CN105505921B - 奥斯特线虫/马歇尔线虫coi基因的扩增引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体提供了奥斯特线虫/马歇尔线虫COI基因的扩增引物及其应用。所述奥斯特线虫/马歇尔线虫COI基因的扩增引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其可以有效扩增出现有技术中通用引物LCO1490和HCO2198不能扩增的奥斯特线虫/马歇尔线虫的COI目的片段。满足反刍动物奥斯特线虫/马歇尔线虫的物种分子鉴定需求，同时也能为奥斯特线虫/马歇尔线虫种系发生关系研究、反刍动物胃肠道寄生虫病防控提供可靠的分子技术指导。

Description

奥斯特线虫/马歇尔线虫COI基因的扩增引物及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及奥斯特线虫/马歇尔线虫COI基因的扩增引物及其应用。
背景技术
反刍动物胃肠道寄生线虫(gastrointestinal nematodes in ruminants)包括毛圆线虫科(Trichostrongyloidae)中毛圆线虫亚科(Trichostrongylinae)以及长刺线虫亚科(Mecistocirrinae)动物线虫。这其中，毛圆线虫亚科奥斯特线虫属(Ostertagia)、马歇尔线虫属(Marshallagia)、背带线虫属(Teladorsagia)、血矛线虫属(Haemonchus)、古柏线虫属(Cooperia)、毛圆线虫属(Trichostrongylus)等6个属对我国北方牧区的放牧家畜危害较大，尤以奥斯特线虫、马歇尔线虫危害严重。奥斯特线虫/马歇尔线虫属于消化道内寄生虫，主要寄生于反刍动物家畜第四胃(真胃)以及肠道的褶皱中。上述寄生虫每年对我国畜牧业造成重大损失，其主要分为以下两个方面：其一为反刍动物感染胃部线虫后，由于机体营养被夺取及有毒物质的产生，影响畜产品的数量和质量，极端情况会导致动物死亡，因此造成大量损失；另一方面，为了防治牛羊胃肠道线虫，定期驱虫消耗的药品产生的费用。
我国目前发现的马歇尔线虫共有许氏马歇尔线虫(Marshallagia hsui)、蒙古马歇尔线虫(Marshallagia mongolica)等9种；奥斯特线虫有达荷奥斯特线虫(Ostertagiadahurica)、布里亚特奥斯特线虫(Ostertagia buriatica)以及西方奥斯特线虫(Ostertagia occidentalis)等15种。反刍动物奥斯特线虫、马歇尔线虫的分类依据主要是基于传统的形态学，借助显微镜观察雄性线虫的交合刺、导刺带、交合伞等器官的形状、长度、大小以及雌虫的阴门构造，结合虫体本身的大小、长度、颜色，以此鉴定虫种。但是，依靠形态学鉴定线虫种类容易出现问题：首先，许多动物线虫样本的形态特征在获取标本或储存时被破坏了；其次，全面掌握所有线虫种类的特征以及区分方法需要耗费大量的时间，而且十分困难；再次，某些不同种类反刍动物奥斯特线虫/马歇尔线虫的形态特征近似，它们之间的形态、大小极为相近，即使经验丰富的专家也难以将它们区分；最后，奥斯特线虫/马歇尔线虫不同种类的形态特征主要体现在雄虫上，其雌虫之间形态学差别较小，依据形态学鉴定较为困难。基于上述原因，研发针对反刍动物奥斯特线虫/马歇尔线虫的分子物种鉴定方法势在必行。
近年来，利用分子技术对物种进行鉴定和系统发生关系研究已经成为一种快速有效的方法，其中线粒体COI基因5’端序列具有物种种间遗传距离大，物种种内序列保守、序列两端有保守序列可设计通用引物等特点成为物种鉴定和研究物种进化关系的理想基因。目前，已经成为DNA条形码(DNA barcoding)技术在动物类群中的标准基因。利用mtCOI基因对反刍动物奥斯特线虫/马歇尔线虫进行物种鉴定和系统发生关系分析具有很好的前景。
在实际研究中，使用Folmer等人于1994年设计的COI通用引物LCO1490和HCO2198在反刍动物奥斯特线虫/马歇尔线虫这一类群中扩增效率较低，阻碍了DNA条形码技术在上述的应用。因此，奥斯特线虫/马歇尔线虫COI基因扩增引物的设计与应用，对利用分子方法鉴定奥斯特线虫、马歇尔线虫物种以及系统发生关系分析具有重要意义，同时也能为反刍动物胃肠道寄生虫流行病学调查提供技术条件。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种奥斯特线虫/马歇尔线虫COI基因的扩增引物，其可以有效扩增出通用引物LCO1490和HCO2198不能扩增的奥斯特线虫/马歇尔线虫的COI目的片段。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种奥斯特线虫/马歇尔线虫COI基因的扩增引物，其包括：
GNF：5'-ACTGCTCATGCTATTTTAA-3'；
GNR：5'-GCCCACACMACACAACCAAT-3'。
本发明还提供一种含有所述引物的用于检测奥斯特线虫/马歇尔线虫的试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明还提供了所述引物或所述试剂盒在检测奥斯特线虫/马歇尔线虫中的应用。
本发明还提供了奥斯特线虫/马歇尔线虫的特异性PCR检测方法，包括以下步骤：
1)提取样品DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用所述的引物GNF和GNR进行PCR扩增反应；
3)分析PCR产物。
进一步地，PCR反应体系以20μl计为：2μL 10x Buffer，2μL DNTP(2mM)，1.2μLMgCl2(25mM)，2μL引物GNF(10μM)，2μL引物GNR(10μM)，0.16μL r-Taq(5u/μL)，1μL DNA模板，9.64μL双蒸水。
进一步地，PCR反应条件为：PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30S，45℃退火30S，72℃延伸1min，共38个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的奥斯特线虫/马歇尔线虫COI基因的扩增引物，可以有效扩增出通用引物LCO1490和HCO2198不能扩增的奥斯特线虫/马歇尔线虫的COI目的片段。满足反刍动物奥斯特线虫/马歇尔线虫的物种分子鉴定需求，同时也能为奥斯特线虫/马歇尔线虫种系发生关系研究、反刍动物胃肠道寄生虫病防控提供可靠的分子技术指导。
附图说明
图1为本发明设计的奥斯特线虫/马歇尔线虫正向扩增引物GNF序列与通用扩增引物LCO1490/HCO2198扩增的奥斯特线虫/马歇尔线虫COI序列进行BLAST比对分析的结果；其中1：GNF引物序列；2：普通奥斯特线虫(Ostertagia circumcincta)COI序列；3：布里亚特奥斯特线虫(Ostertagia buriatica)COI序列；4：西藏奥斯特线虫(Ostertagiaxizangensis)COI序列；5：西方奥斯特线虫(Ostertagia occidentalis)COI序列；6：许氏马歇尔线虫(Marshallagia hsui)COI序列；7：矛形奥斯特线虫(Marshallagia lanceata)COI序列；8：吴兴奥斯特线虫(Marshallagia wuhingensis)COI序列；9：蒙古马歇尔线虫(Marshallagia mongolica)COI序列。
图2为本发明设计的奥斯特线虫/马歇尔线虫反向扩增引物GNR序列与获取的普通奥斯特线虫/布里亚特奥斯特线虫/奥氏奥斯特线虫/蒙古马歇尔线虫COI序列进行BLAST比对分析的结果，四条序列均为LCO1490/HCO2198扩增COI序列的3’端侧翼序列；其中1：GNR引物序列；2：蒙古马歇尔线虫序列；3：普通奥斯特线虫序列；4：奥氏奥斯特线虫序列；5：布里亚特奥斯特线虫序列。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1、样品采集：于2011年～2014年，从中国新疆、内蒙古、青海草原牧区共采集反刍动物奥斯特线虫/马歇尔线虫共2个属11个种类的111个个体。
2、DNA提取：用苯酚-氯仿法或基因组提取试剂盒对采集样品进行DNA提取。
3、COI通用引物扩增：利用Folmer于1994年设计的COI通用扩增引物
LCO1490F：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’
HCO2198R：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’
4、对上述采集的反刍动物奥斯特线虫/马歇尔线虫111个个体进行PCR扩增。采用标准扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸1min，共38个循环；72℃延伸7min，4℃保存。扩增产物经1.5倍的琼脂糖电泳检测后，送往测序公司进行双向测序。最终获得2属9种82个个体的COI序列，其长度约为670bp。其余29个个体均未扩增出，未扩增出的个体属于达荷奥斯特线虫(Ostertagia dahurica)以及粗刺马歇尔线虫(Ostertagia lanceata)两个种。
5、奥斯特线虫/马歇尔线虫COI序列3’端侧翼序列的获得：利用MEGA软件中CLUSTALW软件将上述测得的82条COI序列进行比对，选取该段最保守序列分别设计扩增引物：
GNF1：5’-GATTTTAGATTCTTGTTTTG-3’(SEQ ID No.3)；
GNR1：5’-TTACCCCCAGTACTAGGRTC-3’(SEQ ID No.4)。
经实际PCR扩增验证，上述引物(GNF1和GNR1)仅能获取剩余29个个体中的16个个体的COI序列，仍然不能有效扩增剩余29个个体的COI序列。
为了设计更加有效的扩增引物，发明人应用Tail-PCR对利用通用引物扩增获得的COI序列的3’端侧翼序列进行扩增。最终获取了普通奥斯特线虫(Ostertagiacircumcincta)、奥氏奥斯特线虫(Ostertagia ostertagia)、布里亚特奥斯特线虫(Ostertagia buriatica)以及蒙古马歇尔线虫(Maeshallagia mongolica)四种线虫的通用引物扩增序列及其侧翼序列，其具体核苷酸序列见SEQ ID No.5-8。
剩余五种未获得侧翼序列的线虫(西藏奥斯特线虫(Ostertagia xizangensis)、西方奥斯特线虫(Ostertagia occidentalis)、许氏马歇尔线虫(Marshallagia hsui)、矛形奥斯特线虫(Ostertagia lanceata)以及吴兴奥斯特线虫(Ostertagia wuhingensis))的通用引物扩增序列的核苷酸序列见SEQ ID No.9-13。
6、在侧翼序列的基础上，筛选出最保守的片段，利用引物设计软件PrimerPremier 5.0设计引物对GNF/GNR。
7、引物扩增：将GNF/GNR引物对用于通用PCR引物不能扩增的29个个体。PCR热循环测试温度范围为42℃～50℃。扩增产物用1.5倍的琼脂糖电泳检测。
8、GNF/GNR引物扩增结果：该引物成功扩增出通用PCR引物不能扩增的29个个体的mtCOI序列，扩增效果较好，其中包括通用引物不能扩增的达荷奥斯特线虫(Ostertagiadahurica)以及粗刺马歇尔线虫(Ostertagia lanceata)两个种的COI序列，其详细序列见SEQ ID No.14以及SEQ ID No.15。
9、特异性扩增引物序列：实验数据表明，最终设计的GNF/GNR引物可有效扩增出通用COI引物LCO1490/HCO2198所不能扩增的反刍动物奥斯特线虫/马歇尔线虫的mtCOI序列。
引物序列为：
GNF：5'-ACTGCTCATGCTATTTTAA-3'；
GNR：5'-GCCCACACMACACAACCAAT-3'。
利用此引物扩增出的DNA片段长度约为680bp。
10、GNF/GNR引物扩增条件：上述GNF/GNR扩增引物的20μL PCR反应体系为：2μL10x Buffer，2μL DNTP(2mM)，1.2μL Mgcl2(25mM)，2μL引物GNF(10μM)，2μL引物GNR(10μM)，0.16μL r-Taq(5u/μL)，1μL DNA模板，9.64μL双蒸水。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30S，45℃退火30S，72℃延伸1min，共38个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.奥斯特线虫/马歇尔线虫COI基因的扩增引物，其特征在于，其包括：
GNF：5'-ACTGCTCATGCTATTTTRA-3'；
GNR：5'-GCCCACACMACACAACCAAT-3'。
2.含有权利要求1所述引物的用于检测奥斯特线虫/马歇尔线虫的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.权利要求1所述引物或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测奥斯特线虫/马歇尔线虫中的应用。
6.奥斯特线虫/马歇尔线虫的特异性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取样品DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物GNF和GNR进行PCR扩增反应；
3)分析PCR产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μl计为：2μL 10xBuffer，2μL DNTP，1.2μL MgCl2，2μL引物GNF，2μL引物GNR，0.16μL r-Taq，1μL DNA模板，9.64μL双蒸水。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸1min，共38个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
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