CN116790780A - 检测脑炎相关病原体的组合物、试剂盒，方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及脑炎相关病原体的检测，更具体地，涉及屎肠球菌、粪肠球菌和乙型脑炎病毒的检测。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现屎肠球菌、粪肠球菌、乙型脑炎病毒的检测和区分。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到100拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及不同类型脑炎相关病原体的检测，更具体地，涉及屎肠球菌、粪肠球菌和乙型脑炎病毒的检测。
背景技术
肠球菌属细菌是寄居于人体和动物肠道内的正常菌群，异位寄生可致尿路感染、呼吸道感染、伤口感染、心内膜炎、脑炎、脑膜炎和败血症等。近年以来，由粪肠球菌与屎肠球菌导致的疾病逐渐增加，特别是粪肠球菌与屎肠球菌导致脑膜炎病例的出现，无疑是给人类与动物的健康带来了严重的威胁，目前在已研究的细菌性脑膜炎病例中，毒力因子在引起炎症、破坏血脑屏障通透性等方面发挥重要作用，但粪肠球菌与屎肠球菌破坏脑组织结构、引起脑膜炎、脑炎的机制尚不清除。
流行性乙型脑炎是常见的中枢神经系统感染性疾病，由乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus，JEV)感染引起，疾病的死亡率和致残率均较高。JEV感染并突破血脑屏障、进入中枢神经系统后，直接靶向神经元并引起神经元的损伤。目前研究认为JEV引起神经元损伤的相关因素包括炎症反应、细胞凋亡、内质网应激等，具体的机制尚不十分清楚。
可见，粪肠球菌与屎肠球菌和乙型脑炎病毒都能够通过特定的方式参与脑炎疾病的发展，由于上述三种病原体诱发脑炎疾病的方式、病原体耐药性不同，因此需要针对具体的病原体制定有效的脑炎疾病治疗策略。
因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述不同的病原体，以便为后续治疗提供针对性的策略，并且灵敏度高，特异性好。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供一种不同类型病原体检测的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测屎肠球菌的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:4～6所示的检测粪肠球菌的上游引物、下游引物及探针；以及
如SEQ ID NO:7～9所示的检测乙型脑炎病毒的上游引物、下游引物及探针。
本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同靶点，对不同类型的病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实屎肠球菌、粪肠球菌、乙型脑炎病毒的检测和区分，以便为后续治疗提供针对性的策略。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到100拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。
进一步地，所述组合物包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。
在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是Rnase P。
在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括如SEQ ID NO:10～12所示的检测内标的上游引物、下游引物及探针。
进一步地，本发明组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用ATTO425、Quasar705、FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
在一些具体的实施方案中，屎肠球菌探针的荧光报告基团为FAM；粪肠球菌探针的荧光报告基团为HEX；乙型脑炎病毒探针的荧光报告基团为ROX；内标的荧光报告基团为CY5。
进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
本发明的组合物可以任意组合成检测对应4个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。
举例来说，可以包括上述4对引物和探针中的任意3对，可以包括上述4对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述4对引物和探针中的任意1对。
在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光PCR。
进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。
进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备不同类型病原体检测的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为屎肠球菌、粪肠球菌、乙型脑炎病毒。
第三方面，本发明提供了一种检测不同类型病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水、内标基因中的至少一种。阳性质控品是屎肠球菌、粪肠球菌、乙型脑炎病毒的片段质粒或片段DNA中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂，以及DNA聚合酶中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、dUTP、UNG酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括Taq酶、Mg2+、dNTP(U)s、引物、探针和PCR缓冲液。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20μl～200μl。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。
第四方面，提供了一种检测不同类型病原体的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是血液、血浆等，但不限于此。还可以是肺泡灌洗液、痰液、穿刺组织、脓液、伤口分泌物等等。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃，时间为5～20min，1次循环；预变性，温度为95℃，时间为1～3min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
在一个具体的实施方案中，提供了一种用于制备不同类型病原体检测的组合物的用途，所述检测包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃，时间为5～20min，1次循环；预变性，温度为95℃，时间为1～3min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
附图说明
图1为本发明组合物检测结果图(分别为屎肠球菌、粪肠球菌、乙型脑炎病毒)；
图2～5为本发明组合物灵敏度结果图(分别为屎肠球菌、粪肠球菌、乙型脑炎病毒、内标)；
图6为本发明组合物特异性结果图；
图7为本发明对比例组合物检测结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
本发明所使用的引物及探针如下表1所示。
表1
其中，屎肠球菌探针的荧光报告基团为FAM；粪肠球菌探针的荧光报告基团为HEX；乙型脑炎病毒探针的荧光报告基团为ROX；内标探针的荧光报告基团为CY5。
实施例2、检测病原体的方法
荧光PCR扩增反应液：含有PCR缓冲液、Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、探针等。具体的反应体系如表2所示。酶混合液由1μL H-Taq酶(15U/μL)与1μL RT酶混合组成(每人份为2μL)。
表2
| 组份 | 每一个反应中的体积 |
| PCR buffer | 19.2μL |
| dNTP(T)s | 0.5μL |
| Mg2+ | 0.2μL |
| 0.1％DEPC水 | 16.1μL |
| 酶混合液 | 2μL |
| 引物(50pmol/μL) | 0.20μL |
| 探针(50pmol/μL) | 0.10μL |
试剂准备：
根据待测样本、阳性对照、阴性对照的数量，按比例(PCR反应液38μL/人份+酶混合液2μL/人份)取相应量的PCR反应液和酶混合液，充分混匀成PCR混合液，2000rpm离心10s后备用。
样本处理与加样
取200μL待测样本、阴性对照、阳性对照到1.5mL离心管中，使用圣湘生物科技股份有限公司的核酸提取或纯化试剂按其说明书操作进行核酸提取。
吸取上述处理好的样本、阴性对照及阳性对照各10μL分别加入对应的0.2mL PCR反应管中，每管加入40μL PCR混合液，盖上管盖。
在SLAN-96P全自动医用PCR分析系统上，按照一定的温度、时间设置程序进行PCR扩增其扩增反应程序如表3所示。
表3
结果分析与判断：
如果FAM、HEX、CY5及ROX通道有明显S型扩增曲线，且Ct值≤40，则判为阳性；如果FAM、HEX、CY5及ROX通道无扩增曲线(NoCt)或Ct值＞40，则判为阴性，具体如表4所示：
表4
实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果
将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对屎肠球菌、粪肠球菌、乙型脑炎病毒的混合样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行PCR检测，检测结果如图1所示，从图中可以看出，本发明组合物均能对各种病原体进行良好的检测。
实施例4、本发明组合物的灵敏度
使用本发明实施例1中的组合物，对各个靶标进行LOD(灵敏度)检测，以模拟临床样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测。结果如表5所示，表明对低至100拷贝/mL的样本各通道仍然能够准确检测出，表明本发明组合物的灵敏度为100拷贝/mL，具体结果如图2～5所示。
表5
实施例5、本发明组合物的特异性
为了测试本发明实施例1中的组合物的特异性，特异性实验表明，采用本发明中的方法对其他常见病原体(脆弱拟杆菌、幽门螺杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌、腺病毒、单核细胞增生李斯特菌等)进行实验，检测结果示例见图6。结果表明，本发明方法对上述病毒性脑炎病原体无交叉反应。具体见下表6。
表6
| 近似病原体 | 检测结果 |
| 脆弱拟杆菌 | 阴性 |
| 幽门螺杆菌 | 阴性 |
| 沙门氏菌 | 阴性 |
| 金黄色葡萄球菌 | 阴性 |
| 副溶血性弧菌 | 阴性 |
| 志贺氏菌 | 阴性 |
| 腺病毒 | 阴性 |
| 巨细胞病毒 | 阴性 |
实施例6、本发明组合物的抗干扰性
对实施例2的试剂盒采用常规方法分析干扰物，实验结果表明，一定浓度的地塞米松(50μg/mL)、盐酸头孢甲肟(50μg/mL)、扎那米韦(100μg/mL)、利巴韦林(100μg/mL)、阿奇霉素(100μg/mL)、盐酸组胺(200μg/mL)、倍氯美松(50μg/mL)、莫匹罗星(50μg/mL)、妥布霉素(50μg/mL)、莫米松(50μg/mL)、氟替卡松(50μg/mL)、布地奈德(50μg/mL)、曲安奈德(100μg/mL)、血红素(10μg/mL)、纯化粘蛋白(20μg/mL)、无水乙醇(20％V/V)等潜在的PCR抑制物/干扰物质对本试剂盒无明显影响，PCR反应液的在感染物质存在下的扩增结果具体见下表7。
表7
实施例7、本发明组合物的稳定性
常规方法检测实施例1组合物的稳定性，结果表明：本试剂盒在实际储存条件(-20±5℃)下储存11个月后检测，性能稳定；37℃加速破坏稳定性实验结果表明，试剂盒在37℃恒温箱中保存24小时，结果符合质量要求；冻融稳定性试验表明，不同盒试剂盒在实际储存温度下在每次检测时间点经过一次冻融，连续检测4次，结果均符合质量要求。
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
因此，发明人还设计了其余一些引物和探针组成了不同的检测体系1～3(序列未示出)，同样用于检测上述病原体。具体检测结果如图7所示，检测的Ct值存在拖后以及荧光增量明显下降，从图中可以看出检测的整体检测效果差。
Claims (10)
1.一种不同类型病原体检测的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测屎肠球菌的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:4～6所示的检测粪肠球菌的上游引物、下游引物及探针；以及
如SEQ ID NO:7～9所示的检测乙型脑炎病毒的上游引物、下游引物及探针。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括如SEQ ID NO:10～12所示的检测内标的上游引物、下游引物及探针。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，屎肠球菌探针的荧光报告基团为FAM；粪肠球菌探针的荧光报告基团为HEX；乙型脑炎病毒探针的荧光报告基团为ROX；内标的荧光报告基团为CY5。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备检测不同类型病原体的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为屎肠球菌、粪肠球菌、乙型脑炎病毒。
7.一种检测不同类型病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～5中任一项所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂、DNA聚合酶、dNTP、dUTP、UNG酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
10.一种用于制备不同类型病原体检测的组合物的用途，所述检测包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如权利要求1～5中任一项所述的组合物或权利要求7～9中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
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