CN113234866A - 一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测试剂盒，包括分别针对人免疫缺陷病毒1型、人免疫缺陷病毒2型、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒及丁型肝炎病毒的八组特异性引物和野生型封闭探针，基因序列如SEQ ID NO.1～NO.24所示；病原体样本提取后，配置PCR扩增体系，进行荧光定量PCR反应，结果经软件分析确定病原体类别，克服了现有技术的不足，通过应用荧光定量PCR技术可以快速、准确且更加灵敏地对多项血液循环系统病原体进行检测，检测敏感性高、特异性好，具有高通量、低成本等特点。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
艾滋病是一种危害性极大的传染病，由感染艾滋病病毒(HIV病毒)引起。HIV是一种能攻击人体免疫系统的病毒。它把人体免疫系统中最重要的CD4+T淋巴细胞作为主要攻击目标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能。因此，人体易于感染各种疾病，并可发生恶性肿瘤，病死率较高。HIV在人体内的潜伏期平均为8～9年，患艾滋病以前，可以没有任何症状地生活和工作多年。
乙型肝炎病毒简称乙肝病毒，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)。根据目前所知，HBV就只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病。完整的乙肝病毒成颗粒状，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。
丙型肝炎病毒是引起丙型肝炎的病原体，属于RNA的病毒。它主要通过输血、输入含丙型肝炎病毒血制品、静脉吸毒传播，导致患者感染丙型肝炎病毒。丙型肝炎慢性化几率达到80％以上。HCV病毒体呈球形，直径小于80nm(在肝细胞中为36～40nm，在血液中为36-62nm)，为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。
丁型肝炎病毒(hepatitis D virus,HDV)是一种缺陷病毒，必须在HBV或其他嗜肝DNA病毒的辅助下才能复制增殖。HDV体形细小，直径35～37nm，核心含单股负链共价闭合的环状RNA。世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，丁型肝炎病毒在3类致癌物(对人体致癌性尚未归类的物质或混合物清单中。HDV感染呈世界性分布，但主要分布于南意大利和中东等地区。其传播方式主要通过输血或使用血制品，也可通过密切接触与母婴间垂直感染等方式传播。高危人群包括药瘾者及多次受血者。
病毒呈球形，直径约为27nm。无囊膜。衣壳由60个壳微粒组成，呈20面体立体对称，有HAV的特异性抗原(HAVAg)，每一壳微粒由4种不同的多肽即VP1、VP2、VP3和VP4所组成。在病毒的核心部位，为单股正链RNA。除决定病毒的遗传特性外，兼具信使RNA的功能，并有传染性。HAV的单股RNA，其长度相当于7400个核苷酸。在RNA的3′末端有多聚的腺苷序列，在5′末端以共价形式连接一由病毒基因编码的细小蛋白质，称病毒基因组蛋白(Viralprotein,genomic,VPG)。它在病毒复制过程中，能使病毒核酸附着于宿主细胞的核蛋白体上进行病毒蛋白质的生物合成。
戊型肝炎病毒(HEV)为无包膜的球状颗粒。HEV分为1～8共8个基因型，中国内地流行株主要为1型(曾称缅甸株)，其次为4型。尚不能对HEV进行细胞培养，可实验室感染猕猴等多种猴类。HEV对外界环境抵抗力不强。戊型肝炎在15～39岁的青年和成人高发。戊型肝炎亦为自限性疾病。HEV对肝细胞亦无直接病变作用(CPE)。机体于病后可获得一定的免疫力，但不够稳固。成人病死率高于甲型肝炎，尤其孕妇患戊型肝炎病情严重，在妊娠的后3个月发生感染病死率达20％。
梅毒螺旋体是梅毒的病原体，因其透明，不易着色，故又称苍白螺旋体。梅毒是一种广泛流行的性病。梅毒螺旋体只感染人类，分获得性梅毒与胎传梅毒。获得性梅毒主要通过性接触传染；胎传梅毒由梅毒螺旋体通过胎盘，从脐带血循环传给胎儿，可引起胎儿全身感染。螺旋体在胎儿内脏及组织中大量繁殖，可引起胎儿死亡或流产。梅毒螺旋体细长形似细密的弹簧，螺旋弯曲规则，平均8-14个，两端尖直。电镜下显示梅毒螺旋体结构复杂，从外向内分为：外膜(主要由蛋白质、糖及类脂组成)、轴丝(主要由蛋白质组成)、圆柱形菌体(包括细胞壁、细胞膜及胞浆内容物)，一般染料不易着色。梅毒螺旋体有生活发育周期，分为颗粒期、球形体期及螺旋体期，平均约30小时增殖一代，发育周期与所致疾病周期、隐伏发作及慢性病程有关。
血液循环系统传染病可由病毒、细菌、支原体、衣原体等多种病原体引起，可以通过输血或者伤口感染传播。其中病毒性血液循环系统传染病占70-80％。血液循环系统疾病由于其症状相似且种类繁多，临床上注册的产品大多是针对单一的病原体检测。本发明所涉及的病原，占目前病毒性血液循环系统传染病的90％左右。
目前，虽然有许多检测血液循环系统病原体的方法，但检测的病原体较单一，且耗时长。
多重PCR(multiplex Polymerase chainreaction，mPCR)，是由普通PCR延伸而来的一项PCR技术，在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个目的核酸片段的PCR反应。因其可在单一PCR体系中，同时扩增多个目的片段，多重PCR不仅保留了普通PCR特异性强、灵敏度高的优点，而且具有节约时间、节省人力物力等优点，在临床检测上具有很高的应用价值。
多重不对称扩增的基本原理是在同一通道中加入不对称的上下游引物，从而导致产生大量的单链模板。单链模板与过量的探针结合形成局部双链，逐渐升温至达到相应探针半数解链温度(melting temperature,Tm)值时，局部双链会打开导致荧光信号被淬灭，在荧光定量PCR仪进行熔解曲线分析时就会在该Tm值时形成特异的熔解峰。因而根据在同一荧光通道内设置不同Tm值的探针会形成不同温度的特异性熔解峰。本次研发的不对称扩增体系就是基于此原理进行多重扩增的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测试剂盒，克服了现有技术的不足，通过应用荧光定量PCR技术可以快速、准确且更加灵敏地对多项血液循环系统病原体进行检测，检测敏感性高、特异性好，具有高通量、低成本等特点。
为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：
一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测试剂盒，包括分别针对人免疫缺陷病毒1型、人免疫缺陷病毒2型、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒及丁型肝炎病毒的八组特异性引物和野生型封闭探针；
针对人免疫缺陷病毒1型，特异性引物对包括引物1和引物2，引物1的序列如SEQID No.1，引物2的序列如SEQ ID No.2；野生型封闭探针1的序列如SEQ ID No.3；
针对人免疫缺陷病毒2型，特异性引物对包括引物3和引物4，引物3的序列如SEQID No.4，引物4的序列如SEQ ID No.5；野生型封闭探针2的序列如SEQ ID No.6；
针对乙型肝炎病毒，特异性引物对包括引物5和引物6，引物5的序列如SEQ IDNo.7，引物6的序列如SEQ ID No.8；野生型封闭探针3的序列如SEQ ID No.9；
针对丙型肝炎病毒，特异性引物对包括引物7和引物8，引物7的序列如SEQ IDNo.10，引物8的序列如SEQ ID No.11；野生型封闭探针4的序列如SEQ ID No.12；
针对梅毒螺旋体，特异性引物对包括引物9和引物10，引物9的序列如SEQ IDNo.13，引物10的序列如SEQ ID No.14；野生型封闭探针5的序列如SEQ ID No.15；
针对甲型肝炎病毒，特异性引物对包括引物11和引物12，引物11的序列如SEQ IDNo.16，引物12的序列如SEQ ID No.17；野生型封闭探针6的序列如SEQ ID No.18；
针对以及戊型肝炎病毒，特异性引物对包括引物13和引物14，引物13的序列如SEQID No.19，引物14的序列如SEQ ID No.20；野生型封闭探针7的序列如SEQ ID No.21；
针对丁型肝炎病毒，特异性引物对包括引物15和引物16，引物15的序列如SEQ IDNo.22，引物16的序列如SEQ ID No.23；野生型封闭探针8的序列如SEQ ID No.24。
进一步，所述野生型封闭探针进行标记的荧光基团包括但不限于：FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、CY5中的一种；其淬灭荧光基团的标记包括但不限于：TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL、BHQ3中的一种。
进一步，所述野生型封闭探针的修饰包括硫代修饰、脱氧脲嘧啶、脱氧次黄嘌呤、2-甲氧基修饰中的一种或多种，其中野生型封闭探针中Linker序列为与原序列不匹配的2-6个任意碱基序列。
本发明还保护了一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测方法，利用上述的同步检测多项血液循环系统病原体的检测试剂盒，具体包括以下步骤:
步骤一、核酸样本的提取：采集样本并提取核酸，将提取的核酸转移至冰箱保存备用；
步骤二、荧光定量PCR反应：
(1)配制18μL PCR扩增体系，包括：mix 10μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL、野生型封闭探针0.2μL、二价镁离子盐0.16μL、尿素0.2mg、山梨醇0.4mg、木糖醇0.2mg、和模板2.0μL，余量为水；
(2)将上述配置的PCR扩增体系与步骤一提取得到的核酸匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：50℃10min反转录，95℃5min预变性；然后依次在95℃10S,60℃30S,进行40个循环；熔解曲线程序为：95℃for 1min,40℃for 30s then with a 1％rampto 95℃；
步骤三、PCR结果分析：根据步骤二中获得的扩增曲线对人免疫缺陷病毒1型、人免疫缺陷病毒2型、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒及丁型肝炎病毒的检测结果进行检测和判读，判断样本中是否含有待检测的病原感染。
进一步，步骤二所述PCR扩增体系中还包括热稳定且具备或者不具备5’-3’外切酶活性的核酸聚合酶。
进一步，步骤二所述PCR扩增体系中至少设置有一个双标记寡核苷酸野生型封闭探针的Tm值大于与之匹配的两个引物的Tm值，且对应相同靶序列的双标记寡核苷酸野生型封闭探针的实时扩增荧光信号能被正常检测
本发明与现有技术相比较，具有以下有益效果：
1、本发明通过应用荧光定量PCR技术可以快速、准确且更加灵敏地对多项血液循环系统病原体进行检测，检测敏感性高(检出下限均可以达到1拷贝)、特异性好，具有高通量、低成本等特点。
2、本发明采用荧光定量PCR反应程序一步完成，不需进行产物纯化测序等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
3、本发明采用不对称+熔解曲线分析的方法，突破了传统检测体系一个通道只能检测一个靶标的局限；本发明中的一个荧光通道可以检测至少三个靶标。
4、本发明采用增加Mg2+的方法，突破了传统检测体系无法改变产物溶解温度的局限，本发明中的通过增加0.2mM Mg2+可以提高产物的溶解温度大约2℃，为以后低GC含量模板的研究奠定了坚实的基础。
5、本发明中的通过增加1％尿素+2％山梨醇+1％木糖醇可以提高扩增体系耐温性能，使酶在37℃环境下可以存活一周，为以后产品的长途运输稳定性的研究奠定了坚实的基础。
附图说明
图1为本发明检测体系第一通道-FAM通道熔解曲线图谱：HIV-1(在64℃左右重复出现特异性的熔解峰，结果符合预期)、HIV-2(在69℃左右重复出现特异性的熔解峰，结果符合预期)以及HBV的荧光(在73℃左右重复出现特异性的熔解峰，结果符合预期)。
图2为本发明检测体系第二通道-VIC熔解曲线图谱：HCV(在58℃左右重复出现特异性的熔解峰，结果符合预期)以及TP(在67℃左右重复出现特异性的熔解峰，结果符合预期)。
图3为本发明检测体系第三通道-ROX熔解曲线图谱：HAV(在62℃左右重复出现特异性的熔解峰，结果符合预期)、HEV(在68℃左右重复出现特异性的熔解峰，结果符合预期)以及HDV(在73℃左右重复出现特异性的熔解峰，结果符合预期)。
图4为本发明扩增体系未添加Mg2+时产物的溶解温度曲线图。
图5为本发明扩增体系添加Mg2+时产物的溶解温度曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明所述的一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测试剂盒，包括分别针对人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒螺旋体(TP)、甲型肝炎病毒(HAV)以及戊型肝炎病毒(HEV)及丁型肝炎病毒(HDV)的八组特异性引物和野生型封闭探针；具体的基因序列如表1所示。
表1基因序列表
其中，野生型封闭探针Wt-Blocker的报告荧光基团的标记包含但不限于FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、CY5中的一种；其淬灭荧光基团的标记包含但不限于TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL、BHQ3中的一种。野生型封闭探针Wt-Blocker的修饰包括硫代修饰、脱氧脲嘧啶、脱氧次黄嘌呤、2-甲氧基修饰中的一种到多种，Linker序列为与原序列不匹配的2-6个任意碱基序列。其他部分为荧光定量PCR分析试剂盒的常规试剂。
1.核酸样本的提取
1.1实验前试剂材料准备与检查工作如下：
(1)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer 1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾√；(2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75％乙醇；(3)高压灭菌有效期内的1.5mL Eppendorf管和各类移液枪头。
1.2从4℃冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；
1.3在1.5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；
1.4分别移取900μL Cell Lysis Solution加至灭菌的1.5mL Eppendorf管；
1.5小心移取300μL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的1.5mL EP管；
1.6盖上Eppendorf管盖，室温孵育10min；
1.7 13,000rpm室温离心20秒；
1.8取出Eppendorf管，观察白色沉淀；
1.9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；
1.10盖上Eppendorf管，用手指弹击Eppendorf管底部，使白色沉淀重悬；
1.11移取300μL Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；
1.12打开Eppendorf管，移取100μL Protein Precipitation Solution入上述Eppendorf管中，盖上管盖，振荡器上剧烈振荡20秒；13,000rpm室温离心3min；
1.13移取上清转移到新的已灭菌1.5mL Eppendorf管；
1.14移取300μL异丙醇入Eppendorf管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状核酸析出；
1.15 13,000rpm室温离心1min；
1.16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；
1.17移取300μL 75％乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；
1.18 13,000rpm室温离心1min；
1.19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；
1.20在实验台上放置新滤纸，倒扣Eppendorf管，吸干液体，将Eppendorf管开盖侧放风干；
1.21目测沉淀大小，加入50～100μL Rehydration Solution至沉淀；
1.22过夜溶解后用NanoDrop紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于等于20ng/μL且OD260/OD280为1.9±0.2视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀核酸，然后重新加适量的Rehydration Solution溶解核酸；
1.23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；
1.24保存核酸标本至4℃冰箱；
2.荧光定量PCR反应
2.1在试剂准备区配制20μL PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表2：
表2各组分添加量
| mix | 10μL |
| F | 0.4μL |
| R | 0.4μL |
| WT_Blocker | 0.2μL |
| ddH2O | 补足至18μL |
2.2在标本制备区对盛有核酸模板短暂离心后添加2.0μL至扩增体系中，在PCR管壁上标记标本唯一性标识，管盖上标记检测项目代号。PCR管震荡混匀，桌面离心机上短暂离心；
2.3设置程序后在将PCR管放入适配器，并安装到扩增仪内；
2.4点击“start”开始仪器运行。
3.结果判读：分别看对应的FAM、VIC和ROX通道是否出现特异性的熔解峰。本研究中，FAM通道熔解曲线图谱：HIV-1在64℃左右出现特异性的熔解峰、HIV-2在69℃左右出现特异性的熔解峰、HBV在73℃左右重复出现特异性的熔解峰；第二通道-VIC熔解曲线图谱：HCV在58℃左右出现特异性的熔解峰、TP在67℃左右出现特异性的熔解峰；第三通道-ROX：HAV在62℃左右出现特异性的熔解峰、HEV在68℃左右出现特异性的熔解峰、HDV在73℃左右出现特异性的熔解峰。
4.一代测序结果分析
在“experiment”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“gene scaning”，点击“Calculate”键，对所有检测标本进行基因型分析。
对样本检测人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒螺旋体(TP)、甲型肝炎病毒(HAV)以及戊型肝炎病毒(HEV)及丁型肝炎病毒(HDV)检测结果。
采用本发明的试剂盒及方法，能够简捷、直观、准确的对人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒螺旋体(TP)、甲型肝炎病毒(HAV)以及戊型肝炎病毒(HEV)及丁型肝炎病毒(HDV)进行检测和判读。
临床医生可根据人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒螺旋体(TP)、甲型肝炎病毒(HAV)以及戊型肝炎病毒(HEV)及丁型肝炎病毒(HDV)阴性或者阳性结果结合临床症状和其他检查进行确诊。
实验对比例
将12例受赠自扬州市中心血站的样本通过荧光定量PCR检测与一代测序进行对比实验。
12例样本荧光定量PCR检测1.5小时+结果分析0.5小时，合计2小时。而一代测序检测8小时+结果分析1h，合计9小时。且荧光定量PCR检测为闭管操作，不需进行产物纯化测序等二次处理，因而也不存在扩增产物污染的风险。
12例样本荧光定量PCR与一代测序检测结果的对比，如下表4：
表4荧光定量PCR与一代测序结果对比
检出下限案例
将待检测的扩增子区域整合到同一个假病毒内，由上海复百澳生物科技有限公司完成合成、表达和组装并且进行病毒定量。将病毒依次10倍倍比稀释至10000、1000、10、1拷贝/μL，对上述稀释比的病毒进行荧光定量PCR反应。
结果：所列八项病原检测下限均为1拷贝。
Mg2+对熔解温度影响案例
表2各组分添加量
在反应体系中额外添加0.16μL 25mM的MgCl2，可以提高Tm值2℃左右。具体图谱可参考附图4和附图5。这个发现对于低GC含量的模板有比较明显的帮助。
检测体系耐温性能的提升
通过前期的产品稳定性研究发现，原先的体系存在耐温性能低(即37℃放置8小时，酶活性基本丧失，因而不适宜长途运输)，为了解决上述问题，经过多次的实验，在扩增体系中加入尿素+山梨醇+木糖醇的组合可以提升耐温性能，具体的扩增体系配比见表3；
表3扩增体系组分表
| mix | 10μL |
| F | 0.4μL |
| R | 0.4μL |
| WT_Blocker | 0.2μL |
| MgCl<sub>2</sub>(25mM) | 0/0.16μL |
| 尿素 | 0.2mg |
| 山梨醇 | 0.4mg |
| 木糖醇 | 0.2mg |
| ddH<sub>2</sub>O | 补足至18μL |
结果：加入1％尿素+2％山梨醇+1％木糖醇可以显著改善酶37℃的耐温性能至37℃一周。
实验过程中，采用了不同组分和配比进行对照实验，不同耐温体系组合对体系灵敏度和耐温性能的影响见表4；
表4不同组分对扩增体系耐温性能的影响
通过本研究发现，通过加入耐温保护配方(1％尿素+2％山梨醇+1％木糖醇)可以显著改善酶的耐温性能从而提高酶的运输稳定性和产品的使用性能。将体系替换为赤藓醇+牛血清白蛋白+四甲基氯化铵或者海藻糖+牛血清白蛋白+四甲基氯化铵均无法达到延长一周的效果。
因此，本发明的主要创新点在于：
本发明所选取的靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒螺旋体(TP)、甲型肝炎病毒(HAV)以及戊型肝炎病毒(HEV)及丁型肝炎病毒(HDV)，能够满足临床检验实际工作中相关病原检测的要求。
另外，本发明在原先的基础上通过调整Mg2+的浓度，可逆性地改变了产物溶解峰的温度。还通过添加1％尿素+2％山梨醇+1％木糖醇改变了反应体系的耐温性能，对于体系的稳定和后期的运用更显示出本体系的优越性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (6)
1.一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测试剂盒，其特征在于：包括分别针对人免疫缺陷病毒1型、人免疫缺陷病毒2型、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒及丁型肝炎病毒的八组特异性引物和野生型封闭探针；
针对人免疫缺陷病毒1型，特异性引物对包括引物1和引物2，引物1的序列如SEQ IDNo.1，引物2的序列如SEQ ID No.2；野生型封闭探针1的序列如SEQ ID No.3；
针对人免疫缺陷病毒2型，特异性引物对包括引物3和引物4，引物3的序列如SEQ IDNo.4，引物4的序列如SEQ ID No.5；野生型封闭探针2的序列如SEQ ID No.6；
针对乙型肝炎病毒，特异性引物对包括引物5和引物6，引物5的序列如SEQ ID No.7，引物6的序列如SEQ ID No.8；野生型封闭探针3的序列如SEQ ID No.9；
针对丙型肝炎病毒，特异性引物对包括引物7和引物8，引物7的序列如SEQ ID No.10，引物8的序列如SEQ ID No.11；野生型封闭探针4的序列如SEQ ID No.12；
针对梅毒螺旋体，特异性引物对包括引物9和引物10，引物9的序列如SEQ ID No.13，引物10的序列如SEQ ID No.14；野生型封闭探针5的序列如SEQ ID No.15；
针对甲型肝炎病毒，特异性引物对包括引物11和引物12，引物11的序列如SEQ IDNo.16，引物12的序列如SEQ ID No.17；野生型封闭探针6的序列如SEQ ID No.18；
针对以及戊型肝炎病毒，特异性引物对包括引物13和引物14，引物13的序列如SEQ IDNo.19，引物14的序列如SEQ ID No.20；野生型封闭探针7的序列如SEQ ID No.21；
针对丁型肝炎病毒，特异性引物对包括引物15和引物16，引物15的序列如SEQ IDNo.22，引物16的序列如SEQ ID No.23；野生型封闭探针8的序列如SEQ ID No.24。
2.根据权利要求1所述的一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测试剂盒，其特征在于：所述野生型封闭探针进行标记的荧光基团包括但不限于：FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、CY5中的一种；其淬灭荧光基团的标记包括但不限于：TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL、BHQ3中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测试剂盒，其特征在于：所述野生型封闭探针的修饰包括硫代修饰、脱氧脲嘧啶、脱氧次黄嘌呤、2-甲氧基修饰中的一种或多种，其中野生型封闭探针中Linker序列为与原序列不匹配的2-6个任意碱基序列。
4.一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测方法，利用权利要求1-3中任一项所述的一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测试剂盒，其特征在于：具体包括以下步骤:
步骤一、核酸样本的提取：采集样本并提取核酸，将提取的核酸转移至冰箱保存备用；
步骤二、荧光定量PCR反应：
(1)配制18μL PCR扩增体系，包括：mix 10μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL、野生型封闭探针0.2μL、二价镁离子盐0.16μL、尿素0.2mg、山梨醇0.4mg、木糖醇0.2mg、和模板2.0μL，余量为水；
(2)将上述配置的PCR扩增体系与步骤一提取得到的核酸匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：50℃10min反转录，95℃5min预变性；然后依次在95℃10S,60℃30S,进行40个循环；熔解曲线程序为：95℃for 1min,40℃for 30s then with a 1％ramp to95℃；
步骤三、PCR结果分析：根据步骤二中获得的扩增曲线对人免疫缺陷病毒1型、人免疫缺陷病毒2型、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒及丁型肝炎病毒的检测结果进行检测和判读，判断样本中是否含有待检测的病原感染。
5.根据权利要求4所述的一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测方法，其特征在于：步骤二所述PCR扩增体系中还包括热稳定且具备或者不具备5’-3’外切酶活性的核酸聚合酶。
6.根据权利要求4所述的一种同步检测多项血液循环系统病原体的检测方法，其特征在于：步骤二所述PCR扩增体系中至少设置有一个双标记寡核苷酸野生型封闭探针的Tm值大于与之匹配的两个引物的Tm值，且对应相同靶序列的双标记寡核苷酸野生型封闭探针的实时扩增荧光信号能被正常检测。
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