确的识别不同虫种的特异性序列片段，使得该检测方法的特异性大大提高。敏感性试验进一步证实了该PCR方法良好的效果，在华支睾吸虫DNA含量只有4pg的情况下，能准确的鉴定出华支睾吸虫的存在。本发明可以用于检测鱼体内的华支睾吸虫囊蚴，并为其生活史、传播方式及危害程度的研究提供有效的技术支撑。

具体实施例：

一种基于线粒体COI基因检测华支睾吸虫囊蚴的PCR扩增试剂盒，包括PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液包括：pH8.3的Tris-HCl10mmol/L，KCl50mmol/L，MgCl₂1.5mmol/L，dNTPs0.8mmol/L，正向引物0.4μmol/L，反向引物0.4μmol/L，DNA模板20ng/μL，Taq酶0.075U/μL。所述正向引物序列为：5'-GAGTTCCAGCAAGCATATATAATC-3'(SEQIDNO.1)，所述反向引物序列为：5'-GTCACATTTGTACTACTTTAACAGGTA-3'(SEQIDNO.2)。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims

1.一种基于线粒体COI基因检测华支睾吸虫囊蚴的PCR扩增试剂盒，包括PCR扩增反应液，其特征在于，所述PCR扩增反应液包括：Tris-HCl10mmol/L，KCl50mmol/L，MgCl₂1.5mmol/L，dNTPs0.8mmol/L，正向引物0.4μmol/L，反向引物0.4μmol/L，DNA模板20ng/μL，Taq酶0.075U/μL。

2.根据权利要求1所述的PCR扩增试剂盒，其特征在于：所述正向引物序列为：5'-GAGTTCCAGCAAGCATATATAATC-3'。

3.根据权利要求1所述的PCR扩增试剂盒，其特征在于：所述反向引物序列为：5'-GTCACATTTGTACTACTTTAACAGGTA-3'。

4.根据权利要求1或2或3所述的PCR扩增试剂盒，其特征在于：所述Tris-HCl的pH为8.3。

5.一种基于线粒体COI基因检测华支睾吸虫囊蚴的扩增引物，其特征在于：所述扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物序列为：5'-GAGTTCCAGCAAGCATATATAATC-3'，所述反向引物序列为：5'-GTCACATTTGTACTACTTTAACAGGTA-3'。