CN104313191B - 一步法反转录pcr检测和分型埃博拉病毒5种亚型的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

一步法反转录pcr检测和分型埃博拉病毒5种亚型的引物、探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种一步法反转录PCR检测和分型埃博拉病毒5种亚型的引物、探针及试剂盒,引物和探针的核苷酸序列如图1-图8,试剂盒包括样品DNA模板或者定量标准试剂、PCR缓冲液、FRET-上游引物、FRET-下游引物、的6-FAM探针、LCRed640探针、商业化Taq酶、dNTP、商业化反转录酶、商业化RNA酶抑制剂。本发明依据埃博拉病毒5种亚型中保守区间巧妙地设计1条上游引物、1对探针和5条针对五种埃博拉病毒亚型的下游引物，从而可以同时检测5种亚型的埃博拉病毒。

Description

一步法反转录PCR检测和分型埃博拉病毒5种亚型的引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于埃博拉病毒保守区间、可以对埃博拉病毒5种亚型进行检测和分型的引物、探针及试剂盒。
背景技术
埃博拉病毒病(Ebolavirusdisease,EVD)是由埃博拉病毒(Ebolavirus，EBOV)引起的一种传染性强、死亡率极高的急性出血性、人与非人灵长类动物共患的传染病。因1976年在非洲刚果民主共和国(前扎伊尔)北部的埃博拉河(Ebola)沿岸首次暴发流行而得名。EVD的主要特征是发热迅速，头痛和肌肉疼痛，之后产生咽喉肿痛，恶心，呕吐腹泻以及腹痛，将近一半病人会出现出血症状。此病发病急，病程短，死亡率高达30％-90％，是一种烈性病毒性传染病。EVD目前呈现地方性流行，主要流行于非洲大陆，我国尚未有本病的报道。EBOV已经通过非人灵长类动物试验证实可以通过接触传播和空气传播。因此，自然界各种因素都有可能造成EVD的爆发。EVD的病原体为EBOV，在分类上属于丝状病毒科(Filoviridae)、埃博拉病毒属(Ebolavirus)成员，为单股负链非节段RNA病毒。目前埃博拉病毒有5种不同的亚型：埃博拉扎伊尔型(Zaireebolavirus)，埃博拉苏丹型(Sudanebolavirus)，埃博拉本迪布焦型(Bundibugyoebolavirus)，埃博拉塔伊森林型(Forestebolavirus)，埃博拉莱斯顿型(Restonebolavirus)。目前埃博拉病毒的常用检测方法有：
(1)电镜检测。取病人或猴的病料接种于Vero-98等细胞，37℃培养6-7天后镜检。或者，取病人或猴的病变脏器用电子显微镜直接观察病毒的形态结构。电镜检测方法需要固定、脱干、垫入、分割和染色等步骤，耗时相对较长，而且埃博拉病毒与马尔堡病毒同为丝状病毒科，具有相似的形态，容易产生误诊，同时对操作人员要求也较高。
(2)血清学检测。血清学试验多采用免疫荧光技术，另外还建立了固相间接免疫酶试验、放射免疫试验、酶联免疫吸附试验和蚀斑减少中和试验等方法。血清学检测方法的基础是抗原抗体的特异反应。如检测抗原，除了要求抗体为单抗或多抗，是特异的外，还要求待测抗原上必须存在有能与所用抗体结合的抗原决定簇，如果因为基因突变导致某些位点的不表达，或者结合位点因为某些原因被封闭或阻断，都会影响抗体与抗原的结合，造成假阴性结果；如检测抗体，则要求所用包被抗原应尽可能包含所有的特异抗原决定簇，同时又尽可能不含有非特异的成分，这一点往往由于技术水平的限制而难以完全做到。另外，不同埃博拉病毒亚型以及埃博拉病毒和丝状病毒科其他病毒之间存在交叉反应。因此，从某种意义上来说，血清学实验的假阳性和假阴性是不能完全避免的，从而影响了实验的准确性。
(3)分子生物学检测。此类检测方法以PCR检测为主，尤其是反转录PCR(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术的发展，为快速、准确地检测埃博拉病毒以及其他传染病提供了更可靠的诊断方法。RT-PCR方法可以在病毒感染的各个时期(尤其是抗体产生初期)的各种临床样品中检测到病毒核酸，这就为传染病尤其是像埃博拉病毒病这种烈性传染病的预防、诊断和控制奠定了基础。但目前为止，仍然没有一种RT-PCR方法可以同时检测和分型所有5种埃博拉病毒亚型。
发明内容
本发明的目的是提供一种高度灵敏、特异、快速检测和分型埃博拉病毒5种亚型的引物、探针及试剂盒,同时确保此系统不扩增其它非埃博拉病毒的微生物，尤其是与其相近的其他病原体，如马尔堡病毒(Marburgvirus)等。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的原理和最核心的思路是发明一种高度灵敏、特异、快速检测和分型埃博拉病毒5种亚型的方法体系,同时确保此系统不扩增其它非埃博拉病毒的微生物，尤其是与其相近的其他病原体，如马尔堡病毒(Marburgvirus)等。本发明选择埃博拉病毒保守的区域设计引物(1条上游引物和5条针对五种埃博拉病毒的下游引物)和探针(1条6-FAM探针和1条LCRed640探针)。总体的思路是：巧妙地设计RT-PCR的引物和探针，可以特异地扩增埃博拉5种亚型(扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、塔伊森林型和本迪布焦型)的核酸，并可依据其高分辨率熔解曲线或琼脂糖凝胶电泳中目的条带大小的不同区分5种亚型的埃博拉病毒。因此，此系统不仅能快速、特异的检测到所有亚型埃博拉病毒，而且能根据RT-PCR熔解曲线Tm值的差异区分埃博拉病毒的5种亚型(扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、塔伊森林型和本迪布焦型)；同时，对于仅有普通PCR仪的诊断实验室也可以根据PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中目的条带大小的不同区分5种亚型：埃博拉病毒扎伊尔型(255bp)、苏丹型(211bp)、本迪布焦型(192bp)、塔伊森林型(166bp)、莱斯顿型(146bp)。
从GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)获取如下埃博拉病毒5个亚型的全基因序列后，用ClustalMultipleAlignmentAlgorithm的方法对所有序列进行比对：BundibugyoebolavirusKC545396，BundibugyoebolavirusNC_014373，RestonebolavirusJX477166，RestonebolavirusNC_004161，SudanebolavirusKC545390，SudanebolavirusNC_006432，TaiForestebolavirusFJ217162，TaiForestebolavirusNC_014372，ZaireebolavirusKC242801，ZaireebolavirusNC_002549。据此，设计的引物和探针的核苷酸序列如下(图1-图8)：
上游引物：5’-CGGACACACAAAAAGAAAGAAG-3’
6-FAM探针:5’-6FAM-TAGTTAYTCGCACACAAWARRK-磷酸-3’
LCRed640探针:5’-GAGGAAAATTDTTAATCTTCCTC-LCRed640-3’
Z-下游引物(EBOV扎伊尔型)：5’-GAACTTGTGATGTGATAAGACCTA-3’
S-下游引物(EBOV苏丹型)：5’-AAAGGCAAAGCAATACGACC-3’
R-下游引物(EBOV莱斯顿型)：5’-CATGTTGATGGTAATTGGTAATAG-3’
T-下游引物(EBOV塔伊森林型)：5’-GGAATGGGGTACTTCTGAACA-3’
B-下游引物(EBOV本迪布焦型)：5’-GCCAATTCTCAGTGTTGGTATT-3’。
本发明还提供了一种一步法反转录PCR检测和分型埃博拉病毒5种亚型的试剂盒，其技术方案如下：
一种一步法反转录PCR检测和分型埃博拉病毒5种亚型的试剂盒，包括样品DNA模板或者定量标准试剂、PCR缓冲液、FRET-上游引物、FRET-下游引物、的6-FAM探针、LCRed640探针、商业化Taq酶、dNTP、商业化反转录酶、商业化RNA酶抑制剂。
本发明还提供了一种一步法反转录PCR检测和分型埃博拉病毒5种亚型的方法，其技术方案如下：
用上述的引物和探针，特异地扩增埃博拉5种亚型的核酸，埃博拉5种亚型分别为扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、塔伊森林型和本迪布焦型，并可依据其高分辨率熔解曲线或琼脂糖凝胶电泳中目的条带大小的不同区分5种亚型的埃博拉病毒。
本发明埃博拉RT-PCR特异性的确定。
本发明的特异性从三个方面得到保证：
(1)设计的引物和探针经过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的BLAST搜索，确认本发明设计的引物能特异地扩增5种埃博拉病毒亚型(扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、塔伊森林型和本迪布焦型)，而不扩增其它非埃博拉病毒尤其是与其相近种属病原体的核酸。通过BLAST确认，RT-PCR探针和引物能特异地扩增和检测所有埃博拉病毒的核酸，但不扩增丝状病毒科的其他病毒核酸；
(2)本发明检测载有埃博拉5种亚型(扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、塔伊森林型和本迪布焦型)DNA序列的五种质粒标准品。结果表明，本发明系统可以特异、高效、稳定地扩增所有亚型的埃博拉病毒DNA(图9-图13)；
(3)观察以上扩增对象在PCR过程中荧光强度(640nm)的变化，以及PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的条带的大小。荧光在640nm波长处出现或增强，显示阳性；在琼脂糖凝胶电泳中，EBOV扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、塔伊森林型和本迪布焦型分别显示255、211、192、166和146碱基对(bp)的条带大小(图9-图13,图16)；
本发明埃博拉RT-PCR灵敏度的确定。
由金斯瑞(金斯瑞生物科技，中国南京)合成埃博拉病毒5个亚型(扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、塔伊森林型和本迪布焦型)目的片段的DNA序列。依据合成物的分子量和绝对重量，计算合成物所含的基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备每10μl合成物的稀释试剂含10,000拷贝、1,000拷贝、100拷贝、10拷贝、1拷贝的基因。用本发明系统扩增含不同基因浓度的稀释液，来确定本发明检测此基因的灵敏度。结果显示，此发明可以在反应系统中扩增单拷贝的目的基因(图9-图13)。
本发明中反转录PCR体系效率的确定。
从鸡胚尿囊液中提取禽流感病毒(H1N1)RNA后，对其进行梯度稀释后，选取10-3-10-8进行反转录PCR扩增。结果表明，本发明的反转录PCR体系可以检测到反应体系中10-7拷贝的禽流感病毒RNA分子(图15)。
本发明的有益效果是：
本发明选择埃博拉病毒保守的区域设计引物(1条上游引物和5条针对五种埃博拉病毒的下游引物)和探针(1条6-FAM探针和1条LCRed640探针)。总体的思路是：巧妙地设计RT-PCR的引物和探针，可以特异地扩增埃博拉5种亚型(扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、塔伊森林型和本迪布焦型)的核酸，并可依据其高分辨率熔解曲线或琼脂糖凝胶电泳中目的条带大小的不同区分5种亚型的埃博拉病毒。因此，此系统不仅能快速、特异的检测到所有亚型埃博拉病毒，而且能根据RT-PCR熔解曲线Tm值的差异区分埃博拉病毒的5种亚型(扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、塔伊森林型和本迪布焦型)；同时，对于仅有普通PCR仪的诊断实验室也可以根据PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中目的条带大小的不同区分5种亚型：埃博拉病毒扎伊尔型(255bp)、苏丹型(211bp)、本迪布焦型(192bp)、塔伊森林型(166bp)、莱斯顿型(146bp)。
1)本发明可以特异性地检测所5种埃博拉病毒亚型。埃博拉病毒在分类上属于丝状病毒科、埃博拉病毒属成员，为单股负链非节段RNA病毒。目前埃博拉病毒分成5种不同的亚型：EBOV扎伊尔型，EBOV苏丹型，EBOV本迪布焦型，EBOV塔伊森林型，EBOV莱斯顿型。大部分亚型的埃博拉病毒都有一定的致病性，因此，能够同时检测到埃博拉病毒所有型很重要。同时，检测到所有的种可以更方便的发现新的埃博拉的种或株，并及时的更新埃博拉病毒的分类，从而更好地认识该病原体。另外，本发明体系不会扩增其他引起与埃博拉病毒病有相似临床症状其他传染病的病原体，如登革热、基孔肯雅热等，从而可以更好地采取治疗和控制措施。
2)本发明极具高灵敏度。在病毒感染的早期或恢复期，机体内病毒的含量相对较低，这就需要灵敏度、准确度更高的检测方法，从而能够及时、快速地诊断、监控和控制传染病(尤其像埃博拉病毒病这种急性烈性传染病)。本发明反转录PCR体系可以检测到单拷贝的质粒核酸(载有埃博拉病毒5种亚型的DNA核酸)，同时可以有效地扩增最低10-7流感病毒H1N1的RNA核酸(从鸡胚尿囊液中制备的RNA核酸标准品)。
3)本发明可以对5种亚型的埃博拉病毒进行分型。不同型别病毒的毒力差异很大，其中埃博拉扎伊尔型毒力最强，人感染后死亡率可达80％以上；埃博拉苏丹型次之，人的感染死亡率在50％左右；埃博拉本迪布焦型的致死率超过30％；埃博拉塔伊森林型对非人灵长类动物有致死性，对人感染性很弱；埃博拉莱斯顿型目前还没有感染人的报道。因此，确定埃博拉病毒亚型从而采取相应的治疗和控制措施，将对流行地区埃博拉病毒病的预防和爆发地区本病的快速诊断和及时控制具有重大意义。
4)本发明操作便捷、适合于检测大量样本。由于埃博拉病毒病是一种传染性和死亡率极高的急性烈性出血性传染病。人感染埃博拉病毒后，发病急，病程短，死亡率高。本发明可以快速、准确地检测到5种亚型埃博拉病毒，并能根据RT-PCR熔解曲线Tm值的不同快速地区分埃博拉病毒的5种亚型(扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、塔伊森林型和本迪布焦型)；同时也可以根据PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中目的条带大小的不同区分5种亚型：埃博拉病毒扎伊尔型(255bp)、苏丹型(211bp)、本迪布焦型(192bp)、塔伊森林型(166bp)、莱斯顿型(146bp)。因此，在埃博拉病毒病暴发时，能够快速、准确对大量临床样品进行检测并确诊感染的埃博拉病毒亚型。
附图说明
图1是本发明的反转录PCR的上游引物；反转录PCR上游引物序列：5’-CGGACACACAAAAAGAAAGAAG-3’(22bp)。此引物序列与EBOV塔伊森林型和扎伊尔型完全吻合，而与EBOV本迪布焦型、莱斯顿型和苏丹型都有1个错配碱基。
图2是本发明的反转录PCR的6-FAM探针；反转录PCR的6-FAM探针序列：5’-6-FAM-TAGTTAYTCGCACACAAWARRK-phosphate-3’(22bp)，此序列为图中获得序列的对称链核苷酸序列。此探针序列中有4种兼并碱基Y、W、R和K，其中兼并碱基Y可以同时扩增T和C碱基，兼并碱基W可以同时扩增A和T碱基，兼并碱基R可以同时扩增A和G碱基，兼并碱基K可以同时扩增G和T碱基。因此，此探针序列和5种埃博拉病毒亚型完全吻合。
图3是本发明的反转录PCR的LCRed640探针；反转录PCR的LCRed640探针序列：5’-GAGGAAAATTDTTAATCTTCCTC-LCRed640-3’(23bp)，此序列为图中获得序列的对称链核苷酸序列。此LCRed640探针序列种有1个兼并碱基D，兼并碱基D可以同时扩增G、A和T碱基。因此，此LCRed640探针序列与EBOV扎伊尔型和塔伊森林型完全吻合，而与EBOV苏丹型、本迪布焦型和莱斯顿型各有1个错配碱基。
图4是本发明的定量反转录PCR的EBOV扎伊尔型下游引物；反转录PCR的EBOV扎伊尔型下游引物序列：5’-GAACTTGTGATGTGATAAGACCTA-3’(24bp)，此序列为图中获得序列对称链的核苷酸序列。此下游引物序列只与EBOV扎伊尔型完全吻合，与EBOV苏丹型有14个错配碱基；与本迪布焦型有16个错配碱基；与塔伊森林型有16个错配碱基；与莱斯顿型有15个错配碱基。
图5是本发明的定量反转录PCR的EBOV苏丹型下游引物；反转录PCR的EBOV苏丹型下游引物序列：5’-AAAGGCAAAGCAATACGACC-3’(20bp)，此序列为图中获得序列对称链的核苷酸序列。此下游引物序列只与EBOV苏丹型完全吻合，与其他埃博拉病毒亚型有10-16个错配/缺失碱基。
图6是本发明的定量反转录PCR的EBOV莱斯顿型下游引物；反转录PCR的EBOV莱斯顿型下游引物序列：5’-CATGTTGATGGTAATTGGTAATAG-3’(24bp)，此序列为图中获得序列对称链的核苷酸序列。此下游引物序列只与EBOV莱斯顿型完全吻合，与其他埃博拉病毒亚型有13-15个错配碱基。
图7是本发明的定量反转录PCR的EBOV塔伊森林型下游引物；反转录PCR的EBOV塔伊森林型下游引物序列：5’-GGAATGGGGTACTTCTGAACA-3’(21bp)，此序列为图中获得序列对称链的核苷酸序列。此下游引物序列只与EBOV塔伊森林型完全吻合，与其他埃博拉病毒亚型有10-11个错配碱基。
图8是本发明的定量反转录PCR的EBOV本迪布焦型下游引物；反转录PCR的EBOV本迪布焦型下游引物序列：5’-GCCAATTCTCAGTGTTGGTATT-3’(22bp)，此序列为图中获得序列对称链的核苷酸序列。此下游引物序列只与EBOV本迪布焦型完全吻合，与其他埃博拉病毒亚型有11-22个错配/缺失碱基。
图9是埃博拉病毒扎伊尔型的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)；扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的埃博拉病毒扎伊尔型DNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于埃博拉病毒扎伊尔型具有稳定的Tm值。
图10是埃博拉病毒苏丹型的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)；扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的埃博拉病毒苏丹型DNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于埃博拉病毒苏丹型具有稳定的Tm值。
图11是埃博拉病毒莱斯顿型的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)；扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的埃博拉病毒莱斯顿型DNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于埃博拉病毒莱斯顿型具有稳定的Tm值。
图12是埃博拉病毒塔伊森林型的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)；扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的埃博拉病毒塔伊森林型DNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于埃博拉病毒塔伊森林型具有稳定的Tm值。
图13是埃博拉病毒本迪布焦型的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)；扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的埃博拉病毒本迪布焦型DNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于埃博拉病毒本迪布焦型具有稳定的Tm值。
图14是埃博拉病毒5种亚型的熔解曲线；熔解曲线表明本发明系统对于埃博拉病毒扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型、塔伊森林型和莱斯顿型具有稳定的Tm值，同时依据Tm值的不同区分为5种埃博拉病毒亚型(扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、塔伊森林型和本迪布焦型)。
图15是本发明中反转录PCR体系的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)；将从鸡胚尿囊液中提取的流感病毒RNA(H1N1)进行梯度稀释，本发明中的反转录PCR可以检测到10-7拷贝，且具有可重复性(A)；所有稀释梯度表现出稳定的熔解曲线(B)。
图16是本发明定量FRET-PCR产物在琼脂糖凝胶电泳的条带；图中共8条泳道，其中泳道-1为标准品，泳道-2至泳道-6分别为埃博拉病毒扎伊尔型(EBOV-Z)、苏丹型(EBOV-S)、莱斯顿型(EBOV-R)、塔伊森林型(EBOV-T)和本迪布焦型(EBOV-B)，泳道-7为阴性对照(NC)；泳道-8为本发明扩增5种EBOV亚型质粒混合物的扩增产物。本试验所使用的标准品为20bpDNALadder，其条带大小依次为20bp，40bp，60bp，80bp，100bp，120bp，140bp，160bp,180bp,200bp,300bp。本发明PCR产物中,埃博拉病毒扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、塔伊森林型和本迪布焦型的条带大小分别为255bp,211bp,192bp,166bp和146bp。
具体实施方式
下面结合具体实施方式及附图对本发明做进一步说明。
1.埃博拉病毒FRET-PCR检测方法所用引物和探针的核苷酸序列如下：
上游引物：5’-CGGACACACAAAAAGAAAGAAG-3’
6-FAM探针:5’-6FAM-TAGTTAYTCGCACACAAWARRK-磷酸-3’
LCRed640探针:5’-GAGGAAAATTDTTAATCTTCCTC-LCRed640-3’
Z-下游引物(EBOV扎伊尔型)：5’-GAACTTGTGATGTGATAAGACCTA-3’
S-下游引物(EBOV苏丹型)：5’-AAAGGCAAAGCAATACGACC-3’
R-下游引物(EBOV莱斯顿型)：5’-CATGTTGATGGTAATTGGTAATAG-3’
T-下游引物(EBOV塔伊森林型)：5’-GGAATGGGGTACTTCTGAACA-3’
B-下游引物(EBOV本迪布焦型)：5’-GCCAATTCTCAGTGTTGGTATT-3’。
2.制备PCR用的标准定量试剂。
1)FRET-PCR标准品的制备
由金斯瑞(金斯瑞生物科技，中国南京)合成载有埃博拉病毒5种亚型(扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、塔伊森林型和本迪布焦型)目的DNA序列的质粒。依据合成物的分子量和绝对重量，计算合成物所含的基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备每10μl合成物的稀释试剂含10,000拷贝、1,000拷贝、100拷贝、10拷贝、1拷贝的目的基因作为标准品。本发明试剂盒中提供浓度为104/μl的质粒标准品。
2)反转录PCR标准品的制备
用禽流感病毒(H1N1)感染鸡胚后收取其尿囊液，用商业RNA提取试剂盒(HighPureRNAIsolationKit，罗氏，德国)进行RNA核酸提取后，用TE缓冲液(PH8.0)进行10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8梯度稀释后作为检测反转录PCR系统敏感度的标准品。
3.PCR扩增体系。
1)实时荧光定量FRET-PCR
20μl的扩增体系包含：10μl的样品DNA模板或者定量标准试剂、1xPCR缓冲液、1μMFRET-上游引物、1μMFRET-下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μMdNTP。
2)反转录PCR
20μl的扩增体系包含：10μl的样品DNA模板或者定量标准试剂、1xPCR缓冲液、1μMFRET-上游引物、1μMFRET-下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μMdNTP、0.14个单位的商业化反转录酶、20个单位的商业化RNA酶抑制剂。
4.PCR扩增循环参数。
1)FRET-PCR
PCR扩增包括：预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧光获得循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环。预变性：1x2min95℃；18个温度递减的高严谨循环：6x1sec95℃,12sec70℃，8sec72℃；9x1sec95℃，12sec68℃，8sec72℃；3x1sec95℃，12sec66℃,8sec72℃；40个欠严谨的荧光获得循环：40x1sec95℃,8sec52℃(在此收集荧光),30sec67℃,and30sec72℃；1个熔解循环：1x1sec95℃,10sec38℃，85℃持续收集荧光；降温循环：1x1sec38℃。
2)反转录PCR
PCR扩增包括：反转录、预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧光获得循环和1个降温循环。反转录：1x30min55℃；预变性：1x2min95℃；18个温度递减的高严谨循环：6x1sec95℃,12sec70℃，8sec72℃；9x1sec95℃，12sec68℃，8sec72℃；3x1sec95℃，12sec66℃,8sec72℃；40个欠严谨的荧光获得循环：40x1sec95℃,8sec52℃(在此收集荧光),30sec67℃,and30sec72℃；降温循环：1x1sec38℃。
5.琼脂糖凝胶电泳。
配制4％琼脂糖凝胶，取4μlPCR扩增产物，并用SafeDNAGelStain染色。在紫外灯下观察，可以看到埃博拉病毒5种亚型分别在255bp,211bp,192bp,166bp和146bp处的目的条带，而且可以区分同时扩增5种埃博拉病毒亚型的PCR产物(图16)。实验中所使用的标准品为20bpDNALadder(ThermoScientific20bpDNALadder,ready-to-use,byThermo美国)，且其条带大小依次为20bp，40bp，60bp，80bp，100bp，120bp，140bp，160bp，180bp，200bp，300bp。
6.PCR结果的判定。
FRET-PCR扩增对象包括质粒标准品DNA模板、PCR阴性对照(双蒸水)；反转录PCR扩增对象包括标准品RNA模板、RNA提取的阴性对照和PCR阴性对照(双蒸水)。此发明有着高度的特异性，不仅能检测到5种埃博拉病毒亚型(扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、塔伊森林型和本迪布焦型)的核酸(图9-图13)，而且能够根据PCR熔解曲线和PCR产物电泳图片将其分型(图14，图16)。阳性样品和阳性对照在FRET-PCR的荧光扩增曲线在640nm有荧光的出现或增强，且熔解曲线中有熔解峰出现。根据RT-PCR熔解曲线Tm值的不同区分埃博拉病毒的5种亚型(扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、塔伊森林型和本迪布焦型)(图14)；同时也可以根据PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中目的条带大小的不同区分5种亚型：埃博拉病毒扎伊尔型(255bp)、苏丹型(211bp)、本迪布焦型(192bp)、塔伊森林型(166bp)、莱斯顿型(146bp)(图16)。
实施例：转录方法验证本发明反转录PCR体系
由金斯瑞(金斯瑞生物科技，中国南京)合成含有埃博拉病毒扎依尔型目的片段DNA和T7启动子的质粒PUC57，用合适的限制性内切酶(SacI,宝生物，大连)对质粒进行酶切；通过PCR扩增提高目的DNA浓度；用商业化转录试剂盒(Kit，bylife美国)对PCR扩增产物进行转录并获得RNA产物；转录完成后，将转录产物直接用于反转录PCR进行扩增。
1)质粒的稀释
将含有合成质粒的微型离心管4000转离心2分钟，然后加入40μl双蒸水或TE缓冲液(PH8.0)配成质粒浓度为100ng/μl的溶液；
2)质粒的酶切
用商业化限制性内切酶SacI(SacI,宝生物，大连)对质粒进行酶切，其反应体系为20μl，且各试剂成分组成如下表；将各反应液混合后放入37℃环境中孵育1个小时；然后将反应体系混合液放入56℃环境中加热20分钟使限制性内切酶失活，从而终止反应；
3)PCR扩增酶切产物
用以下引物从线性质粒上扩增一段含有T7转录启动子和目的DNA片段、长度为733个碱基对(bp)的片段，从而为后续转录提供足够的目的DNA的浓度(大于等于1μg/μl)；
P-上游引物：5’-GGTACCTCGCGAATGCATC-3’
P-下游引物：5’-CAGGAAACAGCTATGACCA-3’
4)体外转录
4.1)在室温条件下溶解试剂盒中所有相关试剂(将RNAPolymeraseEnzymeMix置于-20℃冰箱中待使用时取出)；
4.2)在室温下混合下表中的各试剂并通过移液器上下吹打混匀；
4.3)在37℃环境中孵育4小时；
4.4)加入1μlTURBODNase，混匀后在37℃环境中孵育15分钟，从而去除反应体系中的核酸DNA；
5)用本发明建立的可以检测埃博拉病毒5种亚型的RT-PCR体系扩增通过上述方法获得的转录产物(核酸RNA)。
结果表明，转录产物荧光扩增曲线在640nm处有荧光的出现和增强，且熔解曲线处有单一、稳定的熔解峰和Tm值。因此，本发明所建立的反转录PCR体系可以有效的扩增RNA，即可以快速、有效地扩增临床样品中埃博拉病毒RNA核酸。

Claims (2)

1.一种一步法反转录PCR检测和分型埃博拉病毒5种亚型的引物和探针，其特征在于：其核苷酸序列如下：
上游引物：5’-CGGACACACAAAAAGAAAGAAG-3’
6-FAM探针：5’-6FAM-TAGTTAYTCGCACACAAWARRK-磷酸-3’
LCRed640探针：5’-GAGGAAAATTDTTAATCTTCCTC-LCRed640-3’
Z-下游引物：5’-GAACTTGTGATGTGATAAGACCTA-3’
S-下游引物：5’-AAAGGCAAAGCAATACGACC-3’
R-下游引物：5’-CATGTTGATGGTAATTGGTAATAG-3’
T-下游引物：5’-GGAATGGGGTACTTCTGAACA-3’
B-下游引物：5’-GCCAATTCTCAGTGTTGGTATT-3’。
2.一种一步法反转录PCR检测和分型埃博拉病毒5种亚型的试剂盒，其特征在于：包括样品DNA模板或者定量标准试剂、PCR缓冲液、如权利要求1所述的引物和探针、商业化Taq酶、dNTP、商业化反转录酶和商业化RNA酶抑制剂。
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