CN115725799A - 检测消化道病原体的组合物、试剂盒、方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及甲型肝炎、戊型肝炎病毒、幽门螺旋杆菌的检测。本发明涉及一种检测消化道病原体的组合物，包括：如SEQ ID NO:1～3所示的检测幽门螺旋杆菌的上下游引物及探针；如SEQ IDNO:4～6所示的检测甲型肝炎的上下游引物及探针；以及如SEQ ID NO:7～9所示的检测戊型肝炎的上下游引物及探针。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒以及幽门螺旋杆菌的检测和区分。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及甲型肝炎、戊型肝炎病毒、幽门螺旋杆菌的检测。
背景技术
甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)均是能够引起急性肝炎暴发的致病因子，历史上都曾多次造成疾病流行，带来过很严峻的公共卫生问题。从流行病学的角度来看，HAV和HEV的分布均具有明显区域性特征，在发展中国家流行较广，尤其是卫生条件较差的区域，这在很大程度上应该归因于两种病毒具有相似传播途径，都是通过粪口途径传播，事实证明：直接接触感染者的排泄物或排泄物污染过的水、土壤甚至接触感染者存在的环境都有可能造成HAV和HEV感染。为了提供良好的公共环境，对HAV和HEV进行及时检测十分必要。
幽门螺旋杆菌(Hp)是导致慢性胃炎最常见的病因，其通过口–口、粪–口等途径传播，感染了全世界约50％的人口。由于临床大多数患者为无症状带菌状态，未得到应有的重视，从而可能导致胃癌等严重疾病的发生，我国是幽门螺旋杆菌感染和胃癌双重高发国家。1994年，世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)将幽门螺杆菌列为I类致癌物，根除该菌也已被列为预防胃癌的主要策略。Hp具有较强的感染性、传播性，且随着Hp与相关疾病关系研究的深入，认识到Hp是一个应被关注的公共卫生问题，而基础卫生设施、安全饮用水和基本卫生条件差，不良饮食习惯与过于拥挤的居住环境等，均会增加Hp感染。
基于此，甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒以及幽门螺旋杆菌检测已成为公众卫生体检的常规检测项目，然而，目前上述病原体检测在体检项目中内仍需分开进行检测，且三项的检测的方法学未能统一、造成操作复杂，耗时长，因此，亟待开发一种试剂盒，能快速检测出甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒以及幽门螺旋杆菌，为传染性疾病提供预防和治疗方案。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供一种检测消化道病原体的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测幽门螺旋杆菌的上下游引物及探针；
如SEQ ID NO:4～6所示的检测甲型肝炎的上下游引物及探针；以及
如SEQ ID NO:7～9所示的检测戊型肝炎的上下游引物及探针。
本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒以及幽门螺旋杆菌的检测和区分。使得不同病原体能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更有效。同时，本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到400拷贝/mL，检测更为准确。
进一步地，所述组合物包括检测内标的上下游引物及探针。
在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是人管家基因。
在一些具体的实施方案中，用于检测内标的上下游引物及探针为如SEQ IDNO:10所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:11所示的内标下游引物，和如SEQ ID NO:12所示的内标探针。
进一步地，本发明组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用ATTO425、Quasar705、FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
在一些具体的实施方案中，Hp探针的荧光报告基团为FAM；HAV探针的荧光报告基团为HEX(或VIC)；HEV的荧光报告基团为ROX；内标的荧光报告基团为CY5。
进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
本发明的组合物可以任意组合成检测对应4个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。
举例来说，可以包括上述4对引物和探针中的任意3对，可以包括上述4对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述4对引物和探针中的任意1对。
在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光PCR。
进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。
进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。
进一步地，所述组合物中引物的用量为0.2～0.4μM；所述组合物中探针的用量为0.1～0.2μM。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备消化道病原体联检并区分的试剂盒中的用途，其中，所述病原体是甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒以及幽门螺旋杆菌。
第三方面，本发明提供了一种消化道病原体联检并区分的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水、内标基因假病毒中的至少一种。阳性质控品是甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒以及幽门螺旋杆菌的片段质粒、片段RNA或片段DNA、假病毒中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂、逆转录酶以及DNA聚合酶中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、dUTP、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶(UDG)、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/反应～15U/反应，例如逆转录酶可以是Neoscript RT逆转录酶或MMLV酶；所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：反/逆转录酶、Taq酶、Mg2+、Mn2+、Rnasin、dNTP(U)s、引物、探针和PCR缓冲液。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20μl～200μl。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。
第四方面，提供了一种用于消化道病原体联检并区分的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是血清、血液等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的的消化道病原体联检并区分的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染上述病原体并罹患肝炎和胃病等的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中的检测培养物中检测是否有上述病原体。
附图说明
图1为本发明组合物的检测结果图；
图2～4为本发明组合物灵敏度检测结果图(分别为幽门螺旋杆菌、甲型肝炎、戊型肝炎)；
图5为本发明组合物特异性检测结果图；
图6为本发明对比例组合物检测结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
表1
其中，Hp探针的荧光报告基团为FAM；HAV探针的荧光报告基团为HEX(或VIC)；HEV的荧光报告基团为ROX；内标探针的荧光报告基团为CY5。
实施例2、检测消化道病原体的方法
2.1荧光PCR扩增反应液：含有PCR buffer、Mg2+、dNTPs、Rnasin、0.1％DEPC水、引物、探针等。本实施例中反应体系如表2所示：
表2
2.2酶混合液的配制：
酶混合液由Neoscript RT逆转录酶、H-Taq酶组成。将H-Taq酶(15U/μL)和Neoscript RT酶(20U/μL)按照一定比例混合而成(每人份为1μL-Taq酶与1μL NeoscriptRT酶混合)。
2.3本实施例具体的检验步骤及反应条件如下：
试剂准备：
根据待测样本、阳性对照、阴性对照的数量，按比例(PCR反应液38μL/人份+酶混合液2μL/人份)取相应量的PCR反应液和酶混合液，充分混匀成PCR混合液，2000rpm离心10s后备用。
样本处理与加样
取200μL待测样本、阴性对照、阳性对照到1.5mL离心管中，使用圣湘生物科技股份有限公司的核酸提取或纯化试剂按其说明书操作进行核酸提取。
吸取上述处理好的样本、阴性对照及阳性对照各10μL分别加入对应的0.2mL PCR反应管中，每管加入40μL PCR混合液，盖上管盖。
PCR扩增
在SLAN-96P全自动医用PCR分析系统上，按照一定的温度、时间设置程序进行PCR扩增。本发明的优选方案为表3所示。
表3
检验结果的解释
如果该样本FAM，HEX(VIC)，ROX，通道有明显S型扩增曲线，且Ct值≤40，则判为阳性；如果该样本FAM、HEX(VIC)、ROX，通道无扩增曲线(No Ct)或Ct值＞40，且内标为阳性(Ct值≤40)，则判为阴性。具体如下表4所示。
表4
实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果
将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对幽门螺旋杆菌、甲型肝炎、戊型肝炎的病原体样本进行验证，结果表明能够对幽门螺旋杆菌、甲型肝炎、戊型肝炎进行检测和区分，检测结果如图1所示。
实施例4、本发明组合物的灵敏度
将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对灵敏度进行分析，分析结果见表5。
表5
试验结果表明，本试剂盒对甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、幽门螺旋杆菌的100％检测限为400.0copies/mL(如图2～4所示)。
实施例5、本发明组合物的特异性
采用实施例2的方法对呼吸道合胞病毒、登革病毒、肺炎衣原体、西尼罗病毒、乙型肝炎病毒、副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、大肠杆菌进行实验，实验结果如图5所示，结果表明，本发明方法对上述病原体无交叉反应。具体见下表6：
表6
实施例6、本发明组合物的抗干扰性和稳定性
对实施例2的试剂盒采用常规方法分析干扰物，实验结果表明，一定浓度的地塞米松(50μg/mL)、盐酸头孢甲肟(50μg/mL)、扎那米韦(100μg/mL)、利巴韦林(100μg/mL)、阿奇霉素(100μg/mL)、盐酸组胺(200μg/mL)、倍氯美松(50μg/mL)、莫匹罗星(50μg/mL)、妥布霉素(50μg/mL)、莫米松(50μg/mL)、氟替卡松(50μg/mL)、布地奈德(50μg/mL)、曲安奈德(100μg/mL)、血红素(10μg/mL)、纯化粘蛋白(20μg/mL)、无水乙醇(20％V/V)等潜在的PCR抑制物/干扰物质对本试剂盒无明显影响。具体见下表：
表7
稳定性实验
常规方法检测实施例1试剂盒的稳定性，结果表明：本试剂盒在实际储存条件(-20±5℃)下储存11个月后检测，性能稳定；37℃加速破坏稳定性实验结果表明，试剂盒在37℃恒温箱中保存24小时，结果符合质量要求；冻融稳定性试验表明，不同盒试剂盒在实际储存温度下在每次检测时间点经过一次冻融，连续检测4次，结果均符合质量要求。
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
因此，发明人还设计了其余一些引物和探针(序列未示出)组成了不同的检测体系，同样用于检测上述病原体，具体检测结果如图6所示，结果表明，此检测体系只出现部分扩增曲线，且扩增效率显著降低，且存在其他靶标无扩增曲线，因此，整体检测效果差。
Claims (10)
1.一种检测消化道病原体的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测幽门螺旋杆菌的上下游引物及探针；
如SEQ ID NO:4～6所示的检测甲型肝炎的上下游引物及探针；以及
如SEQ ID NO:7～9所示的检测戊型肝炎的上下游引物及探针。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括检测内标的上下游引物及探针。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括用于检测内标的上下游引物及探针为如SEQ ID NO:10所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:11所示的内标下游引物，和如SEQ ID NO:12所示的内标探针。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，幽门螺旋杆菌探针的荧光报告基团为FAM；甲型肝炎探针的荧光报告基团为HEX；戊型肝炎探针的荧光报告基团为ROX；内标的荧光报告基团为CY5。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备消化道病原体联检并区分的试剂盒中的用途，其中，所述病原体是甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒以及幽门螺旋杆菌。
7.一种消化道病原体联检并区分的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～5中任一项所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂、逆转录酶、DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
10.一种以非诊断目的检测并区分消化道病原体的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如权利要求1～5中任一项所述的组合物或权利要求7或8所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
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