CN107148565A - 用于检测血液中的病原体的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明主要涉及一种在血液中检测病原体的方法，所述方法包括：(i)产生代表所述血液的样品红外光谱，其具有一个或多个光谱分量，每个分量具有波数和吸光度值；(ii)提供光谱模型的参比数据库，每个模型具有波数和吸光度值的一个或多个数据库光谱分量，其中所述数据库光谱分量鉴定病原体；(iii)确定一个或多个数据库光谱分量是否对应于一个或多个样品光谱分量；以及(iv)编纂鉴定到的对应数据库分量的名单。可检测的病原体可以包括血液传播的传染性病原体例如人免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝或丙肝病毒(HBV、HCV)和疟疾寄生虫(疟原虫属)。

Description

用于检测血液中的病原体的方法和系统
技术领域
本发明涉及疾病、特别是血液传播的病原体(disease agent)的检测领域。在特别优选的实施方式中，本发明涉及在血液中检测和定量传染病。
在一种形式中，本发明涉及一种使用衰减全反射红外(ATR-IR)光谱法来检测、鉴定和定量血液传播的病原体的方法。
在另一种形式中，本发明涉及一种通过ATR-IR从血液获得的数据的多变量分析的方法。
在一种特别情况下，本发明适用于血液传播的传染病的诊断。
在一种特别情况下，本发明适用于从血液样品诊断疟疾、人免疫缺陷病毒(HIV)或乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)感染。
在后文中为方便起见参考疟疾来描述本发明，但应该认识到，本发明并非仅限于这种用途，并且可用于广范围的其他血液传播的感染因子。
背景技术
应该认识到，在本说明书中包含的文献、装置、技术或知识的任何讨论，是为了解释本发明的背景。此外，整个本说明书中的讨论由于本发明人实现和/或本发明人鉴定到某些相关技术问题而出现。此外，在本说明书中包含的材料例如文献、装置、技术或知识的任何讨论，是为了根据本发明人的知识和经验来解释本发明的背景，因此，任何这样的讨论不应被视为承认在本文中的公开和权利要求书的优先权日期之时或之前，任一所述材料在澳大利亚或别处形成现有技术基础的一部分或相关技术中的公知常识。
衰减全反射红外(ATR-IR)光谱法
光谱法是致力于通过检查电磁辐射与材料的相互作用来发现材料的化学组成的科学分支。红外(IR)光谱法主要涉及波长在电磁波谱的红外区段中的分子振动的能量吸收，其是波数在200至4000cm-1之间的能量。拉曼光谱法涉及单色光的非弹性散射，给出取决于分子振动的波长迁移，通常具有20至4000cm-1之间的波数迁移。
几乎所有生物分子的结构都包括在电磁波谱的IR区段中吸收能量的组成部分。因此，临床样品的IR光谱代表了它的主要生物组分，并且在本质上可以是“代谢指纹”。
ATR是一种可以与IR联合使用的取样技术。ATR光谱法提供了潜在便携的优点，它是廉价的，因此在生物细胞和组织的分析中已变成非常强有力的工具。ATR还允许将样品在固体或液体状态下不需进一步制备直接检查，并且与透射-IR相比，在样品中的路径长度更短，避免了IR信号在高度吸收性介质例如水性溶液中的强烈衰减。
在使用中，将样品放置成与具有比样品更高的折射率的晶体的表面相接触。使一束IR光通过ATR晶体，使得它至少一次从与样品相接触的内表面反射开。这种反射形成扩展到样品内的倏逝波。在样品中的穿透深度取决于光的波长、入射角以及ATR晶体和正被探测的介质的折射率。反射的数目可能变化。然后在光束离开晶体时通过检测器收集它。
病毒性肝炎
病毒性肝炎由6种不相关的嗜肝病毒甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒和庚型肝炎病毒中的一种或多种引起。每年在全世界由于肝炎而发生数百万例死亡。诊断通过评估患者的症状、身体检查和医疗史并结合血液化验、肝活组织检查和成像来进行。在许多情况下，患有肝炎的患者察觉不到症状，只有在日常血液化验期间才变得察觉到疾病。
但是，几种肝脏疾病表现出与病毒性肝炎相似的征兆、症状或肝功能检验异常。因此，正在寻找能够快速且廉价地区分这些各不相同的肝脏疾病的新的诊断技术。优选地，新的诊断技术可以区分各种不同的肝炎病毒。
人免疫缺陷病毒(HIV)
HIV是一种引起包括免疫系统的渐进性故障的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的慢病毒。许多患者没有察觉到他们已被HIV感染并蔓延，即使在高感染风险的人群中通常也不进行例行测试。
HIV测试始于一式两份进行的用于检测抗体阳性患者的酶联免疫吸附测定(ELISA)。然后使用更特异性的测试(例如Western印迹或免疫荧光测定法)进行确认性测试。如果单独使用Western印迹，通常在超过一个月后收集第二份样本并重新测试。也可以进行核酸测试例如PCR测试，其可以帮助诊断。
尽管这些已确立的测试方法非常准确，但它们在时间、劳力和费用方面负担过重。因此，仍在寻找可以快速廉价地检测HIV感染的新的诊断技术。
疟疾
疟疾是由疟原虫属(Plasmodium)的5种寄生性原生动物恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫curtisi亚种(Plasmodiumovale curtisi)、卵形疟原虫wallikeri亚种(Plasmodium ovale wallikeri)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)引起的蚊虫传播的疾病。每年有多达一百二十万例死亡，并且准确和早期的诊断并随后立即进行感染的治疗，对于降低死亡率和防止抗疟药的过度使用来说是必不可少的。
在其生命过程中，疟疾寄生虫穿越几个发育阶段，包括有性和无性繁殖途径。诊断疟疾的新技术必须成本效益高，具有高灵敏度，并且能够检测疟疾寄生虫的循环阶段即环状体和配子体形式，因为这些形式是在外周血循环中存在的仅有阶段。
最适情况下，在患者中诊断疟疾后进行适合的抗疟疾治疗，其必须立即开始。治疗应该由三个主要因素指导：
●感染的疟原虫物种的身份；
●患者的临床状态；以及
●感染的寄生虫的药物敏感性，正如由获得感染的地理区域和抗疟药物的以前使用所确定的。
出于三个主要原因，为治疗目的确定感染的疟原虫物种是重要的。首先，恶性疟原虫和诺氏疟原虫感染可以引起快速发展的严重疾病或死亡，而其余的物种例如间日疟原虫、卵形疟原虫或三日疟原虫不太可能引起严重表现。其次，间日疟原虫和卵形疟原虫感染还需要对在肝脏中保持休眠并可以引起复发感染的休眠体形式进行治疗。最后，在不同的地理区域中，恶性疟原虫和间日疟原虫具有不同的药物抗性模式。对于恶性疟原虫和诺氏疟原虫感染来说，紧急开始适合的治疗是特别关键的。
也已做出努力，以调查同步加速器傅里叶变换红外(FTIR)与主成分分析(PCA)的组合，在Hz和特定脂类的分子特征的基础上区分寄生虫生命周期的红细胞内阶段的潜力(Webster等，使用同步加速器FT-IR显微光谱术和人工神经网络辨别疟疾寄生虫的红细胞内生命周期阶段(Discriminating the Intraerythrocytic Lifecycle Stages of theMalaria Parasite Using Synchrotron FT-IR Microspectroscopy and an ArtificialNeural Network)，Analytical Chemistry 2009,81.2516-2524)。Webster等发现，随着寄生虫从其早期环状体阶段成熟到营养体并最终到裂殖体阶段，存在着特定脂类条带的吸光度增加和迁移。
这项工作证实了使用FTIR光谱法作为疟疾诊断工具的潜力，但显然基于同步加速器的方法不适合于野外使用或日常实验室使用。
FTIR光谱学诊断依赖于光谱的精确获取、光谱的预处理和化学计量工具例如人工神经网络分析(Lasch等，J.Chemometr.20,209-220(2006))或无监督层序聚类分析(Bambery等，Biochim.Acta.1758,900-907(2006)；Wood等，Gynecol.Oncol.93,59-68(2004))。
在生物样品之间存在大量光谱变化，其由大量因素引起，包括由制备技术造成的光谱散射和散射假象，其已妨碍了FTIR作为临床诊断工具的发展。此外，一些生物组成部分具有不符合Beer-Lambert定律的红外摩尔吸光率特征。
FTIR光谱方法也已被用于检测癌和前癌细胞和组织(Whelan等，J.Biophotonics6,No.10,775-784(2013)/DOI 10.1002/jbio.201200112)。为了克服非Beer-Lambert型红外吸收行为，开发了简单的统计模型来预测细胞内DNA的浓度。然而，在这项研究中承认，从所述研究开发的简单模型不足以用于复杂的细胞或生物化合物的复杂混合物。
在另一项研究(Sitole等，OMICS A J.Integrative Biol.18(8)513-523(2014))中，已探索了将血清的mid-ATR-FTIR光谱曲线作为HIV/AIDS的诊断工具。尽管所述系统显示出诊断的希望，但显然由于在人为差异的基础上建模，问题出现在所使用的数据上。特别是，由于结合水的差异和由在光谱上缺少ATR校正引起的假象，在载量图中观察到分离。
因此，对于能够将FTIR更广泛地用作诊断工具的新方法，存在着需求。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种适合于检测、鉴定和定量血液传播的传染性病原体的方法。
本发明的一个目的是提供一种适合于野外使用或实验室使用的检测和定量血液传播的传染病的方法。
本发明的一个目的是提供一种适合于在全血或血浆或血细胞或干燥全血的样品中检测和定量血液传播的传染性病原体的方法。
本发明的另一个目的是缓和与相关技术相伴的至少一种缺点。
本文描述的实施方式的目的是克服或缓和至少一种上面提到的相关技术系统的缺点，或至少提供相关技术系统的有用的替选方案。
在本文描述的实施方式的第一种情况下，提供了一种在血液样品中检测病原体的方法，所述方法包括下述步骤：
(i)产生代表所述血液样品的红外样品光谱，所述样品光谱具有一个或多个光谱分量，每个分量具有波数和吸光度值，
(ii)提供光谱模型的参比数据库，每个模型具有波数和吸光度值的一个或多个数据库光谱分量，其中所述数据库光谱分量鉴定病原体，
(iii)确定所述参比数据库是否具有对应于一个或多个样品光谱分量的一个或多个数据库光谱分量，以及
(iv)编纂鉴定到的对应数据库分量的名单。
优选地，所述方法的步骤(ii)还包括选择一个或多个光谱窗口以在其中进行步骤(iii)。
通常，所述IR光谱通过将倏逝IR光束发送通过与患者血液样品相接触的ATR衬底来产生。这可以通过将所述样品放置或干燥在ATR上或从载片例如玻璃或塑料载片上厚的血膜来获得。其他替选方案是获得样品，所述IR光谱使用焦平面阵列、即玻璃上的薄血液涂片的焦平面光谱成像来产生。
在发展中国家，大多数实验室目前将载片上的厚血膜用于日常显微术。因此，特别有利的是，本发明的方法可用于分析载片上的厚膜，而不需改变目前的实验室方法。此外，本发明的方法可用于在归档的厚膜血液样品中检测病原体。
本发明还有利地提供了使用极小血液体积的选项，例如少于50μl、更优选地在5至25μl之间的单滴血液。大多数感染性疾病的诊断技术均需要远远大量的血液。
在一种特定情况下，本发明适用于从血液样品诊断人免疫缺陷病毒(HIV)或乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)感染或其他血液传播的病毒性疾病，包括病毒性出血热病毒，其包括但不限于几种病毒科包括砂粒病毒科(Arenaviridae)(拉沙热、胡宁和马丘波)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)(克里米亚-刚果出血热、里夫特裂谷热、汉坦出血热)、丝状病毒科(Filoviridae)(埃博拉和马尔堡)和黄病毒科(Flaviviridae)(黄热病、登革热、鄂木斯克出血热、凯萨努森林病、西尼罗病毒)的病毒，通过节肢动物或媒介传播的病毒例如甲病毒科(Alphaviridae)的病毒。其他血液传播的人类传染病可能由寄生虫传播，其包括疟疾(包括疟疾的各种不同阶段和各种不同物种的区分)、非洲锥虫病、巴贝西虫病、查加斯病、利什曼病和弓形虫病。血液传播的寄生性病原体包括巴贝西虫分歧巴贝西虫(BabesiaB.divergens)、双芽巴贝西虫(B.bigemina)、马巴贝西虫(B.equi)、微小巴贝西虫(B.microfti)、B.duncani、利什曼原虫刚地弓形虫(Leishmania Toxoplasma gondii)、恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫curtisi亚种、卵形疟原虫wallikeri亚种、三日疟原虫、诺氏疟原虫、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)和克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)。
血液样品
患者的血液样品可以采取任何方便的形式，例如全血、血浆、血细胞、干全血或其组合。优选地，所述血液样品是全血，并且可以通过简单的扎手指收集并直接递送到IR光谱仪或玻璃或塑料载片上。
但全血不总是最适合于特定疾病的诊断。所使用的形式取决于广泛因素，包括方便性和用于处理全血的装置的可用性。特别是应该指出，与特定疾病相关的IR光谱的变化可能是由于疾病无关或相关的其他因素造成的。那些因素可以掩盖目标吸光度或模式，并使编纂对应于数据库中的光谱模型的样品分量的名单变得困难。
因此，可能必需进行简单的全血预处理步骤以消除无关的组分例如水(“干”样品)、细胞(血清样品)、蛋白质和极性化合物(有机萃取的样品)或分离目标化合物例如白细胞或脂类。进行预处理步骤可以使否则不能通过全血样品的直接测量检测的疾病的诊断变得可能。
优选地，所述血液样品是“湿的”，即处于液体形式并且不被干燥。在一种形式下，所述“湿的”血液样品可能含有天然存在的溶剂例如水或故意添加的溶剂例如甲醇。
湿样品包括例如通过扎手指从患者收集的全血。在野外，可以将全血样品裂解并添加溶剂，通常为水。或者，可以将全血分级以分离血浆。通常，分级在实验室中进行，在那里比在野外容易获得适合的设备。例如，可以将全血样品用溶剂例如氯仿萃取，以提取脂质双层以备分析。
作为湿样品的不太优选的替选方案，患者的血液样品可以是“干的”，即已通过在空气中干燥、在热灯下或通过另一种干燥方法驱除掉天然存在或添加的溶剂。
鉴定病原体的光谱分量
血液中存在的病原体例如传染性因子包括吸收能量以在中-IR范围内产生信号的生物组成部分。所述能量可能直接被病原体例如血液中存在的病毒吸收。或者，所述能量可能被指示所述病原体存在的其他生物实体吸收。由某些病原体引起的代谢变化可以引起诸如葡萄糖或尿素的物质的血液水平升高，因此间接地指示病原体的存在。
例如，如果所述病原体是疟疾，血液样品将表现出与疟疾的分子表型相关的IR吸收带，所述分子表型是与在疟疾寄生虫的繁殖周期中产生的传染性病原体相关的所有分子和化学组分。由于病原体修改患者的代谢状态包括修改宿主细胞及其对传染性病原体的响应，可能发生其他间接吸收。重要的是，本发明可能能够区分疟原虫属的5种寄生性原生动物。例如，使用恶性疟原虫、间日疟原虫和三日疟原虫的试验已证实，在这三种物种之间可以检测到光谱差异，并且本发明的方法可以区分它们。
每种病毒和/或传染性病原体都具有独特的特征，例如对于HIV来说，这些粒子含有单链RNA，其紧密结合于核衣壳蛋白、晚期装配蛋白和病毒粒子发育所必需的酶例如反转录酶和整合酶。对于能够感染血细胞内的细胞组分的传染性病原体来说，在细胞内还存在独特的复制型。例如，HIV感染人类免疫系统中至关重要的细胞例如辅助性T细胞(特别是CD4+T细胞)、巨噬细胞和树突状细胞。
因此，存在着检测对应于每种传染性病原体的分子表型并包括病毒的复制性中间体、“游离的”病毒粒子以及被感染细胞的变化的IR吸收带的可能性。其他血液传播的传染性病原体可能在全血中不主动复制但在血液中可以发现病毒粒子或其他病毒组分，例如对于乙肝病毒来说，在其中发现3种形式。最丰富的是小的球形非传染性粒子，含有HBsAg，其直径为17至25nm。在某些血清中已经检测到每ml 1013个粒子或更高的浓度。也观察到各种不同长度的管状、细丝状形式，但具有与所述小粒子可比的直径。它们也含有HBsAg多肽。第三种形态的形式是42nm的乙肝病毒粒子。
下面的表(表1)和图3示出了生物化合物的典型IR带和它们相应的指派。通过这些带，血液中传染病的存在可以直接或间接地与IR光谱相关联。
表1：
例如，图19示出了具有高的HIV病毒载量的全血样品在减去对照光谱后的IR光谱。此时差异已被增强，并且可以将光谱如下划分：
(A)在病毒的情况下，约1010至1050cm-1和约1140至1190cm-1处的吸收带被增强。由于它们被指派给RNA和DNA，因此它们可潜在地归属于病毒本身(直接关系)。
(B)在病毒的情况下，约1380至1410cm-1处的吸收带也被增强。难以确立它们的起源，但它不是典型的核吸收带，并且是由病毒对其他代谢物的影响造成的(间接关系)。
(C)对于不同样品来说，在约1060至1150cm-1、约1195至1340cm-1和约1410至1690cm-1的区域内的吸收带通常显示出不同的模式。因此，它们不与病毒的存在相关。它们可能与不与疾病状态相关的其他生物因素相关。
因此，可以根据带(A)和(B)鉴定HIV。然而，考虑到血液样品的大量天然变动，不与疾病相关的光谱特点(C)可能占优势。因此，如果依靠单一的波数来检测，可能难以获得足够的灵敏度和特异性，并且使用机器学习算法寻找光谱中的模式是优选的。
光谱模型
上述模式通常通过模型来发现，所述模型根据预期将由分类函数执行的运算的范围(即f＝g(x)的可能的g(x))来表示。算法是用于建立g(x)的数学过程(通常为迭代的)。在本发明中，模型由建立血液样品的光谱(X)与血液样品的某些属性即鉴定病原体的光谱分量(Y)之间的数学关系的算法(Y疾病的存在＝f(X光谱))构成。
图20是流程图，说明了如何将患有和未患疾病的光谱输入到算法，学习每一类别(对疾病的存在阳性、阴性或未知)的光谱的特征性光谱分量，由此形成“校准矩阵”。由此提供了一组数学运算，其可以应用于新的血液样品的光谱(吸光度值的载体)，以产生确定所述光谱是否可以被分类为阳性、阴性或未知的值。
模型可能特异性针对一种特定病原体(例如对于HIV和乙肝病毒来说分开的模型)或病原体的组合。组合的模型对于常常一起鉴定的两种或更多种病原体(例如HIV+乙肝病毒)来说特别有用。
用于分类的算法
适用于本发明的算法包括但不限于下述算法：
-线性建模(LDA、PLSDA、SIMCA)；
-神经网络分析(NNA)；
-随机森林算法(RF)；
-支持向量机(SVM)。
通常，独立地调查所有所述算法对每个数据集的表现。最佳建模系统的选择通常基于获得的预测结果。也可以使用聚集模型(也就是说，对于每个样品来说，每种建模系统给出类别的投票，并且最终预测通过计算那些投票的模式来获得)。
应该指出，不存在为特定病原体的诊断确立的“最佳模型”。取决于病原体固有的不同因素、样品的数目和那些样品的变化性，某些算法显示出比其他算法更好的分类性能。因此，对于每个应用来说，应该进行对不同建模可能性的先期深入研究。最适情况下，应该确立建模中涉及的所有变量。
可以对光谱进行某些预处理来准备它们以备建模，以便提高模型性能。
正如下文所述，一组波数的选择可能能够获得更好的分类性能。
可以被优化以产生有用模型的其他变量包括RF中树的数目和PLSDA中的潜变量。
在本文描述的实施方式的第二种情况下，提供了一种产生在光谱模型的参比数据库中使用的光谱模型，用于检测血液样品中的病原体的方法，所述方法包括下列步骤：
(i)收集代表携带所述病原体的血液样品和不含所述病原体的血液样品的校准红外光谱，所述校准光谱具有一个或多个光谱分量，每个分量具有波数和吸光度值；以及
(ii)产生算法Y疾病的存在＝f(X光谱)，其确立所述血液样品的光谱(X)与鉴定所述病原体的血液样品的光谱分量(Y)之间的关系。
模型的产生：
在产生适合的模型中常用的步骤包括下述步骤，并在图23中说明：
获得样品组：收集一组血液样品和它们的参比数据(即对于给定病原体来说，它们是阳性还是阴性的)。记录血液样品的IR光谱，并使用它们来产生矩阵X(n＝样品x的数目，v＝波数数目)和参比数据的向量Y(nx1)。将所述血液样品分类到3个不同亚组中：校准，验证和试验组。
光谱的预处理：在建模之前可以对上面提到的光谱进行数学运算，其目的是除去额外的外部变化源并提高与目标带相关的光谱的差异。这些数学运算包括例如：
-基线迁移和路径长度变化的校正，
-与实验程序相关的光谱假象的校正(大气的贡献、散射或ATR校正)，和
-通过使用导数或均值中心化，提高光谱之间的带、特别是带的最大值位置的差异。
变量选择程序：可以除去光谱的无信息部分以便提高分类的准确性。具体来说，优选地使用与特定疾病相关的有限数目的波数(选择的光谱窗口)。例如，对于某些病原体来说，光谱的有信息部分可能是3100至2700cm-1处表征脂类的C-H(拉伸)。对于蛋白质、核酸和糖类来说，光谱的有信息部分可能是从1800至900cm-1。对于表现出酰胺1、2或3拉伸模式的组成部分来说，光谱的有信息窗口更可能在1800至1200cm-1处。
可以使用多个光谱窗口并顺序或同时处理它们。
两个或更多个所选光谱窗口的使用通常提高使用所述模型获得的结果的准确性。例如，图24至27说明了使用对疟疾阳性的样品和对照样品，使用一个光谱窗口(图24和25)和两个光谱窗口(图26和27)时对红细胞样品(用甲醇固定)进行的PLS-DA(如下所述)。
具体来说，图24和25涉及使用对应于与疟疾相关的脂类的光谱窗口，并对应于混淆表(CV)(表2)：
表2： 对照 真实疟疾
预测为对照 10 11
预测为疟疾 3 84
图26和27涉及除了对应于用于疟疾的C-O和P-O区域的光谱窗口之外，还使用对应于与疟疾相关的脂类的光谱窗口，并对应于混淆表(CV)(表3)：
表3： 对照 真实疟疾
预测为对照 13 1
预测为疟疾 0 92
显然，使用一个窗口产生一些假阳性和一些假阴性，但是当使用两个光谱窗口时模型的性能得到改善。
建模：在上述预处理和变量选择步骤后，仅仅将校准数据用于建造模型。应用算法并确立函数y＝f所选的(x)。这一过程也可起到设置模型的某些内部参数的作用。
参数的优化：在这一步骤中，将所述函数应用于验证组样品的光谱。将由所述函数返回的Yval与参比数据的函数进行比较，由此鉴定任何分类误差。在此时，使用对应的相关误差，可以改变参数(预处理、变量选择、模型类型、算法和其他变量)，并且可以获得新的f(x)。可以选择具有满足应用要求的分类性能的函数(和相关的参数)之一y＝f所选的(x)。因此，所述验证组仅用于调制使用训练组产生的在建模中涉及的所有参数。
对于本领域技术人员来说，显然所述过程可以迭代，但是参数的选择也可以通过各种不同的其他方法或方法的组合来进行，所述方法包括：
-使用所述分析问题的特点的知识；例如，如果模型不是线性的，则不将PLSDA用于或不将CO2区域用于分类，以及
-使用迭代程序(例如在变量选择中的遗传算法)。
优化：所述优化步骤包括：使用例如变量的所有可能的值计算分类误差，并选择PLSDA中的潜变量。如果样品的数目有限并且验证组不可用，这一程序也可以使用训练组的CV来进行。
模型测试：然后使用样品的独立试验来评估在建模步骤中选择的函数的真实分类能力(也就是说，将试验样品的X试验光谱作为输入引入到所述函数中，并将输出与参比数据Y试验进行比较)。误差值是所述分类的预期误差。如果可以推测，则所述模型准备好用于疾病状态未知的新的患者血液样品。
新样品的诊断：一旦使用已知的误差限度确立适合的y＝f所选的(x)，则可以将它应用到来自于患者的新样品的光谱，以确定响应(阳性和阴性)。
可以容易地认识到，所使用的方法也需要监测以确保不间断的准确性。这可以使用可以在所述模型中预测未来变化的对照样品来进行。
图21示出了模型产生和应用于具有未知疾病状态的血液样品的优选实施方式。所述模型可以是线性或非线性的。但是在这个优选实施方式中，在通过偏最小二乘算法的鉴别分析(PLS DA)的基础上产生线性模型，以提供每个波数(i)的权重的向量，即“回归向量”：
W＝(w1,w2,w3.....wi)
正如前面描述过的，优选地使用与特定疾病相关的有限数目的波数(所选的带宽度)。存在选择那些波数的各种不同方式，从目标区域的直接选择到复杂的迭代选择例如遗传算法。
将光谱考虑为吸光度值的向量：
X＝(x1,x2,x3.....xi)
通过用回归向量W(i)乘以每个吸收处光谱的吸光度值X(i)来计算最终结果：
Y＝(w1x1+w2x2+w3x3.......wixi)
接近于+1的Y值被指派给一个类别(例如对所述病原体阳性)，并将接近于0的Y值指派给另一个类别(例如对所述病原体阴性)。应该认识到，与指派到一个类别或另一个类别相关的截止值是任意的，并且是可以优化或改变的变量之一。这可能是适合的，例如如果相比于假阴性优选具有更多的假阳性的话。
因此，本发明的方法可以包括将血液样品分配或标注为对疾病阳性、对疾病阴性或疾病状态未知的另一个步骤。因此，所述另一个步骤可以包括：
(iv)确定编纂的每个相应光谱模型中样品分量的数目，并对所述编纂的光谱模型进行排序。
或者，所述另一个步骤可以包括：
(iv)确定编纂的每个相应光谱模型中样品分量的数目，并在预先确定的分类标准的基础上对所述编纂的光谱模型进行分类。
图22包括的流程图描述了本发明的用于产生模型的方法，用于将样品分类为对包括乙肝病毒(HepB)和丙肝病毒(HepC)的肝炎病毒(Hep)阳性或阴性。根据本发明，所述模型可用于鉴定特定肝炎病毒(甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎)或肝炎病毒的组合。
具体来说，图22反映了使用10个装载有HepB的血液样品(血清样品)、10个装载有HepC的血清样品和11个装载有HIV的血清样品的校准。预处理步骤包括计算一阶导数和均值中心化。变量选择步骤由选择适合的指纹区域(900-1750cm-1)构成。
然后将PLS模型与NINPALS算法合并，所述算法是在PLS中用于获得回归向量的权重的迭代算法。使用的另一个参数是LV(4)的数目，Y＝f所选的(x)：回归向量。
所述验证步骤使用有限的样品组(而不是可用的验证组)，利用交叉验证来进行。正如在图22中指示的，使用两种样品(样品号22和33)来测试所述模型。(NB：这仅仅是用于说明。通常将使用远远更多的样品来测试模型)。一旦所述模型适用于对100％的样品进行分类后，它准备好用于对来自于患者的未知血液样品的状态进行分类。
图20示出了在第一步骤中如何使用已知装载有或不含病原体的血液样品收集产生的校准光谱。光谱模型的参比数据库由回归向量确定。产生代表新的血液样品(病原体的存在未知)的IR光谱，并将所述光谱应用于光谱模型的参比数据库，以鉴定所述血液样品的波数和吸光度的一个或多个光谱分量。在这种情况下，所述光谱分量将病原体鉴定为肝炎病毒(HBV或HCV)或HIV。鉴定对应于数据库的相应光谱模型的样品分量的名单。最后，将所述新的血液样品分类为对于肝炎病毒(HBV或HCV)或HIV阳性或阴性。
系统和装置
光谱模型的产生，从已知对特定病原体阳性或阴性的已知血液样品制备校准光谱，可以在实验室中进行。一旦产生它们之后，可以将算法和模型函数并入到软件应用程序(app)中，并无线转发给用户。
因此，在另一个实施方式中，本发明提供了一种计算机可读存储介质，其用于以非瞬时形式储存用于执行在血液样品中检测病原体的方法的应用程序，所述方法包括下述步骤：
(i)记录代表所述血液样品的IR光谱；
(ii)将所述光谱与光谱模型的参比数据库进行比较，以鉴定所述血液样品的波数和吸光度的一个或多个光谱分量，其中所述光谱分量鉴定病原体；以及
(iii)编纂鉴定到的对应于所述数据库的相应光谱模型的样品分量的名单；
其中步骤(i)至(iii)是自动的。
对于本领域技术人员来说，显然除了将所述应用程序储存在计算机可读存储介质上之外，可以将它储存在云或其他计算等同物中。因此，提供了一种适用于能够在血液样品中检测病原体的应用程序，所述应用程序包含预先确定的指令集，所述指令集适用于能够进行包含下述步骤的方法：
(i)产生代表所述血液样品的样品红外光谱，所述样品光谱具有一个或多个光谱分量，每个分量具有波数和吸光度值，
(ii)提供光谱模型的参比数据库，每个模型具有波数和吸光度值的一个或多个数据库光谱分量，其中所述数据库光谱分量鉴定病原体，
(iii)确定所述参比数据库是否具有对应于一个或多个样品光谱分量的一个或多个数据库光谱分量，以及
(iv)编纂鉴定到的对应数据库分量的名单。
因此，为了运行本发明的方法，只需要具有用于产生患者血液样品的IR光谱的手段(例如标准的FT-IR光谱仪和钻石晶体ATR附件)和推演诊断的模型函数。这意味着本发明的方法可以适应于相对小的尺寸，其适合于野外使用，甚至在边远地区使用。
因此，在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于在血液样品中检测病原体的系统，所述系统包含用于捕获IR光谱的光谱仪和计算机，其中
(i)所述光谱仪产生代表所述血液样品的IR光谱，
(ii)所述计算机将所述光谱应用于光谱模型的参比数据库，以鉴定所述血液样品的波数和吸光度的一个或多个光谱分量，其中所述光谱分量鉴定病原体，并且
(iii)所述计算机编纂鉴定到的对应于所述数据库的相应光谱模型的样品分量的名单。
其他情况和优选形式公开在说明书中和/或定义在形成本发明的描述的一部分的随附的权利要求书中。本质上，本发明的实施方式起源于下述领悟，即使用机器学习算法等可以审查血液样品的IR光谱内吸光度的模式，并将其用于鉴定疾病状态的存在或不存在。
本发明提供的优点包括下述优点：
●感染的快速检测，便于快速治疗；
●体内存在的传染性病原体的快速鉴定；
●直接的低成本的诊断方法；
●可以使用现有设备的方法；
●可以与现有的血液样品收集技术一起使用，例如使用厚膜载片样品；
●可用于检测广范围的病原体，包括HIV、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒和戊肝病毒、庚肝病毒或其他血液传播的病毒性疾病，包括病毒性出血热病毒，其包括但不限于几种病毒科包括砂粒病毒科(拉沙热、胡宁和马丘波)、布尼亚病毒科(克里米亚-刚果出血热、里夫特裂谷热、汉坦出血热)、丝状病毒科(埃博拉和马尔堡)和黄病毒科(黄热病、登革热、鄂木斯克出血热、凯萨努森林病、西尼罗病毒)的病毒，通过节肢动物或媒介传播的病毒例如甲病毒科的病毒。血液传播的寄生性病原体包括巴贝西虫分歧巴贝西虫、双芽巴贝西虫、马巴贝西虫、微小巴贝西虫、B.duncani、利什曼原虫刚地弓形虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫curtisi亚种、卵形疟原虫wallikeri亚种、三日疟原虫、诺氏疟原虫、布氏锥虫和克氏锥虫；
●可以辨别血液样品中存在的相似或近缘的病原体；
●可以利用极小的血液体积(小滴)。
从后文中给出的详细描述，本发明的实施方式的适用性的进一步范围将变得显而易见。然而，应该理解，所述详细描述和特定实例尽管指示了本发明的优选实施方式，但仅仅是出于说明而提供的，因为对于本领域技术人员来说，从该详细描述，在本文公开内容的精神和范围之内的各种不同改变和修改将变得显而易见。
附图说明
相关领域的专业技术人员通过结合附图参考下面的实施方式的描述，可以更好地理解本申请的优选和其他实施方式的其他公开内容、目的、优点和方面，所述附图仅仅为了说明而提供，因此不限制本文中的公开内容。
附图涉及下述内容：
图1展示了从不同样品组获得的光谱；全血(1)，裂解的全血(3)，血浆(5)，RBC(7)，甲醇中的RBC(9)和凝结的血液的悬液(11)。
图2是RBC的有机萃取物(20)、全血(21)和血浆(22)血液脂类萃取物的ATR-FTIR光谱；
图3示出了与生物化合物相关的典型IR带以及它们向化合物中的各种不同组成部分的指派——νCH3、νCH2、νCH(23)；νCO(24)；ν(P-O)、ν(C＝O)(25)；δCH2和δCH3(26)；氨基酸(27)和酰胺I、酰胺II和酰胺III(28)；
图4是具有不同的乙肝病毒(30)、丙肝病毒(31)和HIV(32)负载的血清的ATR-FTIR光谱。图4a示出了从3000至1000cm-1的完整光谱，图4b示出了从1750至900cm-1的区域跨度，图4c示出了从1250至950cm-1的另一个区域跨度，其与核酸相关。目测检查显示出被HIV感染的样品的光谱中在970和1160cm-1附近的一些带。那些带(黑色箭头)在从肝炎感染的患者获得的光谱中没有出现，并且可以与RNA和DNA的存在相关。
图5是全血的ATR-FTIR光谱，包括对照样品(35)和具有不同的HIV(36)和丙肝病毒(37)负载的样品。图5a示出了从3000至1000cm-1的完整光谱，图5b示出了从1750至900cm-1的区域跨度，图5c示出了从1250至950cm-1的另一个区域跨度，其与核酸相关。在这种情况下，在1140和1110cm-1附近观察到的HIV光谱上的带甚至更加明显。
图6是具有HIV负载的样品的ATR-FTIR光谱，包括对照样品(40)、全血(41)和血清(42)。图6a示出了从3000至1000cm-1的完整光谱，图6b示出了从1750至900cm-1的区域跨度，图6c示出了从1250至950cm-1的另一个区域跨度，其与核酸相关。同样地，示出了特异性指派给核酸的带，在WB的情况下强度高得多。它可能由WB中淋巴细胞的存在引起。那些带在所研究的对照中没有发现。
图7是装载有乙肝病毒的对照和血清样品的ATR-FTIR光谱。图7a示出了从3000至1000cm-1的完整光谱，图7b示出了从1750至900cm-1的区域跨度，图7c示出了从1250至950cm-1的另一个区域跨度，其与核酸相关。裸眼不能发现对照(45)与乙肝病毒的病理样品(46)的光谱之间的差异。
图8是装载有丙肝病毒的对照、全血和血清样品的ATR-FTIR光谱。图8a示出了从3000至1000cm-1的完整光谱，图8b示出了从1750至900cm-1的区域跨度，图8c示出了从1250至950cm-1的另一个区域跨度，其与核酸相关。同样地，裸眼不能发现对照(50)与全血(51)和血清(52)中丙肝病毒的病理样品的光谱之间的差异。
图9a、9b和9c是描绘了多变量分析的结果的图，示出了WB中的HIV(□)、WB中的丙肝病毒(▲)、血清中的乙肝病毒(▼)、血清中的丙肝病毒(*)和血清中的HIV(○)针对对照(◇)的样品/分值。多变量分析被用于阐明差异或发现隐藏的模式。所选的方法是主成分分析(PCA)，一种将样品投影在方差方向上取向的新坐标中的非监督方法(即它不将分类考虑在内，仅仅使用光谱)。在整个数据集上进行的PCA的分值中，两个第一分值间隔显示出血清(56)与全血(57)之间以及特别是HIV(58)和肝炎(60)病毒样品之间的分离。
图10是乙型肝炎(◇)、丙型肝炎(□)和HIV(▲)的采取两种不同格式(图10a和图10b)的血清光谱的多变量分析。在血清数据的情况下，在PC1(62)相对于PC2间隔(63)中HIV-HIV与肝炎被清楚地分开。
图11是采取两种不同格式(图11a和图11b)的血清光谱(仅仅肝炎)的多变量分析。尽管光谱的目测检查没有在乙型肝炎(◇)和丙型肝炎(□)之间在分值图上的比较中揭示出差异，但对于每种疾病存在不同的簇。
图12是血清光谱(仅仅乙型肝炎)的多变量分析(◇)。标记指示了病毒载量的对数。具有最高载量的样品与其他样品清楚地分开。
图13是采取两种不同格式(图13a和图13b)的全血光谱的多变量分析。在全血的情况下，在HIV(□)、丙型肝炎(▲)和对照(◇)之间，分值PC2(70)和PC3(71)清楚地分开。
图14是允许比较来自于感染的WB(73、74)和对照(75)的光谱的ATR-FTIR图，其中使用了干WB样品。图14a示出了从3000至1000cm-1的完整光谱，图14b示出了从1750至900cm-1的区域跨度，图14c示出了从1250至950cm-1的另一个跨度，其与核酸相关。
图15是允许比较来自于感染的WB(77)和对照(78)的光谱的ATR-FTIR图，其中使用了湿的裂解血液样品。图15a示出了从3000至1000cm-1的完整光谱，图15b示出了从1750至900cm-1的区域跨度。
图16是允许比较来自于感染的WB(80)和对照(81)的光谱的ATR-FTIR图，其中使用了干的裂解血液样品。图16a示出了从3000至1000cm-1的完整光谱，图16b示出了从1750至900cm-1的区域跨度。
图17包括了掺有不同载量的疟疾(对照(90)；0.0077％(91)；0.031％(92)；0.25％(93)；0.49％(94)；1.96％(95))的WB的甲醇萃取物的ATR-FTIR图。图17示出了从1700至1728cm-1的区域跨度。清楚地看到羰基带的迁移，其反映出掺杂水平。
图18是WB样品中预测相比于真实寄生虫水平的偏最小二乘法回归图。所述回归分析能够区分高和低的寄生虫载量。注意，所述方法是线性的并覆盖几个数量级。排列检验表明在95％置信度水平下，所述回归是显著地。
图19是具有高的HIV病毒载量的全血样品在减去对照光谱后的ATR-FTIR光谱。
图20是流程图，示出了符合本发明的方法的一个实施方式的步骤。
图21是流程图，更详细地示出了图20的步骤，包括优选的数据操作的指示。
图22是流程图，示出了当用于产生模型以用于将血液样品分类为对肝炎病毒(Hep)或HIV阳性或阴性时的本发明的方法。
图23是另一个流程图，描绘了用于按照本发明对血液样品进行分类的适合模式的产生。
图24是甲醇固定的感染有疟疾的RBC血液样品(□)和对照(◇)样品的预测的Y CV针对线性指数的图，其中Discrim Y 1被标记在虚线上。
图25是3000-2820cm-1的光谱窗口的IR吸收图。
图26是甲醇固定的感染有疟疾的RBC血液样品(□)和对照(◇)样品的预测的Y CV针对线性指数的图。
图27是3000-2820cm-1和1400-900cm-1的光谱窗口的IR吸收图。
图28是对照(100)和载有疟疾寄生虫血症的血液样品(环状体和营养细胞–RP(101)、RNP(102)和TP(103))的4000-0cm-1的光谱窗口的IR吸收图。
图29(a)和29(b)是采取两种不同格式的描绘了图28中描述的结果的多变量分析的结果的图，示出了在3116.19至2768.71和1828.46至852.91cm-1区域中样品的多个SPC文件的样品/分值(对照(◇)，RP(□)，RNP(▲)，TP(▼)，其中椭圆虚线指示了跨x和y轴的95％置信度水平，也标记在虚线中。PC1(70.17％)(110)和PC2(15.20％)(111)被包含在图29b中，其描绘了多个SPC文件的变量/载量。
图30是图46中描绘的样品中寄生虫血症的预测相比于实际水平的偏最小二乘法回归图。(对照(◇)，RP(□)，RNP(▲)，TP(▼))。
图31示出了在2500至4000cm-1区域中的平均谱图的基础上，染色的细胞的可见光图像(图31a)和未处理细胞的IR图像(图31b)。图31c是两个细胞的直观特写(标为A和B，在图31a中圈出)以及对应的IR图像(图31d)。
图32示出了疟原虫感染的区域(◇)、第一未感染区域(▲)和第二未感染区域(□)的与图31相对应的PCA。
图33是变量/载量图。
图34示出了进行的监督的模型PLSDA(无导数)，显示出LV 1分量(连续线)和Y1的Reg向量(虚线)。
图35是带有不同类型的肝炎(乙型肝炎(120)，丙型肝炎(125))的血浆样品的IR光谱。
图36是样品中肝炎(乙型肝炎(◇)，丙型肝炎(□))的预测相比于实际水平的偏最小二乘法回归图。
图37是装载有多种浓度的葡萄糖和尿素并在玻璃纤维上干燥的血液样品的FTIR光谱(100mg/dl(130)；297mg/dl(132)；490mg/dl(134)；679mg/dl(136)；865mg/dl(138)；纯净葡萄糖(140))。
图38是如图33中所示的葡萄糖的结果的偏最小二乘法作图。连续线示出最佳拟合，虚线示出预测的和掺杂的相关性之间的1:1关联。
图39是葡萄糖的标准IR光谱。
图40是如图33中所示的尿素的结果的偏最小二乘法作图。连续线说明最佳拟合，虚线说明预测的和掺杂的相关性之间的1:1关联。
图41是载量值相对于波数的标准IR光谱。
图42是将显示给用户的用于光谱质量控制的典型图形用户界面的实例。
详细描述
本发明将参考下面适合于获得适用于ATR-IR分析的样品的流程实例进一步描述。
1.用于晶体清洁的通用程序
总的来说，使用下列步骤清洁ATR晶体：
a)使用潮湿的软纤维素消除样品。
b)使用软纤维素和水和/或有机溶剂清洁ATR晶体。
c)获得空晶体的光谱以便舍弃任何记忆效应。
d)如果蛋白质难以除去，推荐使用PBS、去污剂或胶束水。
2.用于样品制备的通用程序
2.1全血(WB)取样方法
从患者抽取全血到EDTA管中或直接使用刺血针。
2.1.1湿的WB
湿的全血样品通常按照本发明的方法处理，以使用下列步骤产生与图1中示出的相似的ATR-FTIR光谱：
a)使用空的干净的ATR晶体获得背景。
b)通过测量10微升水的光谱来获得水空白(W)。
c)使用微量移液器获取10微升EB，并将其沉积在ATR晶体的表面上。
d)立即获取全血的原始光谱(RWB)。
e)通过从RWB的i波数的强度中减去W的i波数的强度，获得全血的最终光谱(WBw)。
WBw(i)＝RWB(i)–W(i)
f)按照通用程序清洁晶体。
2.1.2干的WB
干的全血样品通常按照本发明的方法处理，以使用下列步骤产生图1中所示的ATR-FTIR光谱：
a)使用空的干净的ATR晶体获得背景。
b)使用微量移液器获取1至5微升之间的量(所述量取决于应用)，并将其沉积在ATR晶体的表面上。
c)将样品通过不同方法干燥(允许干燥/使用干燥机或热灯)。
d)在干燥后，获取全血的光谱(WBd)。
e)按照上面提出的通用程序清洁晶体。
2.2裂解WB样品方法
以与上述相同的程序获得WB样品，并通过将全血与蒸馏水以1:1(v/v)的比例混合或与7％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)溶液以8:1(v/v)的比例混合，将其裂解。
2.2.1湿的裂解的WB
湿的裂解的全血样品通常按照本发明的方法处理，以使用下列步骤产生图1中所示的ATR-FTIR光谱：
a)使用空的干净的ATR晶体获得背景。
b)取决于在裂解时使用的方法，通过测量10微升水或与蒸馏水以8:1(v/v)的比例混合的7％(w/v)SDS溶液的光谱来获得水空白(W)或7％(w/v)SDS溶液的空白。
c)使用微量移液器获取10微升裂解的WB，并将其沉积在ATR晶体的表面上。立即获取血浆的原始光谱(RL)。
d)通过从RL的i波数的强度中减去W的i波数的强度，获得裂解的全血的最终光谱(Lw)。
Lw(i)＝RL(i)–W(i)
e)按照上面提出的通用程序清洁晶体。
2.2.2干的裂解的WB
干的裂解的全血样品通常按照本发明的方法处理，以使用下列步骤产生图1中所示的ATR-FTIR光谱：
a)使用空的干净的ATR晶体获得背景。
b)使用微量移液器获取1至5(取决于应用)微升裂解的WB，并将其沉积在ATR晶体的表面上。
c)将样品通过不同方法干燥(允许干燥/使用干燥机或热灯)。
d)在干燥后，获取血浆的光谱(Ld)。
e)按照上面提出的通用程序清洁晶体。
2.3血浆(P)样品方法
患者的血浆样品通常如下制备：首先从患者抽取全血到含有乙二胺四乙酸(EDTA)的管中(或者如果要求血清，则到血清管中)或直接使用刺血针。将WB样品以1600g离心10分钟。使用巴氏吸管从上层相获得血浆。
2.3.1湿的血浆
湿的血浆样品通常按照本发明的方法处理，以使用下列步骤产生图1中所示的ATR-FTIR光谱：
a)从空的干净的ATR晶体获得背景。
b)通过测量10微升水的光谱来获得水空白(W)。
c)使用微量移液器获取10微升血浆，并将其沉积在ATR晶体的表面上。立即获取血浆的原始光谱(RP)。
d)通过从RP的i波数的强度中减去W的i波数的强度，获得血浆的最终光谱(Pw)。
Pw(i)＝RP(i)–W(i)
e)按照上面提出的步骤清洁晶体。
2.3.2干的血浆
干的血浆样品通常按照本发明的方法处理，以使用下列步骤产生图1中所示的ATR-FTIR光谱：
a)使用空的干净的ATR晶体获得背景。
b)使用微量移液器获取1至5微升(其量取决于应用)血浆，并将其沉积在ATR晶体的表面上。
c)将样品通过不同方法干燥(允许干燥/使用干燥机或热灯)。
d)在干燥后，获取血浆的光谱(Pd)。
e)按照上面提出的通用程序清洁晶体。
2.4红细胞(RBC)样品方法
患者的RBC样品通过从患者抽取全血到EDTA管中(或者如果需要血清，到血清管中)或直接使用刺血针来获得。将WB样品与1600g离心10分钟。使用巴氏吸管从下层相获得RBC。
2.4.1湿的RBC
湿的RBC样品通常按照本发明的方法处理，以使用下列步骤产生图1中所示的ATR-FTIR光谱：
a)使用空的干净的ATR晶体获得背景。
b)通过测量10微升水的光谱来获得水空白(W)。
c)使用微量移液器获取10微升RBC，并将其沉积在ATR晶体的表面上。立即获取RBC的原始光谱(RRBC)。
d)通过从RP的i波数的强度中减去W的i波数的强度，获得血浆的最终光谱(RBCsw)。
RBCsw(i)＝RRBCs(i)–W(i)
e)按照上面提出的通用程序清洁晶体。
2.4.2干的RBC
干的RBC样品通常按照本发明的方法处理，以使用下列步骤产生图1中所示的ATR-FTIR光谱：
a)使用空的干净的ATR晶体获得背景。
b)使用微量移液器获取1至5(取决于应用)微升RBC，并将其沉积在ATR晶体的表面上。
c)将样品通过不同方法干燥(允许干燥/使用干燥机或热灯)。
d)在干燥后，获取RBC的光谱(RBCsd)。
e)按照上面提出的通用程序清洁晶体。
2.5包装在溶剂中的RBC
溶剂例如甲醇(MeOH)中的RBC样品通常按照本发明的方法处理，以使用下列步骤产生图1中所示的ATR-FTIR光谱：
a)将获得的RBC用PBS(磷酸盐缓冲盐水)清洗以除去血浆/血清组分，然后与1mL冷甲醇0.4:1(v/v)混合。
b)使用微量移液器获取1-5(取决于应用)微升包装在甲醇中的RBC，并将其沉积在ATR晶体的表面上。
c)将样品通过不同方法干燥(允许干燥/使用干燥机或热灯)。
d)在干燥后，获取包装在甲醇中的RBC的光谱(RBCsm)。
e)按照上面提出的通用程序清洁晶体。
2.5凝结的全血在溶剂中的悬液
凝结的全血在溶剂例如甲醇(MeOH)中的悬液通常按照本发明的方法处理，以使用下列步骤产生图1中所示的ATR-FTIR光谱：
a)使用与1.1部分中相同的程序提取WB。
b)使用微量移液器将1-5微升WB沉积在ATR晶体上。
c)将同样量的甲醇沉积在前述的WB液滴上，产生凝结的血液的悬液。
d)将样品通过不同方法干燥(允许干燥/使用干燥机或热灯)。
e)在干燥后，获取干的悬液的光谱。
f)按照上面提出的通用程序清洁晶体。
2.6血清/血浆/血液脂类提取物
在溶剂例如甲醇(MeOH)中的来自于血清或血浆或血液或其组合的脂类提取物通常按照本发明的方法处理，以使用下列步骤产生图2中所示的ATR-FTIR光谱：
a)使用与1.1部分中相同的程序提取WB/血浆/血清。
b)将WB/血浆/血清与有机溶剂混合。如果形成乳液，样品应该离心。
c)使用微量移液器获取1-5微升提取的相，并将其沉积在ATR晶体上。
d)将样品通过不同方法干燥(允许干燥/使用干燥机或热灯)。
e)在干燥后，获取干薄膜的光谱。
f)按照上面的通用程序清洁晶体。
作为病原体的疟疾
疟疾由不同的疟原虫物种引起。不同的疟原虫物种具有不同的分子表型和对应的红外光谱。不同的疟疾致病因子物种被包含在疟疾参比数据库中。为了指定或鉴定不同的疟原虫物种，通常人们将首先使用下述方法鉴定患有疟疾的人，例如如下。
因此，在本发明的在血液样品中检测疟疾的方法的另一个实施方式中，所述方法包括下列步骤：
(i)产生代表所述血液样品的样品红外光谱，所述样品光谱具有一个或多个光谱分量，每个分量具有波数和吸光度值，
(ii)提供光谱模型的参比数据库，每个模型具有波数和吸光度值的一个或多个数据库光谱分量，其中所述数据库光谱分量鉴定疟疾，
(iii)确定所述参比数据库是否具有对应于一个或多个样品光谱分量的一个或多个数据库光谱分量，以及
(iv)编纂鉴定到的对应数据库分量的名单。
在本发明的方法的另一个实施方式中，为了将疟疾的致病因子指定或确定到各种不同的疟原虫物种中，所述方法包括下列步骤：
(i)产生代表所述血液样品的样品红外光谱，所述样品光谱具有一个或多个光谱分量，每个分量具有波数和吸光度值，
(ii)提供光谱模型的参比数据库，每个模型具有波数和吸光度值的一个或多个数据库光谱分量，其中所述数据库光谱分量鉴定不同的疟原虫物种例如(但不限于)恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫curtisi亚种(Plasmodium ovale curtisi)、卵形疟原虫wallikeri亚种(Plasmodium ovalewallikeri)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)或其组合，
(iii)确定所述参比数据库是否具有对应于一个或多个样品光谱分量的一个或多个数据库光谱分量，以及
(iv)编纂鉴定到的对应数据库分量的名单。
实验结果-疟疾
使用上述方法进行的实验测试已显示出光谱与血液中疟疾寄生虫浓度之间的相关性。将装载有不同浓度的寄生虫血症(环状体和营养细胞)的红细胞(RBC)和全血浆样品(WB)在玻璃纤维纸中干燥。装载方式概述在表4中：
图28是装载有表4中列出的疟疾的对照、RP、RNP和TP样品的IR吸收光谱。裸眼不能容易地辨别对照和病理样品的光谱之间的差异。
图29a和29b是以两种不同格式描绘了多变量分析的结果的图，示出了在3116.19至2768.71和1828.46至852.91cm-1区域中样品的多个SPC文件的样品/分值。多变量分析被用于阐明差异或发现隐藏的模式。所选的方法是主成分分析(PCA)，一种将样品投影在方差方向上取向的新坐标中的非监督方法(即它不将类别考虑在内，仅仅使用光谱)。
图30是样品中寄生虫血症的预测相比于实际水平的偏最小二乘法回归图。所述回归分析能够区分高和低的寄生虫载量。注意，所述方法是线性的，并覆盖几个数量级。
进行了进一步的实验测试以观察当在纸上干燥时，RBC上的疟疾营养细胞的IR特征是否维持。将10个RBC样品装载有5％寄生虫血症(营养细胞)并在普通滤纸上干燥。也产生12个正常RBC样品作为对照。
本发明的方法也已被用于检测通过显微术和PCR已知含有恶性疟原虫和/或间日疟原虫的样品。使用FTR的结果证实了所述方法适合于检测由两种疟疾物种引起的感染和混合感染。
实验结果-使用从RBC在玻璃上的薄涂片获得的图像检测疟疾
进行了实验性调查，以调查本发明的方法对于区分感染有5％疟疾营养体的RBC和未感染的血细胞的效能。
在这种情况下，使用焦平面阵列、即玻璃上的薄血液涂片的FP光谱成像。在图像获取后，将样品用Giemsa染料染色以用于营养体的目测检查。
图31示出了在2500至4000cm-1区域中的平均谱图的基础上，染色的细胞的可见光图像(图31a)和未处理细胞的IR图像(图31b)。图31c是两个细胞的直观特写(标为A和B，在图31a中圈出)以及对应的IR图像(图31d)。从这些图像清楚地看出，当寄生虫不存在时光谱的密度更大。PCA分析揭示出三个区域——未感染的RBC区域(112)，疟原虫营养体(113)和对应于感染的RBC的不含营养体的部分的第二个未感染的区域(114)。
疟原虫感染的区域(◇)、第一未感染区域(▲)和第二未感染区域(□)的对应的PCA记录在图32中。95％置信度水平被标记在-4和4处。
图33是变量/载量图。为了更密切检查差异，执行了监督模型PLSDA(无导数)并示出在图34中。示出了LV 1分量(连续线)和Y1的Reg向量(虚线)。尽管回归向量噪音相当大，但在3300cm-1的带处存在迁移，其可以区分感染和未感染的像素。
在上述结果的基础上，可以提出下述用于在玻璃上的未处理RBC薄膜中鉴定寄生虫血症的方法：
(i)产生血液薄膜，
(ii)执行显微镜目测分析并产生视觉图像，
(iii)产生FTIR图像，
(iv)(a)对图像的每个像素进行建模，以便将它们分类为寄生虫或RBC，
(iv)(b)提取平均每个RBC的像素的RBC平均光谱，并调查每个RBC是否被感染。
实验结果-肝炎
使用上述方法进行的实验测试已经显示，可以区分带有不同肝炎类型的血浆样品。
对于每个样品，将约3微升带有乙型肝炎(HB)和丙型肝炎(HC)的血浆置于预先切割的玻璃滤纸上并空气干燥20分钟。然后将带有干燥血浆样品的玻璃纸置于钻石ATR-FTIR窗的晶体上，并使用针对空气的背景光谱叠加和比例调整的50次扫描在8cm-1处记录光谱。得到的光谱示出在图35中。
图36是样品中肝炎的预测相比于实际水平的偏最小二乘法回归图。对于样品来说，在1583.18至1492.13cm-1和1304.45至1120.49cm-1的区域中进行数据分析。所述回归分析能够区分高和低的寄生虫载量以及HB和HC感染。
实验结果-葡萄糖和尿素
前面的实验结果说明了与被以寄生虫血症形式存在于血液中的病原体直接吸收的IR能量相关的光谱效应。使用本发明的方法进行的实验测试还显示，可以通过由病原体引起的其他生物实体所吸收的能量间接地检测病原体。例如，病原体可能引起葡萄糖、尿素或两者升高。
将血液样品装载有宽范围浓度的葡萄糖和尿素，并在玻璃纤维上干燥。图37示出了所述样品的FTIR光谱，并说明葡萄糖的吸光度与样品中葡萄糖的浓度成正比。
图38提供了所述结果的偏最小二乘法作图。然后将回归向量与如图39中所示的葡萄糖标准光谱相关联。
对尿素使用相似的方法。图40提供了结果的偏最小二乘法作图。然后将回归向量与如图41中所示的尿素标准光谱相关联。
实验结果-质量控制
在包含在上面提到的模型之一中之前，可以进行光谱的验证。这确保了获得的光谱具有与模型中包含的特点相似的特点。它也确保了技术问题不将干扰从模型提取信息。例如，开发了下述两种质量控制方法。
质量控制–不依赖于模型的
第一种方法依靠不依赖于模型、即仅依赖于数据库的质量控制。所述质量控制聚焦于尝试监测不同组分的过量(或缺乏)和与样品相关的干扰。使用算法计算组分的相对浓度，并将该浓度与阈值进行比较。例如，可以在数据库上产生组分的相对浓度值的分布。然后将所述分布在顶端和低端逐渐减少的部分用于定义所述阈值。如果组分的相对浓度在所述阈值外部，则所述光谱未通过质量控制。
通常，在这种质量控制方法中顺序考虑下述三种组分：
(i)气氛干扰：在背景与样品测量之间IR活性的环境水蒸气的波动可能引起阴性和阳性带，其通过使用阳性和阴性阈值来检测；
(ii)溶剂：溶剂(水、MeOH)尚未被适合地消除；以及
(iii)样品：在晶体上不存在足够的样品，例如由于不良的接触。
质量控制–依赖于模型的
第二种质量控制方法与模型相关，并依靠就建模而言样品与校准样品之间的距离的测量。典型的实例是使用PLSDA上的T2和SQ残差和95％置信区间。
例如，可以按顺序进行记录到的光谱的质量控制：(i)气氛干扰(水)，(ii)溶剂(甲醇)，(iii)样品，以及最后(iv)距模型的距离。通常这将与结果例如表5中的结果相关：
表5：
显示给用户的典型图形用户界面的实例描绘在图42中。
尽管已结合特定实施方式对本发明进行了描述，但应该理解，它能够进一步修改。本申请旨在覆盖总体遵循本发明的原理的本发明的任何变化的使用或改编，并包括落于本发明所属领域内的已知或惯常做法之内并可以应用于上文中阐述的基本特点的与本公开的背离。
由于本发明可以以不背离本发明的基本特征的精神的几种形式体现，因此应该理解，除非另有规定，否则上述实施方式不限制本发明，而是应该在随附的权利要求书中所定义的本发明的精神和范围之内宽泛地解释。在所有情况下，所描述的实施方式应该被当作是仅仅说明性而不是限制性的。
各种不同的修改和等同的排布方式打算被包含在本发明和随附的权利要求书的精神和范围之内。因此，特定实施方式应该被理解为说明了实践本发明的原理可以采取的许多方式。在权利要求书中，手段加功能条款旨在覆盖执行确定功能的结构，并且不仅是结构等同物，而且是等同结构。
应该指出，除非上下文另有要求，否则当在本文中使用术语“服务器”、“安控服务器”或类似术语时，描述了可用于通讯系统的通讯装置，并且不应被解释为将本发明限制到任何特定的通讯装置类型。因此，通讯装置可以包括但不限于桥接器、路由器、桥接-路由器(路由器)、交换机、节点或其他通讯装置，其可以是安控也可以不是安控的。
还应该指出，当流程图在本文中被用于演示本发明的各种不同情况时，它不应被解释为将本发明限制到任何特定的逻辑流或逻辑实现。所描述的逻辑可以被分配到不同的逻辑块(例如程序、模块、函数或子程序)中，而不改变总体结果或以其他方式背离本发明的真实范围。通常，逻辑要素可以被添加、修改、省略、以不同次序执行或使用不同的逻辑构建物(例如逻辑门、循环原语、条件逻辑和其他逻辑构建物)执行，而不改变总体结果或以其他方式背离本发明的真实范围。
本发明的各种不同实施方式可以以许多不同形式体现，包括与处理器(例如微处理器、微控制器、数字信号处理器或通用目的计算机，并且就此而言，任何商用处理器都可以作为系统中的单一处理器、串联或并联的一组处理器，用于执行本发明的实施方式，并且就其本身而言，商用处理器的实例包括但不限于MercedTM、PentiumTM、Pentium IITM、XeonTM、CeleronTM、Pentium ProTM、EfficeonTM、AthlonTM、AMDTM等)一起使用的计算机程序逻辑，与可编程逻辑装置(例如现场可编程门阵列(FPGA)或其他PLD)一起使用的可编程逻辑，分立组件，集成电路(例如专用集成电路(ASIC))或任何其他手段，包括其任何组合。在本发明的示例性实施方式中，用户与服务器之间的几乎所有通讯作为一组计算机程序指令来执行，其被转变成计算机可执行形式，像这样储存在计算机可读介质中，并由微处理器在操作系统的控制下执行。
执行本文中描述的所有或部分功能的计算机程序逻辑可以以各种不同方式体现，包括源代码形式、计算机可执行形式和各种不同的中间形式(例如由汇编器、编译器、链接器或定位器产生的形式)。源代码可以包括与各种不同的操作系统或操作环境一起使用的一系列计算机程序指令，其以各种不同的编程语言中的任一种来实现(例如目标代码、汇编语言或高级语言例如Fortran、C、C++、JAVA或HTML。此外，存在数百种可用于执行本发明的实施方式的可用计算机语言，其中比较常用的是Ada、Algol、APL、awk、Basic、C、C++、Conol、Delphi、Eiffel、Euphoria、Forth、Fortran、HTML、Icon、Java、Javascript、Lisp、Logo、Mathematica、MatLab、Miranda、Modula-2、Oberon、Pascal、Perl、PL/I、Prolog、Python、Rexx、SAS、Scheme、sed、Simula、Smalltalk、Snobol、SQL、Visual Basic、Visual C++、Linux和XML)。所述源代码可以定义并使用各种不同的数据结构和通讯消息。所述源代码可以采取计算机可执行形式(例如通过解释器)，或者所述源代码可以被转变(例如通过翻译器、汇编器或编译器)成计算机可执行形式。
所述计算机程序可以以任何形式(例如源代码形式、计算机可执行形式或中间形式)永久或暂时安装在有形存储介质中，例如半导体存储装置(例如RAM、ROM、PROM、EEPROM或快速可编程RAM)、磁存储装置(例如磁盘或硬盘)、光存储装置(例如CD-ROM或DVD-ROM)、PC卡(例如PCMCIA卡)或其他存储装置。所述计算机程序可以以任何形式安装成可以使用各种通讯技术中的任一种传输到计算机的信号，所述通讯技术包括但不限于模拟技术、数字技术、光学技术、无线技术(例如蓝牙)、网络技术和互联网络技术。所述计算机程序可以以任何形式分发，例如具有随附的印刷或电子文件的可移除存储介质(例如压缩打包软件)，与计算机系统一起预装(例如在系统ROM或硬盘上)，或在通讯系统(例如因特网或万维网)上从服务器或电子公告板分发。
执行本文描述的所有或部分功能的硬件逻辑(包括与可编程逻辑装置一起使用的可编程逻辑)可以使用传统的手动方法来设计，或者可以使用各种不同工具而电子化设计、捕获、模仿或记录，所述工具例如计算机辅助设计(CAD)、硬件描述语言(例如VHDL或AHDL)或PLD编程语言(例如PALASM、ABEL或CUPL)。也可以将硬件逻辑合并到用于执行本发明的实施方式的显示屏中，并且所述显示屏可以是分段显示屏、模拟显示屏、数字显示屏、CRT、LED屏、等离子屏、液晶二极管屏等。
可编程逻辑可以永久或暂时安装在有形存储介质中，例如半导体存储装置(例如RAM、ROM、PROM、EEPROM或快速可编程RAM)、磁存储装置(例如磁盘或硬盘)、光存储装置(例如CD-ROM或DVD-ROM)或其他存储装置。可编程逻辑可以安装成可以使用各种通讯技术中的任一种传输到计算机的信号，所述通讯技术包括但绝不限于模拟技术、数字技术、光学技术、无线技术(例如蓝牙)、网络技术和互联网络技术。所述可编程逻辑可以作为具有随附的印刷或电子文件的可移除存储介质(例如压缩打包软件)、与计算机系统一起预装(例如在系统ROM或硬盘上)分发，或在通讯系统(例如因特网或万维网)上从服务器或电子公告板分发。
当在本说明书中使用时，采用“包含”和“包括”来指定所陈述的特点、整数、步骤或组分的存在，但不排除一个或多个或一组其他特点、整数、步骤、组分的存在或增添。因此，除非上下文另有明确要求，否则短语“包含”、“包括”等应该以与排除性或穷举性意义相反的包含性意义解释，也就是说，在“包括但不限于”的意义上。

Claims (20)

1.一种在血液样品中检测病原体的方法，所述方法包括下列步骤：
(i)产生代表所述血液样品的样品红外光谱，所述样品光谱具有一个或多个光谱分量，每个分量具有波数和吸光度值，
(ii)提供光谱模型的参比数据库，每个模型具有波数和吸光度值的一个或多个数据库光谱分量，其中所述数据库光谱分量鉴定病原体，
(iii)确定所述参比数据库是否具有对应于一个或多个样品光谱分量的一个或多个数据库光谱分量，以及
(iv)编纂鉴定到的对应数据库分量的名单。
2.权利要求1的方法，其中步骤(ii)还包括选择一个或多个光谱窗口以在其中进行步骤(iii)。
3.权利要求1的方法，其还包括下述步骤：
(iv)确定编纂的每个相应光谱模型中样品分量的数目，并对所述编纂的光谱模型进行排序。
4.权利要求1的方法，其还包括下述步骤：
(iv)确定编纂的每个相应光谱模型中样品分量的数目，并在预先确定的分类标准的基础上对所述编纂的光谱模型进行分类。
5.权利要求1的方法，其中所述病原体选自血液传播的病毒性疾病。
6.权利要求1的方法，其中所述病原体选自人免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、砂粒病毒科(Arenaviridae)的病毒(包括拉沙热、胡宁和马丘波)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)的病毒(包括克里米亚-刚果出血热、里夫特裂谷热、汉坦出血热)、丝状病毒科(Filoviridae)的病毒(埃博拉和马尔堡)和黄病毒科(Flaviviridae)的病毒(黄热病、登革热、鄂木斯克出血热、凯萨努森林病、西尼罗病毒)、甲病毒科(Alphaviridae)的病毒或载体、巴贝西虫分歧巴贝西虫(Babesia B.divergens)、双芽巴贝西虫(B.bigemina)、马巴贝西虫(B.equi)、微小巴贝西虫(B.microfti)、B.duncani、利什曼原虫刚地弓形虫(Leishmania Toxoplasma gondii)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫curtisi亚种(Plasmodium ovale curtisi)、卵形疟原虫wallikeri亚种(Plasmodium ovale wallikeri)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)和克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)。
7.权利要求1的方法，其中所述数据库光谱分量鉴定选自甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎或其组合的特定肝炎病毒。
8.权利要求1的方法，其中代表所述血液样品的红外光谱从所述血液样品的厚膜产生。
9.权利要求1的方法，其中代表所述血液样品的红外光谱从单滴血液产生。
10.权利要求9的方法，其中代表所述血液样品的红外光谱从体积在5μl至50μl之间、更优选地在5μl至25μl之间的单滴血液产生。
11.一种在血液样品中检测疟疾的方法，所述方法包括下列步骤：
(i)产生代表所述血液样品的样品红外光谱，所述样品光谱具有一个或多个光谱分量，每个分量具有波数和吸光度值，
(ii)提供光谱模型的参比数据库，每个模型具有波数和吸光度值的一个或多个数据库光谱分量，其中所述数据库光谱分量鉴定疟疾，
(iii)确定所述参比数据库是否具有对应于一个或多个样品光谱分量的一个或多个数据库光谱分量，以及
(iv)编纂鉴定到的对应数据库分量的名单。
12.权利要求11的方法，其中代表所述血液样品的红外光谱从所述血液样品的厚膜产生。
13.权利要求11的方法，其中代表所述血液样品的红外光谱从单滴血液产生。
14.权利要求13的方法，其中代表所述血液样品的红外光谱从体积在5μl至50μl之间、更优选地在5μl至25μl之间的单滴血液产生。
15.权利要求11的方法，其中所述数据库光谱分量鉴定疟疾的特定阶段。
16.权利要求11的方法，其中所述数据库光谱分量鉴定一个或多个疟原虫物种。
17.权利要求16的方法，其中所述数据库光谱分量鉴定选自如下的一个或多个疟原虫物种：恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫curtisi亚种、卵形疟原虫wallikeri亚种、三日疟原虫、诺氏疟原虫或其组合。
18.一种计算机可读存储介质，其用于以非瞬时形式储存用于执行在血液样品中检测病原体的方法的应用程序，所述方法包括下述步骤：
(i)记录代表所述血液样品的IR光谱，
(ii)将所述光谱与光谱模型的参比数据库进行比较，以鉴定所述血液样品的波数和吸光度的一个或多个光谱分量，其中所述光谱分量鉴定病原体，以及
(iii)编纂鉴定到的对应于所述数据库的相应光谱模型的样品分量的名单，
其中步骤(i)至(iii)是自动的。
19.一种用于在血液样品中检测病原体的系统，所述系统包含用于捕获IR光谱的光谱仪和计算机，其中
(i)所述光谱仪产生代表所述血液样品的IR光谱，
(ii)所述计算机将所述光谱应用于光谱模型的参比数据库，以鉴定所述血液样品的波数和吸光度的一个或多个光谱分量，其中所述光谱分量鉴定病原体，并且
(iii)所述计算机编纂鉴定到的对应于所述数据库的相应光谱模型的样品分量的名单。
20.一种适用于能够在血液样品中检测病原体的应用程序，所述应用程序包含预先确定的指令集，所述指令集适用于能够进行包含下述步骤的方法：
(i)产生代表所述血液样品的样品红外光谱，所述样品光谱具有一个或多个光谱分量，每个分量具有波数和吸光度值，
(ii)提供光谱模型的参比数据库，每个模型具有波数和吸光度值的一个或多个数据库光谱分量，其中所述数据库光谱分量鉴定病原体，
(iii)确定所述参比数据库是否具有对应于一个或多个样品光谱分量的一个或多个数据库光谱分量，以及
(iv)编纂鉴定到的对应数据库分量的名单。
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