CN114736991B - 一步法检测致泻性病毒的组合物、试剂盒、方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及检测致泻性病毒的组合物、试剂盒、方法及其用途，更具体地，涉及一步法检测九种致泻性病毒的组合物、试剂盒、方法及其用途。本发明提供了所述试剂组合，包括所述试剂组合的试剂盒，所述试剂组合的用途以及用于检测致泻性病毒并分型的方法。使用本发明的试剂组合，能够一次性检测9种腹泻病毒，覆盖度好。同时，结合一步法核酸释放剂，无需核酸纯化步骤，使用粪便样本与核酸释放剂混匀后，短暂离心取上清直接进行检测，检测周期短，操作步骤少，灵敏度高，特异性好。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及检测致泻性病毒的组合物、试剂盒、方法及其用途，更具体地，涉及一步法检测九种致泻性病毒的组合物、试剂盒、方法及其用途。
背景技术
腹泻是一种发病率高并流行于世界各地的胃肠道传染病，其发病率仅次于上呼吸道感染，病毒性腹泻是我国的常见病和多发病，病因比较复杂，尤对婴幼儿人群危害更大。致腹泻病毒的血清型众多，临床上腹泻综合征往往是由一种或者多种病毒共同导致。因此亟需建立腹泻病毒快速高效的诊断方法。
PCR-荧光探针法操作方便，不易污染，灵敏度和特异性高，相关仪器设备较为常见。但目前使用PCR-荧光探针法检测胃肠道病毒的相关试剂存在以下问题：
1、相关试剂通量低：一次只能检测一个病原成分，如需要检测多种病原菌，就需要多台PCR仪同时工作，效率低，周期长，对大批量的多种病原污染的样品更是无从下手。
2、相关试剂对于粪便样本需要进行提取纯化后才能进行扩增检测，检测周期长，操作步骤多。如果为了缩短检测周期，减少操作步骤而采用一步法提取核酸，则会因为一步法试剂的存在，而影响PCR的扩增效果，使得后续PCR的灵敏度和/或特异性受到影响。
因此，本领域亟需一种能够检测多个病原成分，同时还能够免除纯化，减少操作步骤，同时能够保持PCR灵敏度和特异性的检测试剂。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供一种一步法检测致泻性病毒的试剂组合，包括第一组合物：
SEQ ID NO.1～27所示的引物和探针。
进一步地，所述组合物还包括第二组合物，其中，所述第二组合物为一种包括缓冲液的一步法核酸释放剂。
使用本发明的试剂组合，能够一次性检测9种腹泻病毒，覆盖度好。同时，结合一步法核酸释放剂，无需核酸纯化步骤，使用粪便样本与核酸释放剂混匀后，短暂离心取上清直接进行检测，检测周期短，操作步骤少，灵敏度高，特异性好。
本发明中提及的“一步法”是指样本免提取的核酸释放及扩增技术(ExtractionFree Nucleic Acid Release and Amplification Technology,EFNART)。其是指在不需要对样本进行核酸提取或纯化的情况下，直接搭配强碱性质下的样本核酸释放剂和高兼容性的扩增体系，进行直接的样本核酸扩增检测。
进一步地，第一组合物还包括如SEQ ID NO.28～30所示的内标引物和探针。
在一些具体的实施方案中，第一组合物分为三组：
A、轮状病毒A组、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型的引物和探针；
B、札如病毒、星状病毒、肠道腺病毒的引物和探针；
C、双埃可病毒、轮状病毒B组、轮状病毒C组的引物和探针。
进一步地，第一组合物中每组组内的探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
在本发明中，荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。
进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。
进一步地，如SEQ ID NO.28～30所示的内标引物和探针可以加入A、B、C三组中的任意一组或多组。
进一步地，所述组合物中引物的用量为0.2～0.4μM；所述组合物中探针的用量为0.1～0.3μM。
在一些具体的实施方案中，第二组合物包括：
缓冲液、盐离子、表面活性剂以及强碱。
在一个具体的实施方案中，所述缓冲液的浓度为0.1mM～800mM，优选地，0.5mM～500mM，更优选地，1mM～200mM。
在一个具体的实施方案中，所述盐离子的浓度为1mM～1200mM，优选地，10mM～800mM，更优选地，20mM～500mM。
在一个具体的实施方案中，所述表面活性剂的体积百分比为0.05％～5％，优选地，0.1％～5％，更优选地，0.1％～3％。
在一个具体的实施方案中，所述强碱的质量浓度为1mg/mL～100mg/mL，优选地，1mg/mL～80mg/mL，更优选地，2mg/mL～50mg/mL。
在一些具体的实施方案中，所述缓冲液可以是例如Tris-HCl、巴比妥钠-盐酸缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液。
在一些具体的实施方案中，所述盐离子可以是钠离子、钾离子、镁离子、锰离子。进一步地，可以是氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸锰、硫酸钾、硫酸镁中的一种或多种。
在一些具体的实施方案中，所述表面活性剂可以是吐温20、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇、十二烷基苯磺酸钠、月桂醇硫酸钠、二辛基琥珀酸磺酸钠中的一种或多种。
在一些具体的实施方案中，所述强碱可以是氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或多种。
在一些具体的实施方案中，所述第二组合物包括：Tris-HCl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇和氢氧化钠；其中，Tris-HCl的摩尔浓度为0.5mM～500mM，氯化钠的摩尔浓度为20mM～500mM，吐温20的体积百分比为0.1％～2％，曲拉通X-100的体积百分比为0.1％～3％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为0.1％～3％，氯化钾的摩尔浓度为20mM～500mM，氢氧化钠的质量浓度为2mg/mL～50mg/mL。
在一个具体的实施方案中，本发明的试剂组合的各组合物分别存在于单独包装中。
在一个具体的实施方案中，本发明的试剂组合的各组合物存在于同一个包装中。
进一步地，本发明的试剂组合的各组合物中的各成分以混合的形式存在。
第二方面，本发明提供了上述本发明的试剂组合在制备检测致泻性病毒并分型的试剂盒中的用途。
进一步地，本发明提供了上述本发明的试剂组合在制备一步法检测致泻性病毒并分型的试剂盒中的用途。
第三方面，本发明提供了一种一步法检测致泻性病毒并分型的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的试剂组合。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
在一个具体的实施方案中，阴性质控品是弯曲菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠埃希菌O157、产气荚膜梭菌、单增李氏特菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌中的至少一种。阳性质控品是轮状病毒A组、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型、札如病毒、星状病毒、肠道腺病毒、双埃可病毒、轮状病毒B组、轮状病毒C组中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括：逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶以及DNA聚合酶中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/反应～15U/反应，例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶(MMLV)或者Tth酶；所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：反/逆转录酶、Taq酶、尿嘧啶糖基化酶、Mg2+、Mn2+、Rnasin、dNTP和PCR缓冲液。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20～100μl。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。
第四方面，提供了一种用于检测致泻性病毒并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
1)使用如上所述本发明的第二组合物释放待测样本的核酸；
2)使用如上所述本发明的第一组合物对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是粪便、肛拭子、肠液、血液等，但不限于此。
进一步地，步骤1)为一步法释放待测样本的核酸。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间5～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1～10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为20～60秒，40～50次循环，采集荧光，温度为95℃，时间0～1分钟。
在一个具体的实施方案中，一种用于检测致泻性病毒并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
1)使用如上所述本发明的第二组合物释放待测样本的核酸；
2)使用如上所述本发明的第一组合物对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是粪便、肛拭子、肠液、血液等，但不限于此。
进一步地，步骤1)为一步法释放待测样本的核酸。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间5～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1～10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为20～60秒，40～50次循环，采集荧光，温度为95℃，时间0～1分钟。
附图说明
图1～3为本发明组合物灵敏度结果(第一组合物A～C)；
图4～6为本发明组合物特异性结果(第一组合物A～C)。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
表1
其中，对于第一组合物A检测诺如II型探针NGII-P的5’荧光标记为FAM，检测诺如I型探针NGI-P的5’荧光标记为HEX，检测轮状病毒A组探针RVA-P1的5’荧光标记为CY5，检测外源性内标基因探针DVIC-P的5’荧光标记为ROX，探针的3’末端还具有BHQ1或BHQ2荧光淬灭基团。
对于第一组合物B检测札如病毒探针SAV-P的5’荧光标记为FAM，检测星状病毒探针ASTV-P的5’荧光标记为HEX，检测肠道腺病毒探针EADV-P的5’荧光标记为CY5，检测外源性内标基因探针DVIC-P的5’荧光标记为ROX，探针的3’末端还具有BHQ1或BHQ2荧光淬灭基团。
对于第一组合物C检测双埃可病毒探针PECH-P的5’荧光标记为FAM，检测轮状病毒B组探针RVB-P1的5’荧光标记为HEX，检测轮状病毒C组探针RVC-P1的5’荧光标记为CY5，检测外源性内标基因探针DVIC-P的5’荧光标记为ROX，探针的3’末端还具有BHQ1或BHQ2荧光淬灭基团。
实施例2、一步法检测致泻性病毒的方法
取约0.5g粪便样本加到15mL离心管中，加入6ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10s，以8000r/min离心1min。吸取500μL上清加入到1.5mLEP管中，与第二组合物(Tris-HCl的摩尔浓度为1mM，氯化钠的摩尔浓度为200mM，吐温20的体积百分比为0.3％，曲拉通X-100的体积百分比为2％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为0.2％，氯化钾的摩尔浓度为300mM，氢氧化钠的质量浓度为3mg/mL)等体积混合，震荡混匀15s，静置2min，进行核酸释放，短暂离心取上清进行检测。
实施例1中的引物探针组合按照下列方式，配制成实时荧光PCR反应体系，加入上述的上清溶液进行荧光定量PCR。
第一组合物A
| 组分名称 | 单人份用量/浓度 |
| NGII-F | 0.3μM |
| NGII-R | 0.3μM |
| NGII-P | 0.1μM |
| NGI-F | 0.2μM |
| NGI-R | 0.2μM |
| NGI-P | 0.15μM |
| RVA-F1 | 0.3μM |
| RVA-R1 | 0.3μM |
| RVA-P1 | 0.2μM |
| DVIC-F | 0.2μM |
| DVIC-R | 0.2μM |
| DVIC-P | 0.15μM |
| UNG酶 | 0.5Unit |
| 反转录酶 | 10Unit |
| DNA聚合酶 | 15Unit |
| Mg2+ | 2mM |
| dNTPs(U) | 0.5mM |
| PCR buffer | 19.2μL |
| DEPC水 | 补足体积至40μL |
| 样本的核酸 | 10μL |
| 总量 | 50μL |
第一组合物B
第一组合物C
| 组分名称 | 单人份用量/浓度 |
| PECH-F | 0.2μM |
| PECH-R | 0.2μM |
| PECH-P | 0.1μM |
| RVB-F1 | 0.3μM |
| RVB-R1 | 0.3μM |
| RVB-P1 | 0.15μM |
| RVC-F1 | 0.2μM |
| RVC-R1 | 0.2μM |
| RVC-P1 | 0.1μM |
| DVIC-F | 0.2μM |
| DVIC-R | 0.2μM |
| DVIC-P | 0.15μM |
| UNG酶 | 0.5Unit |
| 反转录酶 | 10Unit |
| DNA聚合酶 | 15Unit |
| Mg2+ | 2mM |
| dNTPs(U) | 0.5mM |
| PCR buffer | 19.2μL |
| DEPC水 | 补足体积至40μL |
| 样本的核酸 | 10μL |
| 总量 | 50μL |
PCR扩增程序按如下条件设置：
结果分析：
反应结束后，调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线)，点击PCR软件的分析按钮进行分析。
结果判定：
实施例3、本发明试剂组合测试样本的检测结果
将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对假病毒进行检测，实验结果如表2～4所示。结果表明，各通道均能正常进行检测，该多重PCR体系能够检测对应靶标的情况，并进行分型，以鉴定致泻性病毒。
表2、第一组合物A
表3、第一组合物B
表4、第一组合物C
从表中可以看出，使用本发明的试剂组合，在一步法中仍然能够保持相当的灵敏度和准确性。
实施例4、本发明试剂组合的灵敏度
将假病毒分别用阴性样本稀释浓度至200拷贝/mL，重复检测20次，检出率均≥95％，以验证本试剂及检测方法的灵敏度。检测结果如下图1～3和表5所示结果表明，在浓度为200拷贝/mL时，本发明试剂组合能够检测所有的待测病毒。
表5
实施例5、本发明组合物的特异性
本发明建立的一步法多重荧光RT-PCR方法对轮状病毒A组、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型、札如病毒、星状病毒、肠道腺病毒、双埃可病毒、轮状病毒B组、轮状病毒C组具有极好的特异性，均能完全检出临床阳性标本，且各靶点之间无交叉反应。本发明中所采用的引物探针与其他致泄性病原菌弯曲菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠埃希菌O157、产气荚膜梭菌、单增李氏特菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应。与其他病原体检测结果图4～6所示(第一组合物A～C)。
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
为了进一步明确本发明试剂组合的优越性，本发明还提供了一些其余所涉及的引物和探针，其在磁珠法(也就是分步提取法)中，效果较佳，但是在一步法中效果却不好，以进一步说明，本发明试剂组合在一步法中也能取得较好的灵敏度。其引物和序列如表6所示
表6
仍然按照实施例2的方法对假病毒进行检测，实验结果如表7～8所示。结果表明，对比例涉及的引物和探针在磁珠法中获得了较低的Ct值，但是当将其用于一步法中，其Ct值大为延后，由此说明，一步法和磁珠法的方法不同，对探针和引物的设计具有明显的影响，并不是所有适合磁珠法的引物和探针都能适用于一步法。
表7
表8
序列表
<110> 圣湘生物科技股份有限公司
<120> 一步法检测致泻性病毒的组合物、试剂盒、
<140> 202210563129 .8
<141> 2022-05-18
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgttcagrt ggatgagrtt 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcgacgccat cttcattcac a 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agcacrtggg agggcgat 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccatgttccg btggatgc 18
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tccttagacg ccatcatcat tta 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgtggacagg agatcgcrat c 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
actcacagaa gagcaactc 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gacttgctag ccatcaca 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tggaggggag gaccaaagaa 20
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
taygaccagg ctctcg 16
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cctccatytc aaacactawt tt 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tggttcatag gyggtacagg 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tcacctactc tggctccgtc c 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
actcgttggg agtaagtagt cg 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
taccaggcca gctcacagag gagt 24
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
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<210> 20
<211> 20
<212> DNA
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<400> 20
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<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ctgcatctgg tgaaatgtac tgttcact 28
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
agagcagaag gaactaagag 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
attggaacaa ctccatgttg ag 22
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
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<400> 24
aatcgtctgg aaggtgaagg agat 24
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gatgcwgcmt ttttaacaaa ttcaag 26
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ggtayaaatc ttctagctga aac 23
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
atcagcatgy gtttttgcat ccca 24
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
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<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cgcatgttta cacttgggtt tc 22
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
caacgtcctg tccaccttcc tcctatg 27
Claims (7)
1.一种一步法检测致泻性病毒的试剂组合，包括第一组合物：
SEQ ID NO.1~27所示的引物和探针；和
第二组合物，包括：
Tris-HCl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇和氢氧化钠；其中，Tris-HCl的摩尔浓度为0.5mM～500mM，氯化钠的摩尔浓度为20mM～500mM，吐温20的体积百分比为0.1％～2％，曲拉通X-100的体积百分比为0.1％～3％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为0.1％～3％，氯化钾的摩尔浓度为20mM～500mM，氢氧化钠的质量浓度为2mg/mL～50mg/mL。
2.根据权利要求1所述的试剂组合，其中，所述第一组合物还包括如SEQ ID NO.28~30所示的内标引物和探针。
3.根据权利要求1或2所述的试剂组合，其中，所述试剂组合的各组合物中的各成分以混合的形式存在。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的试剂组合在制备检测致泻性病毒并分型的试剂盒中的用途。
5.一种一步法检测致泻性病毒并分型的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1~3中任一项所述的试剂组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括逆转录酶、Taq酶、尿嘧啶糖基化酶、Mg2+、Mn2+、Rnasin、dNTP和PCR缓冲液。
7.一种试剂组合用于制备检测致泻性病毒并分型的试剂的用途，所述检测包括以下步骤：
1）使用如权利要求1所述第二组合物释放待测样本的核酸；
2）使用如权利要求1所述的第一组合物对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR分析；
3）获得并分析结果。
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Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120076154A (ko) * | 2010-12-29 | 2012-07-09 | 서울대학교산학협력단 | 노로바이러스 검출을 위한 ｒｔ-ｐｃｒ용 조성물 |
| CN103074449A (zh) * | 2013-01-25 | 2013-05-01 | 海尔施生物医药股份有限公司 | 一种同步检测十三种腹泻病毒的试剂盒及其检测方法 |
| CN108330211A (zh) * | 2017-01-18 | 2018-07-27 | 南京美宁康诚生物科技有限公司 | A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光pcr检测试剂盒及其用途 |
| CN109402240A (zh) * | 2019-01-08 | 2019-03-01 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 核酸释放剂、核酸pcr扩增方法和pcr扩增试剂盒 |
| CN109593890A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-09 | 深圳市刚竹医疗科技有限公司 | 检测腹泻病毒的核酸组合物、试剂盒及试剂盒的使用方法 |
| CN111455094A (zh) * | 2020-06-17 | 2020-07-28 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 检测深部感染真菌的组合物、试剂盒、用途及其方法 |
| CN111733298A (zh) * | 2020-08-25 | 2020-10-02 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 检测多瘤病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途 |
| WO2021208382A1 (zh) * | 2020-04-16 | 2021-10-21 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 检测引起呼吸道感染的病原体并分型的组合物、试剂盒、方法及用途 |
| CN113684311A (zh) * | 2021-08-18 | 2021-11-23 | 上海海洋大学 | 一种特异性快速检测gii型诺如病毒的引物、探针和方法 |
| WO2022060939A1 (en) * | 2020-09-16 | 2022-03-24 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for nucleic acid preparation |
-
2022
- 2022-05-18 CN CN202210563129.8A patent/CN114736991B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120076154A (ko) * | 2010-12-29 | 2012-07-09 | 서울대학교산학협력단 | 노로바이러스 검출을 위한 ｒｔ-ｐｃｒ용 조성물 |
| CN103074449A (zh) * | 2013-01-25 | 2013-05-01 | 海尔施生物医药股份有限公司 | 一种同步检测十三种腹泻病毒的试剂盒及其检测方法 |
| CN108330211A (zh) * | 2017-01-18 | 2018-07-27 | 南京美宁康诚生物科技有限公司 | A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光pcr检测试剂盒及其用途 |
| CN109593890A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-09 | 深圳市刚竹医疗科技有限公司 | 检测腹泻病毒的核酸组合物、试剂盒及试剂盒的使用方法 |
| CN109402240A (zh) * | 2019-01-08 | 2019-03-01 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 核酸释放剂、核酸pcr扩增方法和pcr扩增试剂盒 |
| WO2021208382A1 (zh) * | 2020-04-16 | 2021-10-21 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 检测引起呼吸道感染的病原体并分型的组合物、试剂盒、方法及用途 |
| CN111455094A (zh) * | 2020-06-17 | 2020-07-28 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 检测深部感染真菌的组合物、试剂盒、用途及其方法 |
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| CN113684311A (zh) * | 2021-08-18 | 2021-11-23 | 上海海洋大学 | 一种特异性快速检测gii型诺如病毒的引物、探针和方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Prevalence and Genotypes of Human Noroviruses in Tropical Urban Surface Waters and Clinical Samples in Singapore;Tiong Gim Aw等;APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,;第75卷(第15期);第4984–4992页 * |
| 猪流行性腹泻病毒一步法ＲＴ－ＰＣＲ 检测方法的建立与初步应用 胡;胡丽萍等;《上海畜牧兽医通讯》(第1期);第12-14页 * |
| 腹泻病毒化学发光基因芯片检测方法的建立和验证;周标;刘琪琦;王升启;;军事医学(05);第69-73页 * |
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