CN112662785B - 一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对、试剂盒及鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对、试剂盒及鉴别方法，涉及分子生物技术领域。本发明所述引物对基于哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的mtDNA COI基因201bp序列差异设计，包括CSF和CSR，其中CSF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CSR的核苷酸序列如SEQ I D NO.2所示，其结果稳定，可重复性强。利用本发明所述引物对、试剂盒和鉴别方法，有助于解决海洋鱼类寄生虫种类混杂等问题，为重要经济鱼类养殖、病害防控和资源保护、合理利用以及生物多样性研究提供技术支撑。

Description

一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对、试 剂盒及鉴别方法
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对、试剂盒及鉴别方法。
背景技术
哈氏本尼登虫(Benedenia hoshinai)与鰤本尼登虫(Benedenia seriolae)均隶属于扁形动物门(Platyhelminthes)、单殖吸虫纲(Monogenoidea)、分室目(Capsalidea)，分室科(Capsalidae)，本尼登虫属(Benedenia)，是世界海水渔业养殖的高发病原生物，具有感染率高、周期短、破坏性强、传播广泛等特点。本尼登虫病俗称“白斑病”，虫体寄生后将对宿主产生不利影响：1)造成宿主行为异常，局部组织破坏，严重时可导致宿主的死亡；2)破坏器官的完整性，引起其他病原生物(如细菌、病毒等)的入侵，造成继发性感染，使机体产生病变；3)吸食宿主血液、粘液等，刺激宿主产生分泌物，致鳃呼吸受阻，影响正常的生理活动。近年来，海水鱼类的网箱养殖、滩涂养殖都有相当数量的病例出现(如哈氏本尼登虫高发于石斑鱼、鲷科等养殖鱼类，鰤本尼登虫常寄生于石斑鱼、鰤鱼、黄鱼等经济鱼类)，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。
在实际渔业生产的病害防控过程中，由于很难从外观上直接区分两种本尼登虫，目前仍缺乏行之有效的手段对其进行准确诊断，导致养殖病害防控失效的事例常有发生，造成经济损失。目前用于哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫有效且快速的判别方法还未见正式报道。因此寻找哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的可靠分子标记，从混杂的种质中鉴别区别两种本尼登虫成为一个亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对、试剂盒及鉴别方法，有助于解决两种本尼登虫病原生物体混杂问题，且鉴别方法操作简单，易于掌握，准确性高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对，所述引物对包括CSF和CSR，所述CSF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CSR的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
本发明还提供了一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的试剂盒，所述试剂盒中包括上述引物对。
优选的，所述试剂盒中还包括：10×buffer、dNTPs和rTaq。
本发明还提供了上述引物对或上述试剂盒在鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫中的应用。
本发明还提供了一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的方法，包括以下步骤：提取受本尼登虫感染的鱼体表粘液内的基因组DNA作为模板，与上述引物对或上述试剂盒中的引物对混合进行PCR，对PCR产物测序，当测序结果具有如SEQ ID NO.3所示序列，则所述鱼感染哈氏本尼登虫；当测序结果具有如SEQ ID NO.4所示序列，则所述鱼感染鰤本尼登虫。
优选的，所述PCR的体系以22.5μl计，包括：10×buffer 2.5μl、dNTPs 2μl、rTaq0.5μl、模板1ng、引物各1μl和余量的ddH2O。
优选的，所述PCR的程序包括：94℃预变性4min；94℃变性30sec，48℃退火40sec，72℃延伸50sec，40个循环；72℃延伸7min。
本发明提供了一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对，基于哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的mtDNA COI基因201bp序列差异设计，其结果稳定，可重复性强。在本发明实施例中，5组对比实验扩增结果一致，表现出高度的一致性。因此基于COI基因的碱基差异可以作为哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫区分的分子标记，而且鉴别方法简单。利用本发明所述引物对、试剂盒和鉴别方法，有助于解决海洋鱼类寄生虫种类混杂等问题，为重要经济鱼类养殖、病害防控和资源保护、合理利用以及生物多样性研究提供技术支撑。
附图说明
图1为哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的mtDNA COI基因的比对结果图，其中“*”表示相同的碱基序列位点。
具体实施方式
本发明提供了一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对，所述引物对包括CSF和CSR，所述CSF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：CCATCATATGTTTACTATTGG，所述CSR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：GTCACACCCCCTATAGTAAAT。
本发明所述分子标记引物对基于哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的mtDNA COI基因201bp序列差异设计，结果稳定，可重复性强。
本发明还提供了一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的试剂盒，所述试剂盒中包括上述引物对。本发明所述试剂盒中优选还包括：10×buffer、dNTPs和rTaq，且10×buffer、dNTPs和rTaq优选均购买于上海生物工程股份有限公司。
本发明还提供了上述引物对或上述试剂盒在鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫中的应用。
利用本发明所述引物对或试剂盒进行PCR扩增，可获得两条不同的条带，如感染哈氏本尼登虫，扩增产物经测序后如SEQ ID NO.3所示：ATGTTTGGGTTGTGTGGTTTGAGCCCATCATATGTTTACTATTGGTATGGATGTTAAGACAACTGTATTTTTTAGCTCTGTTACTATGATTATAGGAGTTCCCACAGGCATAAAGGTATTTTCTTGATTATACATGCTCATTGGTAGTAATTTTAGTCGTAGGGATCCTATAATGTGATGAATTTTAGCTTTTATTATTTT；如感染鰤本尼登虫，则扩增产物经测序后如SEQ ID NO.4所示：TTGTTTAGGTTGTGTTGTTTGGGCTCATCATATGTTTACTATTGGAATGGATGTTAAGACTACCGTTTTTTTTAGTTCAGTAACTATGATTATAGGTGTTCCTACGGGTATAAAGGTATTTTCTTGATTATATATGTTAATAGGTAGTAATGCTAGTCGAAGAGATCCTGTTATATGGTGAGTTCTAGCTTTTATTATTTT。经序列比对，SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的序列，存在如图1所示的30个碱基的差异，表现为17个转换，13个颠换，可以作为哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫区分的分子标记。
本发明还提供了一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的方法，包括以下步骤：提取受本尼登虫感染的鱼体表粘液内的基因组DNA作为模板，与上述引物对或上述试剂盒中的引物对混合进行PCR，对PCR产物测序，当测序结果具有如SEQ ID NO.3所示序列，则所述鱼感染哈氏本尼登虫；当测序结果具有如SEQ ID NO.4所示序列，则所述鱼感染鰤本尼登虫。
本发明对所述基因组DNA提取的方法并没有特殊限定，优选刮取受本尼登虫感染的鱼体表粘液，经蛋白酶消化和离心后利用CTAB法进行基因组DNA的提取。
本发明所述PCR的体系以22.5μl计，优选包括：10×buffer 2.5μl、dNTPs2μl、rTaq0.5μl、模板1ng、引物各1μl和余量的ddH2O。本发明所述PCR的程序优选包括：94℃预变性4min；94℃变性30sec，48℃退火40sec，72℃延伸50sec，40个循环；72℃延伸7min。利用本发明所述方法进行哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的鉴别，方法简单，结果稳定且可重复性强。
下面结合实施例对本发明提供的一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对、试剂盒及鉴别方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
选用采自青石斑鱼(Epinephelus awoara)体表的哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫，组成哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫样本群，提取2个样本群体的DNA，然后所提取的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果；
所述的引物序列为CSF：CCATCATATGTTTACTATTGG；CSR：GTCACACCCCCTATAGTAAAT。
PCR扩增的反应体系组成为：
Figure BDA0002920299990000041
PCR扩增程序为94℃预变性2min；94℃变性30sec，48℃退火40sec，72℃延伸50sec，40个循环；72℃延伸7min，4℃保存。对PCR产物进行纯化后测序，并对2个群体的测序结果进行比对。
由哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫mtDNA COI基因201bp序列排序结果如图1所示，两种本尼登虫存在30个碱基的差异，表现为17个转换，13个颠换，可以作为哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫区分的分子标记。
实施例2
1)选取哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫各5个个体，组成哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫样本群，分别提取2个样本群体的DNA；
2)以步骤1)中的基因组的DNA为模板，以CSF(SEQ ID NO.1，CCATCATATGTTTACTATTGG)，CSR(SEQ ID NO.2，GTCACACCCCCTATAGTAAAT)为引物对，设计PCR反应体系分别进行扩增，得到哈氏本尼登虫分子标记序列和鰤本尼登虫分子标记序列；
3)对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果，鉴别其种类。
PCR反应体系和PCR扩增程序与实施例1相同，经过测序，哈氏本尼登虫分子标记序列(SEQ ID NO.3)为：
ATGTTTGGGTTGTGTGGTTTGAGCCCATCATATGTTTACTATTGGTATGGATGTTAAGACAACTGTATTTTTTAGCTCTGTTACTATGATTATAGGAGTTCCCACAGGCATAAAGGTATTTTCTTGATTATACATGCTCATTGGTAGTAATTTTAGTCGTAGGGATCCTATAATGTGATGAATTTTAGCTTTTATTATTTT；
鰤本尼登虫分子标记序列(SEQ ID NO.4)为：
TTGTTTAGGTTGTGTTGTTTGGGCTCATCATATGTTTACTATTGGAATGGATGTTAAGACTACCGTTTTTTTTAGTTCAGTAACTATGATTATAGGTGTTCCTACGGGTATAAAGGTATTTTCTTGATTATATATGTTAATAGGTAGTAATGCTAGTCGAAGAGATCCTGTTATATGGTGAGTTCTAGCTTTTATTATTTT。
测序结果表明，5个哈氏本尼登虫样品扩增结果一致，同时5个鰤本尼登虫样品扩增结果一致，结果稳定且可重复性强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所
<120> 一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对、试剂盒及鉴别方法
<141> 2021-01-27
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ccatcatatg tttactattg g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gtcacacccc ctatagtaaa t 21
<210> 3
<211> 201
<212> DNA
<213> 哈氏本尼登虫(Benedenia hoshinai)
<400> 3
atgtttgggt tgtgtggttt gagcccatca tatgtttact attggtatgg atgttaagac 60
aactgtattt tttagctctg ttactatgat tataggagtt cccacaggca taaaggtatt 120
ttcttgatta tacatgctca ttggtagtaa ttttagtcgt agggatccta taatgtgatg 180
aattttagct tttattattt t 201
<210> 4
<211> 201
<212> DNA
<213> 鰤本尼登虫(Benedenia seriolae)
<400> 4
ttgtttaggt tgtgttgttt gggctcatca tatgtttact attggaatgg atgttaagac 60
taccgttttt tttagttcag taactatgat tataggtgtt cctacgggta taaaggtatt 120
ttcttgatta tatatgttaa taggtagtaa tgctagtcga agagatcctg ttatatggtg 180
agttctagct tttattattt t 201

Claims (3)

1.分子标记引物对在鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫中的应用，其特征在于，所述分子标记引物对包括CSF和CSR，所述CSF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CSR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.分子标记引物对在制备鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的试剂盒中的应用，其特征在于，所述分子标记引物对包括CSF和CSR，所述CSF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CSR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括：10×buffer、dNTPs和rTaq。
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