CN103409544B - 一种引物在检测多种生物的pcr反应假阴性中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种引物在检测PCR反应假阴性中的用途，所述的引物包含序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，所述的PCR反应其DNA模板包含SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，如人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴或鸡全基因组DNA。本发明的引物扩增特异性好、灵敏性高、实验重复性好，使PCR结果更有说服力，尤其针对目前临床上易于出现假阴性的疾病诊断，本发明更是为疾病的确诊提供了保障，该引物可用于制备成试剂盒，为科学研究和临床诊断排除PCR假阴性提供便利。

Description

一种引物在检测多种生物的PCR反应假阴性中的用途

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种引物在检测多种生物的PCR反应假阴性中的用途。

背景技术

PCR技术即聚合酶链式反应，用于放大特定的DNA片段，是现代分子生物研究的基础技术之一，已广泛应用于感染性疾病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、法医学、动植物和考古等的诊断和研究中。PCR技术有着灵敏度高、特异性强、快速简便的优点，但是也有其局限性，导致结果不是非常可靠性，其中常见的是假阳性和假阴性的问题。

假阳性是指不含目的片段的模板经过PCR，扩增出了与目的模板大小差不多的片段，给人一种含有目的片段的假象。假阴性是指模板中含有目的片段，但由于实验各方面的原因，没有扩增出目的条带，让人误以为是阴性，所以叫假阴性，说明PCR反应体系中存在抑制物。

PCR的假阳性问题深受重视，假阴性则相对重视不够，但PCR假阴性问题相对于某些方面更为严重，比如临床检测中大三阳检出率低，假阴性就是“罪魁祸首”，可见假阴性问题的严重性。实际上PCR假阳性的问题是比较单纯的，一般仅涉及反应体系污染和引物的特异性问题，都可以很好地解决。而PCR的假阴性问题却不同，它涉及了参与PCR实验的几乎所有人员和技术环节，十分复杂，包括仪器因素、试剂因素、模板因素、操作人员素质及其他因素，很难找到具体原因，较难排查。

因而若能够有一条大小合适的DNA片段作为指示条带，针对该指示条带设计一对特异性强、灵敏度高的引物，直接检测PCR反应是否受抑制即是否存在假阴性问题，使结果真实可靠，显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种引物的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种引物在检测PCR反应假阴性中的用途，所述的引物包含序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述的PCR反应其DNA模板包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

所述的DNA模板是人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴或鸡全基因组DNA。

本发明优点在于：

本发明提供了一对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物的用途，该对引物可以特异性扩增人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴、鸡等多种生物全基因组DNA中152bp DNA保守片段，特异性强、灵敏性高、实验重复性好。以该引物为对照，可用于检测以人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴、鸡全基因组DNA为模板的PCR反应是否为假阴性，使PCR结果更有说服力，尤其针对目前临床上易于出现假阴性的疾病诊断，本发明更是为疾病的确诊提供了保障。该引物可制备成试剂盒，为科学研究和临床诊断排除PCR假阴性提供便利。

附图说明

附图1是使用本发明的引物，分别以人、大鼠全基因组DNA为模板扩增152bp DNA目的指示条带的电泳图谱。M泳道是NEB的100bp DNA Ladder，从下到上分别是100bp、200bp、300bp、400bp、500bp（加亮）、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp（加亮）、1200bp、1517bp；泳道1、2分别是以人、大鼠全基因组DNA为模板的152bp DNA目的指示条带扩增产物。

附图2是使用本发明的引物，分别以人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴、鸡9种生物全基因组DNA为模板扩增152bp DNA目的指示条带的电泳图谱。M泳道是NEB的100bp DNA Ladder，从下到上分别是100bp、200bp、300bp、400bp、500bp（加亮）、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp（加亮）、1200bp、1517bp；泳道1-9分别是以人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴、鸡全基因组DNA为模板的152bp DNA目的指示条带扩增产物。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1、引物设计

选择多种生物保守序列中的一段152bp DNA序列（SEQ ID NO.1），针对该序列设计一对PCR扩增引物，命名为ECP-F和ECP-R。其具体序列为：

ECP-F（SEQ ID NO.2）：5’- TTCTTGATCGGGTTTGGGGG -3’；

ECP-R（SEQ ID NO.3）：5’- CAGCTGCCTCTTTCAATGCC -3’。

2、引物特异性测试

（1）制备DNA模板

按常规方法如CTAB法分别从人、大鼠血液样本中抽提全基因组DNA。

（2）PCR反应

分别以制备得到的人、大鼠全基因组DNA为模板，以ECP-F和ECP-R为引物进行PCR反应，设立不含DNA组为阴性对照。

反应体系为：

组分	样品
		10×Buffer	2.5μl
dNTP (2.5mM）	1μl
		Sample	1μl
Taq酶(5U/μl)	0.2μl
		H2O	20.3μl

反应条件为：将PCR管置于热循环仪上，按以下条件开始反应

（3）扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳。

从图1可以看出152bp DNA目的指示条带扩增效率非常高，条带单一，无非特异性条带，同时阴性对照PCR产物电泳无特异性条带产生，表明本发明设计的引物与选定的152bp DNA目的指示条带特异性结合非常好。

3、引物多物种通用性测试

提取人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴、鸡各物种的全基因组DNA，进行PCR扩增，设立不含DNA组为阴性对照。DNA模板提取方法、PCR反应体系及条件、阴性对照设置均同上。从图2可以看出本发明设计的引物在上述生物中都能很好地扩增出152bp DNA目的指示条带，同时实验结果显示阴性对照无特异性条带产生，表明该引物通用于上述9种生物，且特异性强。

重复上述实验10次，结果均克隆出单一的152bp DNA目的指示条带。

实施例2

分别将人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴、鸡全基因组DNA浓度分别十倍梯级稀释数次，使DNA含量分别为100ng、10ng、1ng、0.1ng、10pg、1pg、0.1pg、10fg、1fg、0.1fg。将上述不同浓度梯度的DNA模板分别按照实施例1的PCR反应体系和条件进行反应，结束后观察扩增情况。设立不含DNA组为阴性对照。

PCR扩增结果表明，本发明的引物PCR检测人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴、鸡全基因组DNA的敏感程度均可以达到10fg，灵敏性高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>  苏州吉泰生物科技有限公司

<120>  一种引物在检测多种生物的PCR反应假阴性中的用途

<130>  /

<160>  3    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  152

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

ttcttgatcg ggtttggggg agggggtgag taagtacatc tgattactga agtacaaagc          60

attgaaagga tgttgtcttg agcctttcat gtagtcttaa tggtggcttt tttgtcaaat              120

ttacccattt gcggcattga aagaggcagc tg                                    152

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

ttcttgatcg ggtttggggg                                          20

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

cagctgcctc tttcaatgcc                                          20

Claims (2)

1.一种引物在制备检测PCR反应假阴性试剂中的用途，其特征在于，所述的引物包含序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述的PCR反应其DNA模板包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的DNA模板是人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猴或鸡全基因组DNA。