JP2018143186A - ブリ類のハダムシ抵抗性検査方法 - Google Patents
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Abstract
Description
発明者らはブリ天然魚F1を用いたQTL(Quantitative trait locus、量的形質遺伝子座)解析により、ベネデニア症抵抗性(ハダムシが寄生し難い、寄生数が少ない)形質と遺伝学的に連鎖したゲノム領域が連鎖群LG2上のマイクロサテライトDNAマーカー座Sequ0125TUF とSequ1066TUFの間の遺伝距離5.5 cM(センチモルガン)にあることを特定している(非特許文献1)。
発明者らはブリ天然魚について、ベネデニア症抵抗性形質と遺伝学的に連鎖したゲノム領域が連鎖群LG2上のマイクロサテライトDNAマーカー座領域(Sequ0125TUF とSequ1066TUFの間)を特定したが(非特許文献1)、この領域内にどのような遺伝子が存在し、どのようなメカニズムでベネデニア症抵抗性形質が発現するかについては分かっていなかった。
そのため、本発明は、天然のブリ類のハダムシ抵抗性を検査する方法を提供する。
即ち、本発明は、ブリ類から採取したDNAの、ブリ連鎖群LG2上のマイクロサテライトマーカーDNAマーカー座Sequ0125TUF とSequ1066TUFとの間に位置する配列番号1で示される塩基配列の860番目の塩基の一塩基多型の遺伝型を調べる段階、及び該遺伝型に基づいてブリ類のハダムシ抵抗性を判定する段階から成る、ブリ類のハダムシ抵抗性を検査する方法である。
本発明の方法によりベネデニア症への抵抗性を調べることができる魚類は、Seriola 属の魚類であり、和名では、ブリ(学名:Seriola quinqueradiata)、ヒラマサ(学名:Seriola lalandi)、カンパチ(学名:Seriola dumerili)、ヒレナガカンパチ(学名:Seriola rivoliana)、アオブリ、ガンド、ガンドブリ、モジャコ、モジャッコ、イナダ、イナラ、ワラサ、コゾクラ、コズクラ、ツバイソ、フクラギ、フクラゲ、ワカナ、ショウジンゴ、ツバス、ヤズ、ハマチ、メジ、メジロ、ハナジロ、マルゴ、ワカナゴ、オオイナ、スズイナ、オオイオ、ワカシ、マサギ、ヒラサ、ヒラス、ヒラソ、テンコツ、セントク、アガユ、マヤ、外国名では、(Japanese) Amberjack、(Five-ray) Yellowtailと称される魚を含む。本明細書では、これらを総称してブリ類という。
本発明の方法は、特に天然のブリ類のべネデニア症抵抗性を識別することに優れる。
ブリ類同士はゲノム配列と染色体構造の相同性が非常に高いため、この遺伝子の情報は他のブリ類にも適用できるものと推測される。
一塩基多型の検出には、例えば、ダイレクトシークエンス法を用いることができる。具体的には、上記遺伝子における一塩基多型の検出は、例えば、ブリ類からゲノムDNAを抽出し、前記一塩基多型を含む塩基配列の外側に結合する特異的な配列を有する一対のPCRプライマーを用いてPCR反応を行い、得られたPCR産物を増幅に用いたPCRプライマーの内側に設計したプライマー又は増幅に用いたPCRプライマーそのものを用いてDNA塩基配列のシークエンスを行い、得られたDNAの遺伝型を識別することで行うことができる。
このようにして、ブリ類のベネデニア症抵抗性遺伝子(配列番号1)の860番目の塩基(C860T)の一塩基多型を調べた結果、遺伝マーカーC860Tの遺伝型がT/T又はC/Tの場合、好ましくはT/Tの場合には、ベネデニア症抵抗性を有する、すなわちハダムシが寄生し難い、寄生数が少ない個体と判定し、C/Cの場合には抵抗性を持たない個体と判定することができる(スラッシュ(/)を挟む塩基は各アレルの塩基を表す。)。
実験例1
ブリ類の連鎖群LG2のベネデニア症抵抗性領域の概要を図1に示す。本発明の一塩基多型は、連鎖群LG2のベネデニア症抵抗性領域内に位置するベネデニア症抵抗性遺伝子(配列番号1)のタンパク質翻訳領域内に存在する。発明者らはマイクロサテライトDNAマーカー座Sequ0125TUF とSequ1066TUFを用いてブリゲノムDNA断片(平均DNA断片長140.7 kb)を保持する細菌人工染色体(BAC)ライブラリーのスクリーニングを行った。DNAマーカーSequ0125TUF により、BACクローン #013_k04、#102_l17、#028_c14、#019_k17を同定した。またSequ1066TUFにより、#101_o14、#077_f22、#078_k13、#075_e05、#114_l03を同定した。次にこれらのBACクローンの末端の塩基配列を決定し、決定した配列をもとに隣接するクローンを探索した。BACクローン末端配列による隣接クローンの探索を繰り返し、最終的に16個のベネデニア症抵抗性領域のゲノムDNAを保持するBACクローンが得られた。得られたBACクローンは図1のように整列化された。16個クローンのうち#102_l17、#013_p20、#066_e22、#090_d18、#013_a02、#070_j15、#101_o14の7個のクローン(図1で点線で囲む)により、最も少ないクローン数(最小の経路)でベネデニア症抵抗性領域がカバーされた。
この7個のBACクローンについて塩基配列のショットガンシークエンス(長いクローンを断片化し塩基配列を決定)とde novo アセンブル(参照配列なしの断片化した塩基配列の再構築)を行い、DNAマーカーSequ0125TUF とSequ1066TUF間のゲノム領域の全DNA塩基配列(約520,000 bp)を取得した(ここには示さない。)。
実験例1で決定した連鎖群LG2ベネデニア症抵抗性ゲノム領域の塩基配列を遺伝子予測ソフトウェアGENSCAN、Augustus等を用いて解析し検討した結果、この領域には20個程度の既知の遺伝子と部分的に相同性を示す遺伝子、及びその他に10から20個程度の既知遺伝子とは相同性を示さない機能不明な遺伝子が存在することが示唆された。これらの候補遺伝子の中でC-type lectin様の機能ドメインを持つ新規免疫応答関連遺伝子(配列番号1)がハダムシの寄生部位である表皮でmRNAが発現していること、免疫システムにおいて重要な機能を果たすことが知られているC-type lectinドメインを持つことからベネデニア症抵抗性形質の責任遺伝子であることが示唆された。その他の候補遺伝子には免疫システムへの関与が想定され、かつ表皮で発現している遺伝子は存在しなかった。
Forward primerには
Squ_clec-1F 5'-TTCTGATTATGTCTGTTGTCCTCTG-3'(配列番号2)、
Squ_clec-2F 5'-CTACTTCTTAGCCAACCATCCTGA-3'(配列番号3)、
Squ_clec-3F 5'-CTGGATCGGAGGTTACTACTTTCAG-3'(配列番号4)、
Squ_clec-4F 5'-ATGACTTTAAAGCCTCTTAATGTGC-3'(配列番号5)
Reverse primerには
Squ_clec-5R 5'-CTTTGTCTCCCAGTTGCACAGTAG-3'(配列番号6)、
Squ_clec-6R 5'-GAATGGGAAGTTCATGTTGCAG-3'(配列番号7)、
Squ_clec-7R 5'-AATGGGAAGTTCATGTTGCAG-3'(配列番号8)、
Squ_clec-8R 5'-CTCAGAGTGAAGACAGTGATTCG-3'(配列番号9)
を用いた。
増幅したcDNA断片はpGEM-T easy vector (Promega社)にクローニングし、塩基配列のシークエンスを行った。
5'-CTGGATCGGAGGTTACTACTTTCAG-3' (配列番号10)
をgene specific primerとして用い、PCR条件は94℃ 1分; 94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分を20サイクルとした。一回目のPCR産物1.25μlを2回目のネストPCRに用いた。2回目のPCRは
5'-TTCTGATTATGTCTGTTGTCCTCTG-3' (配列番号11)
をgene specific primerとして用い、PCR条件は94℃ 1分; 94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分を20サイクルとした。3'RACEでは1回目のPCRは
5'-ACTGCCTGACCTGACACACGAATGG-3' (配列番号12)
をgene specific primerとして用い、PCR条件は94℃ 1分; 94℃ 30秒、70℃ 30秒、72℃ 2分を5サイクル; 94℃ 30秒、68℃ 30秒、72℃ 2分を15サイクルとした。2回目のPCRは
5'-ACCGTGAGCCATCTTCCCATCTCCA-3' (配列番号13)
をgene specific primerとして用い、PCR条件は94℃ 1分; 94℃ 30秒、68℃ 30秒、72℃ 2分を30サイクルとした。増幅した5'及び3' RACE産物はpGEM-T easy vector (Promega社)にクローニングし、塩基配列のシークエンスを行った。これによりC-type lectin様の機能ドメインを持つ新規免疫応答関連遺伝子cDNA全長の塩基配列が得られた(図2、配列番号1)。
次に連鎖群LG2のクローニングしたべネデニア症抵抗性領域に位置する新規免疫応答関連遺伝子(配列番号1)について遺伝子の翻訳領域内のアミノ酸置換を伴う一塩基多型の探索を行った。
飼育している天然ブリ200尾より、ハダムシ抵抗性の高い個体(ハダムシ寄生数が少ない個体)とハダムシ抵抗性の低い個体(ハダムシ寄生数が多い個体)について各20尾を得た。これらのブリの尾ビレからDNeasy tissue and blood kit(QIAGEN社)を用いてゲノムDNAを抽出した。
塩基配列多型探索の基準となる参照配列にはRACE法によって得られた当該遺伝子cDNA配列(配列番号1)を用いた。当該遺伝子の位置するゲノム領域(約3000bp、ここには示さない。)をprimer 5'-AAATGTCAAAAGCACCTATGAAACG-3'(配列番号14)、5'-GCAATCGGTTGAAATATGGAGGAG-3'(配列番号15)を用いてPCRにより増幅した。PCRはTakara Ex taq(Takara Bio)を用いて行い、PCR条件は9℃ 2分; 95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 3分を35サイクル;その後、伸長反応72℃ 5分とした。当該遺伝子の塩基配列決定はダイレクト
シークエンス法により行った。
Squ_clec-9F 5'-TGTTCAGTCCGGTATAAAGAGC-3' (配列番号16)
Squ_clec-10R 5'-ACATAAACAGCAACATCAGGATCAT-3' (配列番号17)
Squ_clec-13F 5'-GTGTTCAGTCCGGTATAAAGATC-3' (配列番号18)
Squ_clec-14F 5'-GAACTCATTAGAACTTGTTTAGCGC-3' (配列番号19)
Squ_clec-15F 5'-CTTTATTACTGTACAAGCTGCGATG-3' (配列番号20)
Squ_clec-16F 5'-TCAGCTTCATTTGAGTGCAGTATAT-3' (配列番号21)
Squ_clec-17F 5'-ATACACCAAGATCCACTGCATACTA-3' (配列番号22)
Squ_clec-18R 5'-CAAACCAGTCGATCAATAAGAGGAT-3' (配列番号23)
Squ_clec-19R 5'-GAGGGGAACAAATCATGAGAATAGG-3' (配列番号24)
Squ_clec-20R 5'-TTCATCTGCTTCTGTTCTTGTTGTA-3' (配列番号25)
Squ_clec-21R 5'-ACATAAACAGCAACATCAGGATCAT-3' (配列番号26)
を用いた。
これらのSNPのうちA699C、C742A及びC860Tは当該遺伝子の機能ドメインであると考えられるC-type lectinドメイン(図2中の網掛け領域)内に位置し、アミノ酸変化によりタンパク質の生理活性に影響を与える可能性があると考えられた。
一方、C175A、A699C、C742A、C204T、T705C、T807G、A861GについてはSNPのジェノタイプとハダムシの寄生数との間には統計的有意差は検出されなかった。
Claims (5)
- ブリ類から採取したDNAの、ブリ連鎖群LG2上のマイクロサテライトマーカーDNAマーカー座Sequ0125TUF とSequ1066TUFとの間に位置する配列番号1で示される塩基配列の860番目の塩基の一塩基多型の遺伝型を調べる段階、及び該遺伝型に基づいてブリ類のハダムシ抵抗性を判定する段階から成る、ブリ類のハダムシ抵抗性を検査する方法。
- 検査の対象であるブリ類の個体からゲノムDNAを抽出し、ブリ連鎖群LG2上のマイクロサテライトマーカーDNAマーカー座Sequ0125TUF とSequ1066TUFとの間に位置する配列番号1で示される塩基配列の860番目の塩基の一塩基多型を含む塩基配列の外側に結合する特異的な配列を有する一対のプライマーを用いてPCR反応を行い、得られた増幅産物中の該一塩基多型の遺伝型を調べる段階、及び該遺伝型に基づいてブリ類のハダムシ抵抗性を判定する段階から成る、ブリ類のハダムシ抵抗性を検査する方法。
- 前記配列番号1で示される塩基配列の860番目の塩基の遺伝型がT/T又はC/Tの場合にはハダムシ抵抗性と判定する請求項1又は2に記載の方法。
- 前記配列番号1で示される塩基配列の860番目の塩基の遺伝型がT/Tの場合にはハダムシ抵抗性と判定する請求項1又は2に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のブリ類のハダムシ抵抗性を検査する方法に使用するためのプライマーセットであって、ブリ連鎖群LG2上のマイクロサテライトマーカーDNAマーカー座Sequ0125TUF とSequ1066TUFとの間に位置する配列番号1で示される塩基配列の860番目の塩基を含む領域を検出するためのプライマーであって、該塩基を含む該塩基配列中の50〜100塩基の長さの領域の両端に設定された長さが15塩基以上のフォワードプライマー及びリバースプライマー又はこれらと90%以上相同のフォワードプライマー及びリバースプライマーから成るプライマーセット。
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CN112662785A (zh) * | 2021-01-28 | 2021-04-16 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对、试剂盒及鉴别方法 |
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