CN102618666B

CN102618666B - 用于同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、i型和ii型犬腺病毒的多重pcr检测引物

Info

Publication number: CN102618666B
Application number: CN 201210063461
Authority: CN
Inventors: 刘大飞; 姜一曈; 张洪英; 程景; 戚亭
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-03-12
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2032-03-12
Also published as: CN102618666A

Abstract

本发明公开了一套用于检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒的多重PCR检测引物，所述引物包括三对引物，其中，用于犬瘟热病毒检测的引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；用于犬细小病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；用于I型和II型犬腺病毒检测的引物序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。采用本发明引物通过多重PCR的方法可以同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。

Description

用于同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒的多重PCR检测引物

技术领域

本发明涉及一套检测病毒的引物，尤其涉及一套用于同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒多重PCR方法的引物，属于病毒的检测领域。

背景技术

犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)、犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)和犬腺病毒(Canine adenovirus，CAV)是引起犬发病的主要病原，这3种病毒单一或混感后临床致死率可达50％-100％，给养犬业造成巨大经济损失。

临床上，CDV引起的犬瘟热主要有呼吸型、消化型、神经型和混合型四种，CPV主要引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎。CAV根据其血凝和中和试验等特性不同可将CAV分为1型和2型，即CAV-I和CAV-II。。CAV-I在临床上可导致犬传染性肝炎、狐狸和熊脑炎的发生。CAV-II引起犬、狐传染性喉气管炎。

犬的这几种主要疾病临床症状相似，并常有混合感染，给诊断造成困难。常用的单项PCR方法耗时长，有必要建立快速的早期诊断方法，以便尽快采取有效的防控措施，减少这些疾病对养犬业造成的危害。鉴于此，本试验建立了CDV、CPV、CAV-I和CAV-II的多重PCR检测方法，为临床检测提供保障

发明内容

本发明所要解决的结束问题是克服现有技术的不足，提供一套可用于检测犬瘟热病毒野毒株的RT-LAMP引物。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一套用于检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒的多重PCR检测引物，其特征在于：所述引物包括三对引物，其中，所述的用于犬瘟热病毒检测的引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述的用于犬细小病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；所述的用于I型和II型犬腺病毒检测的引物序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供了一种检测犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、I型和II型犬腺病毒(CAV-I、CAV-II)的方法，其特征在于包括以下步骤：

配制25μL PCR反应体系：10X Ex Buffer 2.5μL、dNTPs 2μL、Ex Taq DNA聚合酶0.25μL、CDV-N1和CDV-N2各0.35μL、CPV-NS1和CPV-NS2各0.35μL、CAV-E31和CAV-E32各0.65μL、CDV模板0.75μL、CPV模板0.75μL、CAV-I模板0.75μL、CAV-II模板1.5μL、灭菌ddH₂O 13.5μL；

其中，引物CDV-N1和CDV-N2用于犬瘟热病毒的检测，其序列分别为SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示；引物CPV-NS1和CPV-NS2用于犬细小病毒的检测，其序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；引物CAV-E31和CAV-E32用于I型和II型犬腺病毒的检测，其序列分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30S，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min；

观察：取5μL PCR产物，经1％琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察结果。

进一步的，本发明还提供了一种用于检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒的试剂盒，其特征在于包含本发明所述的引物。

更进一步的，本发明还提供了所述的引物在制备检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒单一感染或混合感染试剂中的应用。及

所述的试剂盒在制备检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒单一感染或混合感染试剂中的应用。

以本发明所设计的引物采用多重PCR检测方法对CDV、CPV、CAV-I和CAV-II进行检测，检测结果均为阳性，而对其他常见犬源性病毒检测结果均为阴性。应用本发明引物序列采用多重PCR方法，可以同时检测CDV、CPV、CAV-I和CAV-II，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。本发明所设计的引物序列在发病犬早期检测和快速诊断中具有重要意义。

附图说明

图1为多重PCR扩增结果；

1：阴性对照；2：CDV；3：CPV；4：CAV-I；5：CAV-II；6： CDV+CPV+CAV-I+CAV-II；M：DL 2000 DNA Marker

图2为多重PCR特异性试验结果；

1：CDV；2：CPV；3：CAV-I；4：CAV-II；5：CDV+CPV+CAV-I+CAV-II；6：RV；7：阴性对照；M：DL 2000DNA Marker

图3为多重PCR敏感性试验结果。

M：DL 2000DNA Marker；1：阴性对照；2：10^-1；3：10^-2；4：10^-3；5：10^-4；6：10^-5；7：10^-6

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1材料和方法

1.1病毒株CDV株、CPV株、CAV-I、CAV-II株及狂犬病毒(RV)株均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存。

1.2主要试剂

Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、DL 2000DNA Marker、M-MLV酶和RNA酶抑制剂购自购自宝生物工程(大连)公司；DNA提取试剂盒购自Omega公司；RNA提取试剂盒购自Qiagen公司。

1.3引物设计

分别根据GenBank中CDVN基因序列、CPVNS基因序列和CAV E3基因序列，设计3对特异引物，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。序列见表1。

表1多重PCR引物序列

1.4RNA和DNA的提取

按RNA提取试剂盒和DNA抽提试剂盒说明书分别提取病毒RNA和病毒DNA。

1.5多重PCR方法建立

以CDV的cDNA和CPV、CAV-I、CAV-II的DNA 混合物作为多重PCR的模板，建立PCR反应。采用25μL反应体系：10 X Ex Buffer 2.5μL、dNTPs 2μL、Ex Taq DNA聚合酶0.25μL、CDV-N1和CDV-N2各0.35μL、CPV-NS 1和CPV-NS2各0.35μL、CAV-E31和CAV-E32各0.65μL、CDV模板0.75μL、CPV模板0.75μL、CAV-I模板0.75μL、CAV-II模板1.5μL、灭菌ddH₂O 13.5μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30S，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min。取5μL PCR产物，经1％琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察结果。

1.6多重PCR方法的特异性试验

以优化的多重PCR条件对CDV、CPV、CAV-I、CAV-II和RV进行PCR扩增，以检测该方法的特异性。

1.7多重PCR方法的敏感性试验

分别测定CDV、CPV、CAV-I和CAV-II的模板浓度，稀释成相同浓度后，再10倍梯度稀释，测定该双重PCR方法的敏感性。

2结果

2.1多重PCR的扩增

采用优化的PCR方法，对CDV、CPV、CAV-I和CAV-II的核酸模板及混合模板进行PCR扩增，结果获得大小约为500bp、300bp、600bp和1000bp的片段，与测序结果507bp、287bp、598bp和1027bp一致，结果如图1所示。

2.2多重PCR的特异性试验

用建立的多重PCR方法，对CDV、CDV+CPV+CAV-I+CAV-II、CPV、CAV-I、CAV-II、RV和健康犬的核酸提取物进行扩增，结果显示，只有CDV、CDV+CPV+CAV-I+CAV-II、CPV、CAV-I、CAV-II有特异性的扩增产物，而RV 未见扩增，表明该方法具良好特异性(图2所示。)。

2.3多重PCR的敏感性试验

在优化的PCR反应条件下，CDV的最高检测敏感度为10^-7(10^1.9TCID₅₀)，CPV的最高检测敏感度为10^-7(10^1.7TCID₅₀)，CAV-I的最高检测敏感度为10^-7(10^1.7TCID₅₀)，CAV-II的最高检测敏感度为10^-7(10^2.2TCID₅₀)(图3所示。)。

Claims

1.一套用于检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒的多重PCR检测引物，其特征在于：所述引物包括三对引物，其中，所述的用于犬瘟热病毒检测的引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述的用于犬细小病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；所述的用于I型和II型犬腺病毒检测的引物序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

2.一种用于检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的引物。

3.权利要求1所述的引物在制备检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒单一感染或混合感染试剂中的应用。

4.权利要求2所述的试剂盒在制备检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、I型和II型犬腺病毒单一感染或混合感染试剂中的应用。