CN103409541B - 一种试剂盒在检测多种生物pcr反应假阴性中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种试剂盒在检测PCR反应假阴性中的用途，所述的试剂盒包含序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，还可进一步包含序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列、dNTPs、DNA聚合酶和PCR反应液，所述的PCR反应其DNA模板包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，如人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴或鸡全基因组DNA。本发明的试剂盒扩增目的片段特异性强、灵敏性高、重复性好，能用于检测PCR反应是否为假阴性，使结果更有说服力，可提高临床上易于出现假阴性的疾病诊断结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种试剂盒在检测多种生物PCR反应假阴性中的用途。
背景技术
PCR技术即聚合酶链式反应，用于放大特定的DNA片段，是现代分子生物研究的基础技术之一，已广泛应用于感染性疾病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、法医学、动植物和考古等的诊断和研究中。PCR技术有着灵敏度高、特异性强、快速简便的优点，但是也有其局限性，导致结果不是非常可靠性，其中常见的是假阳性和假阴性的问题。
假阳性是指不含目的片段的模板经过PCR，扩增出了与目的模板大小差不多的片段，给人一种含有目的片段的假象。假阴性是指模板中含有目的片段，但由于实验各方面的原因，没有扩增出目的条带，让人误以为是阴性，所以叫假阴性，说明PCR反应体系中存在抑制物。
PCR的假阳性问题深受重视，假阴性则相对重视不够，但PCR假阴性问题相对于某些方面更为严重，比如临床检测中大三阳检出率低，假阴性就是“罪魁祸首”，可见假阴性问题的严重性。实际上PCR假阳性的问题是比较单纯的，一般仅涉及反应体系污染和引物的特异性问题，都可以很好地解决。而PCR的假阴性问题却不同，它涉及了参与PCR实验的几乎所有人员和技术环节，十分复杂，包括仪器因素、试剂因素、模板因素、操作人员素质及其他因素，很难找到具体原因，较难排查。
因而若能够有一条大小合适的DNA片段作为指示条带，针对该指示条带设计一对特异性强、灵敏度高的引物，直接检测PCR反应是否受抑制即是否存在假阴性问题，使结果真实可靠，显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种试剂盒在检测PCR反应假阴性中的用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种试剂盒在检测PCR反应假阴性中的用途，所述的试剂盒包含序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述的PCR反应其DNA模板包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
优选的，所述的试剂盒还包括序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
优选的，所述的试剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶和PCR反应液。
优选的，所述的DNA模板是人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴或鸡全基因组DNA。
本发明优点在于：
本发明提供了一种试剂盒在检测PCR反应假阴性中的用途，该试剂盒包含可以特异性扩增人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴、鸡等多种生物全基因组DNA中152bp DNA片段的引物，该引物特异性强、灵敏度高、实验重复性好，借助于该试剂盒可以检测以人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴、鸡全基因组DNA为模板的PCR反应是否为假阴性，使PCR结果更有说服力，尤其针对目前临床上易于出现假阴性的疾病诊断，为疾病的确诊提供了保障和便利。
附图说明
附图1是使用ECP-F和ECP-R引物，分别以人、大鼠全基因组DNA为模板扩增152bp DNA目的指示条带的电泳图谱。M泳道是NEB的100bp DNA Ladder，从下到上分别是100bp、200bp、300bp、400bp、500bp（加亮）、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp（加亮）、1200bp、1517bp；泳道1、2分别是以人、大鼠全基因组DNA为模板的152bp DNA目的指示条带扩增产物。
附图2是使用ECP-F和ECP-R引物，分别以人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴、鸡9种生物全基因组DNA为模板扩增152bp DNA目的指示条带的电泳图谱。M泳道是NEB的100bp DNA Ladder，从下到上分别是100bp、200bp、300bp、400bp、500bp（加亮）、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp（加亮）、1200bp、1517bp；泳道1-9分别是以人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴、鸡全基因组DNA为模板的152bp DNA目的指示条带扩增产物。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
1、引物设计
选择多种生物保守序列中的一段152bp DNA序列（SEQ ID NO.1），针对该序列设计一对PCR扩增引物，命名为ECP-F和ECP-R。其具体序列为：
ECP-F（SEQ ID NO.2）：5’- TTCTTGATCGGGTTTGGGGG -3’；
ECP-R（SEQ ID NO.3）：5’- CAGCTGCCTCTTTCAATGCC -3’。
2、引物特异性测试
（1）制备DNA模板
按常规方法如CTAB法分别从人、大鼠血液样本中抽提全基因组DNA。
（2）PCR反应
分别以制备得到的人、大鼠全基因组DNA为模板，以ECP-F和ECP-R为引物进行PCR反应，设立不含DNA组为阴性对照。
反应体系为：
| 组分 | 样品 |
| 10×Buffer | 2.5μl |
| dNTP (2.5mM） | 1μl |
| Sample | 1μl |
| Taq酶(5U/μl) | 0.2μl |
| H2O | 20.3μl |
反应条件为：将PCR管置于热循环仪上，按以下条件开始反应
（3）扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳。
从图1可以看出152bp DNA目的指示条带扩增效率非常高，条带单一，无非特异性条带，同时阴性对照PCR产物电泳无特异性条带产生，表明本发明设计的引物与选定的152bp DNA目的指示条带特异性结合非常好。
3、引物多物种通用性测试
提取人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴、鸡各物种的全基因组DNA，进行PCR扩增，设立不含DNA组为阴性对照。DNA模板提取方法、PCR反应体系及条件、阴性对照设置均同上。从图2可以看出本发明设计的引物在上述生物中都能很好地扩增出152bp DNA目的指示条带，同时实验结果显示阴性对照无特异性条带产生，表明该引物通用于上述9种生物，且特异性强。
重复上述实验10次，结果均克隆出单一的152bp DNA目的指示条带。
实施例2
分别将人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴、鸡全基因组DNA浓度分别十倍梯级稀释数次，使DNA含量分别为100ng、10ng、1ng、0.1ng、10pg、1pg、0.1pg、10fg、1fg、0.1fg。将上述不同浓度梯度的DNA模板分别按照实施例1的PCR反应体系和条件进行反应，结束后观察扩增情况。设立不含DNA组为阴性对照。
PCR扩增结果表明，本发明设计的引物PCR检测人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴、鸡全基因组DNA的敏感程度均可以达到10fg，灵敏性高。
实施例3
一种试剂盒，试剂盒中含有下列试剂和材料：
引物溶液：ECP-F（SEQ ID NO.2，5μmol/L）；ECP-R（SEQ ID NO.3，5μmol/L）。
实施例4
一种试剂盒，试剂盒中含有下列试剂和材料：
1、引物溶液：ECP-F（SEQ ID NO.2，5μmol/L）；ECP-R（SEQ ID NO.3，5μmol/L）；
2、指示条带Marker：152bp的目的指示条带（SEQ ID NO.1，450ng/5μL）。
实施例5
一种试剂盒，试剂盒中含有下列试剂和材料：
1、引物溶液：ECP-F（SEQ ID NO.2，5μmol/L）；ECP-R（SEQ ID NO.3，5μmol/L）；
2、指示条带Marker：152bp的目的指示条带（SEQ ID NO.1，450ng/5μL）；
3、dNTPs（2.5mol/L）；
4、DNA聚合酶（8,000 units/ml）；
5、10×反应缓冲液，组成包括：200mM Tris-HCl，100mM (NH4)2SO4， 100mM KCl，20mM MgSO4，1% Triton X-100，pH8.8。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州吉泰生物科技有限公司
<120> 一种试剂盒在检测多种生物PCR反应假阴性中的用途
<130> /
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 152
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttcttgatcg ggtttggggg agggggtgag taagtacatc tgattactga agtacaaagc 60
attgaaagga tgttgtcttg agcctttcat gtagtcttaa tggtggcttt tttgtcaaat 120
ttacccattt gcggcattga aagaggcagc tg 152
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcttgatcg ggtttggggg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cagctgcctc tttcaatgcc 20
Claims (4)
1.一种试剂盒在检测PCR反应假阴性中的用途，其特征在于，所述的试剂盒包含序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述的PCR反应其DNA模板包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒还包括序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶和PCR反应液。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的DNA模板是人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴或鸡全基因组DNA。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN201310361656.1A CN103409541B (zh) | 2013-08-19 | 2013-08-19 | 一种试剂盒在检测多种生物pcr反应假阴性中的用途 |
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-
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