CN105256069B - 鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂及应用 - Google Patents

鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂及应用。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂，由名称分别为FIP、BIP、F3、B3、LF和LB的单链DNA组成；所述FIP、所述BIP、所述F3、所述B3、所述LF和所述LB分别为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的DNA。实验证明，本发明的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂适用于批量及一般实验室的犬传染性肝炎病毒的检测，具有高灵敏度和特异性，使基层及现场检测成为了可能。

Description

鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂及应用。
背景技术
犬传染性肝炎(Infectious canine hepatitis,ICH)是由犬腺病毒I型(Canineadenovirus I,CAV-I)感染引发的犬的一种急性败血性传染病，该病于1925年首次被发现，1984年，我国首次分离出该病毒CAV-I，在临床上可导致犬传染性肝炎、狐狸和熊脑炎等疾病的发生。临诊以肝小叶中心坏死、肝实质细胞和皮质细胞核内出现包涵体以及出血为特征，常引起急性坏死性肝炎和角膜混浊(即蓝眼病)。该病以刚离乳到一岁以内的幼犬感染率和死亡率为最高，死亡率高达40％，本病在世界范围内流行，既严重威胁着家养宠物的身体健康，又对我国养犬业、皮毛动物养殖业等危害较大，给养犬业和宠物爱好者带来巨大的经济损失。
犬传染性肝炎病病毒属于腺病毒科乳腺动物腺病毒属，DNA型，直径70-80纳米。病犬和带毒犬是本病的传染源。病犬的呕吐物、唾液、鼻液、粪便和尿液等排泄物和分泌物中都带有病毒；康复犬可获终生免疫，但病毒能在肾脏内生存，经尿长期排毒。犬传染性肝炎病病毒主要通过消化道感染，也可以以外寄生虫为媒介传染，但不能通过空气经呼吸道感染。
突然发病和出血时间延长是犬传染性肝炎的暗示，重症病例初期与犬瘟热极为相似，仅靠临床症状和病理变化难以进行鉴别诊断，确诊尚需依赖于实验室特异性的诊断，如病毒分离、血凝抑制试验及皮内变态反应等检测方法，而且还要与犬瘟热进行鉴别诊断。针对病毒核酸的检测，无论从特异性、灵敏度还是检测效率角度考虑都可视为最佳方法。
传统方法主要依赖病毒分离、病理学及血清学方法等，但这些方法不仅繁琐耗时，且敏感性和特异性较差，不能及时确诊。近年来，由于核酸杂交、PCR等技术的应用，使CAV-I感染的诊断进入到分子生物学阶段，建立的PCR和real-time PCR方法需要昂贵的仪器、一定要求的实验室条件和经过技能培训的技术人员。目前，PCR、荧光定量PCR、分子杂交等技术已经逐渐应用于各类疾病的快速诊断当中，较高的检测成本以及昂贵的检测仪器都限制了技术的推广应用。日本Notomi等(2000)建立了环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技术，LAMP是在PCR基础上创建的另外一种形式的核酸扩增技术，利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，识别目的基因的特定区域，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术，Nagamine等于2002年通过对LAMP检测技术的改进，引入1对环引物，大大提高了扩增效率。LAMP反应结果的观察方法非常简便，反应结束后可通过肉眼在可见光或紫外线下直接观察反应液的颜色变化来判定结果。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高鉴定犬传染性肝炎病毒的灵敏度和特异性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂，由名称为FIP的单链DNA、名称为BIP的单链DNA、名称为F3的单链DNA、名称为B3的单链DNA、名称为LF的单链DNA和名称为LB的单链DNA组成；
所述FIP为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA；
所述BIP为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA；
所述F3为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的DNA；
所述B3为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的DNA；
所述LF为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的DNA；
所述LB为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的DNA。
上述鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂中，所述FIP、所述BIP、所述F3、所述B3、所述LF和所述LB的摩尔比可为4：4：1：1：4：4。
上述鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂中，所述FIP、所述BIP、所述F3、所述B3、所述LF和所述LB可各自独立包装，也可混合在一起。
解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的系统。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的系统，含有所述成套试剂与M；所述M为链置换型DNA聚合酶、反应缓冲液、甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、Mg2+和/或羟基萘酚蓝。
上述鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的系统，所述系统还可含有所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。。
上述鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的系统，所述系统可为环介导等温扩增试剂或试剂盒。
上述鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的系统，所述系统还可含有利用环介导等温扩增鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒所需的仪器。
具体来说，鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的系统可包括所述成套试剂以及进行环介导等温扩增所需要的其它试剂和仪器。鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的系统可只由所述成套试剂组成，也可只由所述成套试剂与所述进行环介导等温扩增所需要的其它试剂组成，也可只由所述成套试剂与所述进行环介导等温扩增所需要的仪器组成，也可只由所述成套试剂、所述进行环介导等温扩增所需要的其它试剂与所述进行环介导等温扩增所需要的仪器组成。
所述进行环介导等温扩增所需要的其它试剂可为链置换型DNA聚合酶、反应缓冲液、甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、Mg2+和羟基萘酚蓝中的至少一种。
所述链置换型DNA聚合酶可为Bst DNA聚合酶。所述Bst DNA聚合酶可为NEB公司产品。
所述反应缓冲液可为10×ThermoPol Reaction Buffer可为NEB(New EnglandBiolabs)公司货号为M0275S的产品中试剂。
所述甜菜碱可为Sigma公司产品。
所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP(即dNTPs)可为Invitrogen公司产品。
所述Mg2+可为MgSO4。
所述羟基萘酚蓝可为Sigma公司产品。
所述进行环介导等温扩增所需要的仪器可为恒温仪，如恒温水浴锅。
上述鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的系统中，所述链置换型DNA聚合酶为BstDNA聚合酶。
上述鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的系统中，所述系统可为环介导等温扩增试剂或试剂盒。
上述鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的系统中，所述Mg2+、所述甜菜碱、所述dATP、所述dCTP、所述dGTP、所述dTTP、所述FIP、所述BIP、所述F3、所述B3、所述LF、所述LB和所述羟基萘酚的配比可为2.5mmol/L:0.4mol/L:2mmol/L:2mmol/L:2mmol/L:2mmol/L:0.8μmol/L:0.8μmol/L:0.2μmol/L:0.2μmol/L:0.8μmol/L:0.8μmol/L:0.12mmol/L。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂的制备方法。
本发明所提供的所述成套试剂的制备方法，包括将所述FIP、所述BIP、所述F3、所述B3、所述LF和所述LB分别单独包装的步骤。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述系统的制备方法。
本发明所提供的所述系统的制备方法，包括将所述FIP、所述BIP、所述F3、所述B3、所述LF和所述LB分别单独包装的步骤。
本发明所提供的所述系统的制备方法，也可包括将所述FIP、所述BIP、所述F3、所述B3、所述LF和所述LB以及所述链置换型DNA聚合酶、所述反应缓冲液、所述甜菜碱、所述dATP、所述dCTP、所述dGTP、所述dTTP、所述Mg2+和/或所述羟基萘酚蓝分别单独包装的步骤。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂在制备鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒试剂或试剂盒中的应用。
本发明所提供的所述成套试剂在制备鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒试剂或试剂盒中的应用中，所述试剂或试剂盒可为环介导等温扩增试剂或试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂或所述系统在鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒中的应用。
上述应用中，所述成套试剂或所述系统在鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒中的应用可利用环介导等温扩增技术进行。
上述鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂、或上述鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的系统可用于鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒。所述成套试剂或所述系统在鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的应用中，可利用所述成套试剂进行环介导等温扩增，所述环介导等温扩增的反应温度可为59-65℃，具体可为63℃，所述环介导等温扩增的反应时间可为45-90分钟，具体可为30分钟。在鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的应用中，若环介导等温扩增反应体系呈现天蓝色，待测样本含有犬传染性肝炎病毒或候选含有犬传染性肝炎病毒，若所述环介导等温扩增反应体系呈现紫色，待测样本不含有犬传染性肝炎病毒或候选不含有犬传染性肝炎病毒。所述环介导等温扩增反应体系含有所述成套试剂以及进行环介导等温扩增反应所需的其他试剂。进行环介导等温扩增反应所需的其他试剂可为所述Bst DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、所述甜菜碱和/或荧光染料。所述荧光染料可为所述羟基萘酚。
所述环介导等温扩增反应体系中所述FIP的浓度可为0.8μmol/L；所述BIP的浓度可为0.8μmol/L；所述F3的浓度可为0.2μmol/L；所述F3的浓度可为0.2μmol/L；所述LF的浓度可为0.8μmol/L；所述LB的浓度可为0.8μmol/L。所述环介导等温扩增反应体系具体可为含有以下物质的反应体系：所述10×ThermoPol Reaction Buffer、所述Bst DNA聚合酶、所述成套试剂、所述Mg2+、所述甜菜碱、所述dATP、所述dCTP、所述dGTP、所述dTTP、所述羟基萘酚和待测样品DNA，其中所述Mg2+的浓度可为2.5mmol/L；所述dATP、所述dCTP、所述dGTP、所述dTTP的浓度均可为2mmol/L；所述甜菜碱的浓度可为0.4mol/L；所述羟基萘酚的浓度可为0.12mmol/L。实验证明，本发明的鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂检测犬传染性肝炎病毒(CAV)的特异性好，采用6条引物共识别目的片段6个特异性的区域，在该成套试剂特异性检测中只有犬传染性肝炎病毒(CAV)的DNA体系肉眼观察清晰可见荧光颜色的变化，反应体系由紫色变为天蓝色，其他犬细小病毒核酸样品pVCPV-VP2质粒、狂犬病病毒核酸样品pGT质粒、CDV RNA和PRRSV RNA反应体系以及作为负对照的反应体系无任何明显颜色变化，表明无特异性扩增；用本发明的鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂检测犬传染性肝炎病毒(CAV)的灵敏度高，犬传染性肝炎病毒的最低检测浓度为10.4pg犬传染性肝炎病毒基因组/25μL(即浓度为12.6拷贝/μL的犬传染性肝炎病毒)的犬传染性肝炎病毒基因组；用本发明的鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂检测犬传染性肝炎病毒(CAV)的模板量为普通PCR的1％，比普通PCR灵敏度高100倍；用本发明的鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂检测犬传染性肝炎病毒(CAV)，仅要求一台可调的恒温水浴锅等类似的简单恒温仪，不必苛求昂贵的仪器设备，简便快捷；用本发明的鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂检测犬传染性肝炎病毒(CAV)检测快速，能在30min内完成反应；用本发明的鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂检测犬传染性肝炎病毒(CAV)结果可视化，扩增产物无需电泳分析，反应结束后就可直接通过反应产物的颜色变化判断检测结果，又可以避免开盖污染造成下次反应的假阳性，适于基层或现场快速诊断。用本发明的鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂检测犬传染性肝炎病毒阳性检出率高于PCR方法,能有效防止假阴性结果的出现，这一快速简便的LAMP检测方法在基层检疫或现场查验中具有很高的实用价值，能够对疾病更好的作出精确判断，应用前景较为广阔。用本发明的鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂检测犬传染性肝炎病毒(CAV)适用于批量样品的检测及一般实验室的检测，大大提高了结果准确率、降低检测成本、缩短检测周期，为基层现场检验检疫提供了技术支持，也使基层及现场检测成为了可能。
附图说明
图1为鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂的特异性检测。其中，1为CAV-I DNA；2为CDV RNA；3为犬细小病毒核酸样品pVCPV-VP2质粒；4为狂犬病病毒核酸样品pGT质粒；5为PRRSV RNA。
图2为鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂的灵敏度检测。其中，1为104ng反应体系，2为10.4ng反应体系，3为1040pg反应体系，4为104pg反应体系，5为10.4pg反应体系，6为1040fg反应体系，7为104fg反应体系，8为10.4fg反应体系。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的猪繁殖与呼吸综合征病毒SD-TA株(曹丙蕾，张群，凌宗帅等，《猪繁殖与呼吸综合征病毒山东分离株N蛋白基因的原核表达及其单克隆抗体的制备与鉴定》，西南农业学报，2014，4(27)：1772-1776.)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的狂犬病病毒核酸样品pGT质粒(含有狂犬病病毒ERA株糖蛋白基因的质粒载体)(赵忠鹏，夏咸柱，扈荣良等，《表达狂犬病毒糖蛋白抗原的重组犬2型腺病毒的构建及鉴定》，微生物学报，2007，47(2)：335-339.)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的犬瘟热病毒CDV-M1(陈晨，张力燕，李鹏等，《貂源犬瘟热病毒的分离与鉴定》，山东畜牧兽医，2013，10(34)：9-10.)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的犬细小病毒核酸样品pVCPV-VP2质粒(含有CPV的VP2基因的质粒载体)(谢之景，夏咸柱，扈荣良等，《表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬2型腺病毒的构建及鉴定》,病毒学报，2006,3(22)：214-219.)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的犬传染性肝炎病毒CAV-I(温书坤，周爱军、崔言顺.《PCR检测犬传染性肝炎病毒方法的建立》，山东畜牧兽医，2007，5(28)1-2.)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的Bst DNA聚合酶与10×ThermoPol Reaction Buffer均为NEB(NewEngland Biolabs)公司产品，二者均为货号为M0275S的产品中试剂；2000bp DNA Marker、dNTPs、荧光染料SYBR GreenⅠ为Invitrogen公司产品；病毒DNA提取试剂盒和病毒RNA提取试剂盒、反转录试剂盒为TaKaRa公司产品；恒温扩增试剂、荧光染料(钙黄绿素与氯化锰)均为广州迪澳(DEAOU)公司产品；引物的合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
下述实施例中的HNB(羟基萘酚蓝)为Sigma公司产品，货号为33936-10G。
下述实施例中的Betaine(甜菜碱)为Sigma公司产品，货号为B0300。
实施例1、鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂的制备
本申请中的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂，由名称为FIP的单链DNA、名称为BIP的单链DNA、名称为F3的单链DNA、名称为B3的单链DNA、名称为LF的单链DNA和名称为LB的单链DNA组成；
所述FIP为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA；
所述BIP为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA；
所述F3为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的DNA；
所述B3为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的DNA；
所述LF为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的DNA；
所述LB为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的DNA。
该鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂中，所述FIP、所述BIP、所述F3、所述B3、所述LF和所述LB各自独立包装。
实施例2、犬传染性肝炎病毒鉴定的条件优化
利用DNA提取试剂盒提取犬传染性肝炎病毒DNA，得到犬传染性肝炎病毒DNA。
犬传染性肝炎病毒鉴定的反应体系中含有以下物质：
10×ThermoPol Reaction Buffer、Bst DNA聚合酶、Mg2+(即MgSO4，25mmol/L)、dNTP(25mmol/L)、Betaine(甜菜碱)(5mol/L)、FIP(10μmol/L)、BIP(10μmol/L)、F3(5μmol/L)、B3(5μmol/L)、LF(20μmol/L)、LB(20μmol/L)、HNB(3mmol/L)、犬传染性肝炎病毒DNA，用ddH2O补足25μL。
将犬传染性肝炎病毒鉴定的反应体系中对影响扩增反应效率的试剂按照下述进行优化(以下物质的浓度均指在犬传染性肝炎病毒鉴定的反应体系中的浓度)：
MgSO4：2mmol/L、2.5mmol/L、3mmol/L
甜菜碱：0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L
dNTPs(即dATP、dCTP、dGTP或dTTP的浓度)：1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L
实施例1的FIP：0.4μmol/L、0.8μmol/L、1.2μmol/L
实施例1的BIP：0.4μmol/L、0.8μmol/L、1.2μmol/L
实施例1的F3：0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L
实施例1的B3：0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L
实施例1的LF：0.8μmol/L、1.2μmol/L、1.6μmol/L
实施例1的LB：0.8μmol/L、0.24μmol/L、1.6μmol/L
HNB：0.12mmol/L、1.5mmol/L、0.36mmol/L。
将温度按59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃依次递增，多次重复试验后确定最佳退火温度，将反应时间30min、45min、50min和55min依次递增，多次重复试验后确定最短反应时间，反应在恒温水浴锅中进行。反应结束后，记录不同体系反应体系的颜色，选择颜色变化最为明显的反应体系为最佳反应体系。按照如下方法进行结果判定：反应结束后,根据肉眼在可见光下观察到的反应体系的颜色来判定结果，可见光下，阴性样品反应结束后仍为天蓝色，阳性样品反应结束后由反应前的从紫色变为天蓝色。
最终得到的优化的25μl犬传染性肝炎病毒鉴定的反应体系如下：
最优反应条件为63℃30min，80℃作用2min终止反应。
实施例3、鉴定犬传染性肝炎病毒的PCR引物组合物的特异性
用病毒DNA提取试剂盒提取犬传染性肝炎病毒(CAV-I)的DNA，用病毒RNA提取试剂盒分别提取犬瘟热病毒CDV-M1和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SD-TA株的RNA，分别得到CAV-I DNA、CDV RNA和PRRSV RNA。
分别以上述CAV-I DNA以及犬细小病毒核酸样品pVCPV-VP2质粒与狂犬病病毒核酸样品pGT质粒为模板，按照实施例2优化后的反应体系及反应条件进行扩增，并用无菌水设置负对照。
分别CDV RNA和PRRSV RNA为模板，按照下述反应体系及反应条件进行扩增，并用无菌水设置负对照：
最优反应条件为63℃30min，80℃作用2min终止反应。
结果(图1)显示，只有CAV-I DNA的反应体系有颜色变化，反应体系从紫色变为天蓝色，其他犬细小病毒核酸样品pVCPV-VP2质粒、狂犬病病毒核酸样品pGT质粒、CDV RNA和PRRSV RNA反应体系以及作为负对照的反应体系无任何明显颜色变化，表明无特异性扩增，表明本申请的PCR引物组合物特异性好。
实施例4、鉴定犬传染性肝炎病毒的PCR引物组合物的灵敏性
用核酸分析仪测定犬传染性肝炎病毒的OD值，根据阿佛加德罗常数换算出每微升病原中核酸的拷贝数，对并对病原的核酸进行10倍系列稀释，分别得到犬传染性肝炎病毒的以下不同稀释倍数的稀释液：犬传染性肝炎病毒1.58×106拷贝/μL的稀释液(即52ng犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液)、犬传染性肝炎病毒1.58×105拷贝/μL的稀释液(即5.2ng犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液)、犬传染性肝炎病毒1.58×104拷贝/μL的稀释液(即520pg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液)、犬传染性肝炎病毒1.58×103拷贝/μL的稀释液(即52pg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液)、犬传染性肝炎病毒1.58×102拷贝/μL的稀释液(即5.2pg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液)、犬传染性肝炎病毒1.58×101拷贝/μL的稀释液(即520fg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液)、犬传染性肝炎病毒1.58×100拷贝/μL拷贝数的稀释液(即52fg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液)和犬传染性肝炎病毒1.58×10-1拷贝/μL的稀释液(即5.2fg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液)。
将实施例2中优化的体系中犬传染性肝炎病毒DNA 2μL替换为上述52ng犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液2μL、5.2ng犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液2μL、520pg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液2μL、52pg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液2μL、5.2pg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液2μL、520fg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液2μL、52fg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液2μL、5.2fg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液2μL、焦磷酸二乙酯水(DEPC水)2μL，分别得到下列反应体系：104ng反应体系、10.4ng反应体系、1040pg反应体系、104pg反应体系、10.4pg反应体系、1040fg反应体系、104fg反应体系和10.4fg反应体系，以及负对照反应体系。
将上述不同的反应体系于63℃反应30分钟，80℃作用2min终止反应，并观察不同反应体系的颜色变化。结果(图2)显示，104ng反应体系、10.4ng反应体系、1040pg反应体系、104pg反应体系、10.4pg反应体系均呈现天蓝色，1040fg反应体系、104fg反应体系和10.4fg反应体系以及负对照反应体系颜色无变化，均为紫色，表明犬传染性肝炎病毒的最低可以检测到10.4pg犬传染性肝炎病毒基因组/25μL，即可检测到浓度为12.6拷贝/μL的犬传染性肝炎病毒，表明用本发明的PCR引物组合物检测犬传染性肝炎病毒(CAV)的灵敏度高。
应用本申请的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒，对收集的28份临床样品(CAV-I阳性样品为10份、阴性样品为18份)进行检测，其检测结果与病料分离鉴定结果相比完全一致。
对28份可疑样本的检测证实，LAMP阳性检出率高于PCR方法,能有效防止假阴性结果的出现。
对比例1、普通PCR检测犬传染性肝炎病毒
分别以实施例4的52ng犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、5.2ng犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、520pg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、52pg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、5.2pg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、520fg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、52fg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液和5.2fg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液中的犬传染性肝炎病毒基因组为模板，以表1中CAV-F、CAV-R为引物，进行PCR扩增，设置PCR反应体系：10×buffer 2.5μL，Mg2+(25mM)1μL，dNTPMixture(2.5mM)2μL，Taq DNA酶(1U/μL)0.5μL，上下游引物(10μM)各1μL，模板1μL，ddH2O补充至25μL。
PCR反应条件：95℃5min；95℃1min，55℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃7min，4℃保存。反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。将PCR检测结果与LAMP检测方法进行比较，来分析LAMP方法的检测优势。
表1、普通PCR检测犬传染性肝炎病毒的引物
结果显示，普通PCR最低可以检测到浓度为1040pg犬传染性肝炎病毒基因组/25μL的犬传染性肝炎病毒，LAMP方法与PCR反应扩增后的电泳结果进行比较，LAMP方法的模板量的最低检测限为普通PCR的1％，比普通PCR灵敏度高100倍。
对比例2、利用其它引物进行LAMP检测犬传染性肝炎病毒.
用核酸分析仪测定犬传染性肝炎病毒的OD值，根据阿佛加德罗常数换算出每微升病原中核酸的拷贝数，对并对病原的核酸进行10倍系列稀释，分别得到犬传染性肝炎病毒的以下不同稀释倍数的稀释液：41ng犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、4.1ng犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、410pg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、41pg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、4.1pg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、410fg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、41fg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液和4.1fg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液。
按照实施例2中得到的反应体系与反应条件，分别上述41ng犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、4.1ng犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、410pg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、41pg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、4.1pg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、410fg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液、41fg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液和4.1fg犬传染性肝炎病毒基因组/μL的稀释液中的犬传染性肝炎病毒基因组为模板，利用表2中的引物对犬传染性肝炎病毒进行检测。
表2、对比LAMP实验中用到的引物
结果显示，利用表2中的引物检测犬传染性肝炎病毒时，最低可以检测到8.2pg犬传染性肝炎病毒基因组/25μL，即可检测到浓度为9.9拷贝/μL的犬传染性肝炎病毒。

Claims (8)

1.鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂，由名称为FIP的单链DNA、名称为BIP的单链DNA、名称为F3的单链DNA、名称为B3的单链DNA、名称为LF的单链DNA和名称为LB的单链DNA组成；
所述FIP为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA；
所述BIP为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA；
所述F3为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的DNA；
所述B3为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的DNA；
所述LF为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的DNA；
所述LB为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的DNA。
2.鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的系统，含有权利要求1所述成套试剂与M；所述M为链置换型DNA聚合酶、反应缓冲液、甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、Mg2+和/或羟基萘酚蓝；所述系统为环介导等温扩增试剂或试剂盒。
3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于：所述系统还含有所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
4.根据权利要求2或3所述的系统，其特征在于：所述系统还含有利用环介导等温扩增鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒所需的仪器。
5.权利要求1所述成套试剂的制备方法，包括将权利要求1中所述FIP、所述BIP、所述F3、所述B3、所述LF和所述LB分别单独包装的步骤。
6.权利要求2所述系统的制备方法，包括将权利要求1中所述FIP、所述BIP、所述F3、所述B3、所述LF和所述LB分别单独包装的步骤。
7.权利要求3或4所述系统的制备方法，包括将权利要求1中所述FIP、所述BIP、所述F3、所述B3、所述LF和所述LB以及权利要求2或3中所述链置换型DNA聚合酶、所述反应缓冲液、所述甜菜碱、所述dATP、所述dCTP、所述dGTP、所述dTTP、所述Mg2+和/或所述羟基萘酚蓝分别单独包装的步骤。
8.权利要求1所述成套试剂在制备鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒试剂或试剂盒中的应用。
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