CN110819735A - 鉴定犬细小病毒的成套试剂和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鉴定犬细小病毒的成套试剂和试剂盒。本发明公开的鉴定犬细小病毒的成套试剂，由名称分别为CPV‑F3、CPV‑B3、CPV‑FIP、CPV‑BIP、CPV‑FLP和CPV‑BLP的六条单链DNA组成；所述CPV‑F3、所述CPV‑B3、所述CPV‑FIP、所述CPV‑BIP、所述CPV‑FLP和所述CPV‑BLP的序列分别为序列表中序列1‑6。实验证明，利用本发明的鉴定犬细小病毒的成套试剂鉴定犬细小病毒方便快速，特异性好，灵敏度高。

Description

鉴定犬细小病毒的成套试剂和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，鉴定犬细小病毒的成套试剂和试剂盒。
背景技术
犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)属于细小病毒科，最早于1978分离自患肠炎的犬类粪便中；CPV感染会引起犬细小病毒肠炎，是全球范围流行的犬类烈性传染病之一。其病程短、传染性强、死亡率高的特征对犬类危害很大，需要有快速准确的诊断方法，以便及时治疗。
CPV的快速检测主要有基于血清蛋白的免疫性检测和针对病毒DNA的基因检测。基因检测包括常规PCR扩增和荧光定量PCR检测。
LAMP扩增是日本的Notomi等人发明的一种恒温扩增方法，其特点是降低了对仪器的要求，只需要一个水浴锅等恒温设施即可反应。不过常规的LAMP扩增还是需要专门的检测设备，不便于现场检测需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定犬细小病毒。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种成套试剂，所述成套试剂由名称分别为CPV-F3、CPV-B3、CPV-FIP、CPV-BIP、CPV-FLP和CPV-BLP的六条单链DNA组成；所述CPV-F3、所述CPV-B3、所述CPV-FIP、所述CPV-BIP、所述CPV-FLP和所述CPV-BLP的序列分别为序列表中序列1-6。
所述成套试剂具备如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)的用途：
(b1)鉴定或辅助鉴定犬细小病毒；
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的试剂盒；
(b3)检测或辅助检测待测样本是否含有犬细小病毒；
(b4)制备用于检测或辅助检测待测样本是否含有犬细小病毒的试剂盒。
所述成套试剂中，所述CPV-F3、所述CPV-B3、所述CPV-FIP、所述CPV-BIP、所述CPV-FLP和所述CPV-BLP的摩尔比可为1:1:8:8:2:2。
所述成套试剂中，所述CPV-F3、所述CPV-B3、所述CPV-FIP、所述CPV-BIP、所述CPV-FLP和所述CPV-BLP
本发明还提供了鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的系统，所述系统含有所述成套试剂和M；所述M为链置换型DNA聚合酶和/或进行环介导等温扩增所需要的其它试剂。
所述链置换型DNA聚合酶可为Bst DNA聚合酶。所述可为Bst2.0 DNA聚合酶，如NEB公司的Bst2.0 DNA聚合酶。所述进行环介导等温扩增所需要的其它试剂可为10mM(NH4)2SO4(美国Amresco公司)、50mM KCl(美国Amresco公司)、8mM MgSO4(北京美莱博医学科技有限公司)、50uM中性红(美国Sigma公司)、0.1％
Figure BDA0001762987500000021
20(美国Amresco公司)、0.5M甜菜碱(美国Sigma公司)和/或1.4mM dNTPs(北京美莱博医学科技有限公司)。
所述系统可为环介导等温扩增试剂或试剂盒。所述系统可由所述成套试剂与所述M组成。
所述系统还可含有利用环介导等温扩增鉴定或辅助鉴定犬细小病毒所需的仪器。所述系统可由所述成套试剂、所述M与利用环介导等温扩增鉴定或辅助鉴定犬细小病毒所需的仪器组成。
本发明还提供了所述成套试剂的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：
(b1)鉴定或辅助鉴定犬细小病毒；
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的试剂盒；
(b3)检测或辅助检测待测样本是否含有犬细小病毒；
(b4)制备用于检测或辅助检测待测样本是否含有犬细小病毒的试剂盒。
本发明还提供了所述系统的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：
(b1)鉴定或辅助鉴定犬细小病毒；
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的试剂盒；
(b3)检测或辅助检测待测样本是否含有犬细小病毒；
(b4)制备用于检测或辅助检测待测样本是否含有犬细小病毒的试剂盒。
本发明中，利用所述成套试剂鉴定犬细小病毒的方法可包括：以待测样品为模板，利用所述成套试剂进行LAMP反应，如反应体系的颜色与反应前相比发生变化(如由淡黄色变为紫红色)，则发生了LAMP反应，所述待测样品中含有或候选含有犬细小病毒或为或候选为犬细小病毒；如反应体系的颜色与反应前相比无变化(如仍为淡黄色)，则未发生LAMP反应，所述待测样品中不含有或候选不含有犬细小病毒或不为或候选不为犬细小病毒。
所述LAMP反应的温度可为60-67℃，如65℃，所述环介导等温扩增的反应时间可为30-60分钟，如40分钟。
所述LAMP反应的体系中所述CPV-F3、所述CPV-B3、所述CPV-FIP、所述CPV-BIP、所述CPV-FLP和所述CPV-BLP的浓度分别可为0.2μM、0.2μM、1.6μM、1.6μM、0.4μM和0.4μM。
所述LAMP反应的体系具体可为：待测样本DNA 2μl，10mM(NH4)2SO4(美国Amresco公司)、50mM KCl(美国Amresco公司)、8mM MgSO4(北京美莱博医学科技有限公司)、50uM中性红(美国Sigma公司)、0.1％
Figure BDA0001762987500000031
20(美国Amresco公司)、0.5M甜菜碱(美国Sigma公司)、1.4mM dNTPs(北京美莱博医学科技有限公司)，实施例1的CPV-F3、CPV-B3、CPV-FIP、CPV-BIP、CPV-FLP和CPV-BLP，Bst2.0 DNA聚合酶(NEB公司)0.4U/μl，无菌水补足25μl。
本文建立了一种pH敏感指示剂中性红检测犬细小病毒LAMP扩增方法，不需要任何检测仪器，肉眼即可阳性扩增和阴性反应；阴性反应保持初始的淡黄色，阳性扩增反应液则会变为紫红色。使用本方法，只需要一个小恒温水浴或者金属浴，40min即可完成LAMP扩增和检测，非常方便现场快速病毒检测，并且还可检测到10拷贝的犬细小病毒，操作简单，携带方便，灵敏度高，特异性好。
附图说明
图1为特异性实验结果。其中，1、2、3为犬细小病毒DNA体系；4、5、6为金黄色葡萄球菌DNA体系；7、8、9为志贺氏菌DNA体系；10、11、12为坂崎肠杆菌DNA体系；13、14、15为单增李斯特菌DNA体系；16、17、18为大肠杆菌DNA体系；19、20、21为加水的阴性对照体系。
图2为灵敏度实验结果。其中，10E3、10E2、10E1、空白分别表示1×103、1×102、1×101拷贝/μl的pUC-CPV稀释液以及阴性对照的LAMP反应体系。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的试验，均设置三次重复实验。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
实施例1、鉴定犬细小病毒的成套试剂的制备
本实施例提供的鉴定犬细小病毒的成套试剂由名称分别为CPV-F3、CPV-B3、CPV-FIP、CPV-BIP、CPV-FLP和CPV-BLP的六条单链DNA组成，各单链DNA的序列如下：
CPV-F3：5’-TGGGATAAAGAATTTGATACTGA-3’(序列表中序列1)；
CPV-B3：5’-TGAGAGGCTCTTAGTTTAGCTTT-3’(序列表中序列2)；
CPV-FIP：5’-CGCAACTTTTACAAATAATTGACCATTAAAACCAAGACTTCATGTAAATGC-3’(序列表中序列3)；
CPV-BIP：5’-AACAAATGAATATGATCCTGATGCAACCTTTCCACCAAAAATCTGAGT-3’(序列表中序列4)；
CPV-FLP：5’-GGACAATTATTTTGACAAACAAATGG-3’(序列表中序列5)；
CPV-BLP：5’-TCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAAC-3’(序列表中序列6)。
该成套试剂中，CPV-F3、CPV-B3、CPV-FIP、CPV-BIP、CPV-FLP和CPV-BLP各自独立包装，CPV-F3、CPV-B3、CPV-FIP、CPV-BIP、CPV-FLP和CPV-BLP的摩尔比为1:1:8:8:2:2。
实施例2、犬细小病毒鉴定方法的建立
25μL的犬细小病毒鉴定的反应体系中含有：犬细小病毒基因组DNA 2μl，10mM(NH4)2SO4(美国Amresco公司)、50mM KCl(美国Amresco公司)、8mM MgSO4(北京美莱博医学科技有限公司)、50uM中性红(美国Sigma公司)、0.1％20(美国Amresco公司)、0.5M甜菜碱(美国Sigma公司)、1.4mM dNTPs(北京美莱博医学科技有限公司)，实施例1的CPV-F3、CPV-B3、CPV-FIP、CPV-BIP、CPV-FLP和CPV-BLP，Bst2.0 DNA聚合酶(NEB公司)0.4U/μl，无菌水补足25μl。CPV-F3、CPV-B3、CPV-FIP、CPV-BIP、CPV-FLP和CPV-BLP在该体系中的浓度分别为0.2μM、0.2μM、1.6μM、1.6μM、0.4μM和0.4μM。
将上述犬细小病毒鉴定的反应体系分别在65℃下孵育40min，进行LAMP。根据体系的颜色变化情况确定待测样品中是否含有犬细小病毒或是否为犬细小病毒：如体系的颜色与反应前相比发生变化(即由淡黄色变为紫红色)，则发生了LAMP反应，待测样品中含有犬细小病毒或为犬细小病毒；如体系的颜色与反应前相比无变化(即仍为淡黄色)，则未发生LAMP反应，待测样品中不含有犬细小病毒或不为犬细小病毒。
实施例3、鉴定犬细小病毒的成套试剂的特异性
分别用浓度均为80ng/μl的犬细小病毒DNA、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)DNA、志贺氏菌(痢疾志贺菌ATCC 51252)DNA、坂崎肠杆菌(ATCC 51329)DNA、单增李斯特菌(ATCC19114)DNA、大肠杆菌(ATCC 25922)DNA(浙江省质量检测科学研究院提供)为模板进行LAMP反应，按照实施例2的反应体系及反应条件进行LAMP，并进行实时监测。每个菌株三个重复。用无菌水替换模板设置阴性对照。
其中，犬细小病毒记载在“赵国星等，犬细小病毒抗体间接ELISA检测方法的建立，中国兽医学报，2014年9月，第34卷，第9期”一文中；
金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、志贺氏菌(痢疾志贺菌ATCC 51252)、坂崎肠杆菌(ATCC 51329)、单增李斯特菌(ATCC 19114)、大肠杆菌(ATCC 25922)均记载在“姜侃等，三重LAMP法检测食品中沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌，食品科学，2013,Vol.34,No.24”一文中。
结果如图1所示，犬细小病毒的反应体系发生了LAMP反应，其他DNA的反应体系以及阴性对照均未发生LAMP反应；表明实施例1的鉴定犬细小病毒的成套试剂具有较高的特异性，可以特异性地检测到犬细小病毒。
实施例4、鉴定犬细小病毒的成套试剂的灵敏性
所用样品为犬细小病毒质粒pUC-CPV，该质粒为将序列表中序列7所示的DNA片段插入pGH(上海捷瑞生物工程有限公司)的多克隆位点得到的重组质粒。
将上述pUC-CPV进行定量，然后以10倍梯度进行稀释，得到浓度分别为1×103、1×102、1×101拷贝/μl的pUC-CPV稀释液。
分别以上述各pUC-CPV稀释液为模板进行LAMP，按照实施例2的反应体系和反应条件分别取2μlpUC-CPV稀释液制备LAMP反应体系并进行反应。结果如图2所示。用无菌水替换模板设置阴性对照。
结果显示(图2)，1×103、1×102、1×101拷贝/μl的pUC-CPV稀释液的LAMP反应体系中均发生了LAMP反应，阴性对照中未发生LAMP反应，表明利用鉴定犬细小病毒的成套试剂可以检测到1×101拷贝的犬细小病毒。
对比例、其他成套试剂的实验
利用其他五个检测犬细小病毒的成套试剂分别按照实施例3和4中的方法确定其特异性和灵敏度，所用五个成套试剂如下：
成套试剂1：
F3-1：5’-GTCAAAATAATTGTCCTGGTCA-3’；
B3-1：5’-ACTTGGTACATAGTTAAATTGGT-3’；
FIP-1：5’-ACATATTAGCAGATGCATCAGGATCATTATTTGTAAAAGTTGCGCCTA-3’；
BIP-1：5’-ACTCAGATTTTTGGTGGAAAGGTAACTCATTTGTTGAATTGGATTCC-3’；
CPV-FLP：5’-GGACAATTATTTTGACAAACAAATGG-3’；
CPV-BLP：5’-TCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAAC-3’。
成套试剂2：
F3-2：5’-GGGATAAAGAATTTGATACTGACTT-3’；
B3-2：5’-AGAGGCTCTTAGTTTAGCTTTA-3’；
FIP-2：5’-AGGCGCAACTTTTACAAATAATTGAAAGACTTCATGTAAATGCACCA-3’；
BIP-2：5’-ATGAATATGATCCTGATGCATCTGCCTTTCCACCAAAAATCTGAGT-3’；
CPV-FLP：5’-GGACAATTATTTTGACAAACAAATGG-3’；
CPV-BLP：5’-TCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAAC-3’。
成套试剂3：
F3-3：5’-CCAAATGGTCAAATTTGGGATA-3’；
B3-3：5’-AGAGGCTCTTAGTTTAGCTTTA-3’；
FIP-3：5’-AGGCGCAACTTTTACAAATAATTGATGACTTAAAACCAAGACTTCATG-3’；
BIP-3：5’-ATGAATATGATCCTGATGCATCTGCCTTTCCACCAAAAATCTGAGT-3’；
CPV-FLP：5’-GGACAATTATTTTGACAAACAAATGG-3’；
CPV-BLP：5’-TCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAAC-3’。
成套试剂4：
F3-4：5’-CCAGTTTATCCAAATGGTCAA-3’；
B3-4：5’-TCTGAGTAAGTTACAATTCTTGAC-3’；
FIP-4：5’-TGACAAACAAATGGTGCATTTACATTTGGGATAAAGAATTTGATACTGAC-3’；
BIP-4：5’-TCAATTATTTGTAAAAGTTGCGCCT-TATTAGCAGATGCATCAGGATC-3’；
CPV-FLP：5’-GGACAATTATTTTGACAAACAAATGG-3’；
CPV-BLP：5’-TCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAAC-3’。
成套试剂5：
F3-5：5’-GCATTAAATAATGTACCACCAGTT-3’；
B3-5：5’-CTTTCCACCAAAAATCTGAGT-3’；
FIP-5：5’-GTGCATTTACATGAAGTCTTGGTTT-TCCAAATGGTCAAATTTGGGA-3’；
BIP-5：5’-TCAATTATTTGTAAAAGTTGCGCCT-TATTAGCAGATGCATCAGGATC-3’；
CPV-FLP：5’-GGACAATTATTTTGACAAACAAATGG-3’；
CPV-BLP：5’-TCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAAC-3’。
结果显示，这五个成套试剂的特异性与灵敏度不如实施例1的成套试剂，存在扩增非特异、扩增效率不高、甚至没有扩增信号等问题。
<110> 北京美莱博医学科技有限公司
<120> 鉴定犬细小病毒的成套试剂和试剂盒
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgggataaag aatttgatac tga 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgagaggctc ttagtttagc ttt 23
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcaactttt acaaataatt gaccattaaa accaagactt catgtaaatg c 51
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aacaaatgaa tatgatcctg atgcaacctt tccaccaaaa atctgagt 48
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggacaattat tttgacaaac aaatgg 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tctgctaata tgtcaagaat tgtaac 26
<210> 7
<211> 433
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caggaattaa ctatactaat atatttaata cttatggtcc tttaactgca ttaaataatg 60
taccaccagt ttatccaaat ggtcaaattt gggataaaga atttgatact gacttaaaac 120
caagacttca tgtaaatgca ccatttgttt gtcaaaataa ttgtcctggt caattatttg 180
taaaagttgc gcctaattta acaaatgaat atgatcctga tgcatctgct aatatgtcaa 240
gaattgtaac ttactcagat ttttggtgga aaggtaaatt agtatttaaa gctaaactaa 300
gagcctctca tacttggaat ccaattcaac aaatgagtat taatgtagat aaccaattta 360
actatgtacc aagtaatatt ggaggtatga aaattgtata tgaaaaatct caactagcac 420
ctagaaaatt ata 433

Claims (9)

1.成套试剂，由名称分别为CPV-F3、CPV-B3、CPV-FIP、CPV-BIP、CPV-FLP和CPV-BLP的六条单链DNA组成；所述CPV-F3、所述CPV-B3、所述CPV-FIP、所述CPV-BIP、所述CPV-FLP和所述CPV-BLP的序列分别为序列表中序列1-6。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂具备如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)的用途：
(b1)鉴定或辅助鉴定犬细小病毒；
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的试剂盒；
(b3)检测或辅助检测待测样本是否含有犬细小病毒；
(b4)制备用于检测或辅助检测待测样本是否含有犬细小病毒的试剂盒。
3.根据权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：所述CPV-F3、所述CPV-B3、所述CPV-FIP、所述CPV-BIP、所述CPV-FLP和所述CPV-BLP的摩尔比为1:1:8:8:2:2。
4.鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的系统，含有权利要求1-3中任一所述成套试剂和M；所述M为链置换型DNA聚合酶和/或进行环介导等温扩增所需要的其它试剂。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于：所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
6.根据权利要求4或5所述的系统，其特征在于：所述系统为环介导等温扩增试剂或试剂盒。
7.根据权利要求4-6中任一所述的系统，其特征在于：所述系统还含有利用环介导等温扩增鉴定或辅助鉴定犬细小病毒所需的仪器。
8.权利要求1-3中任一所述成套试剂的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：
(b1)鉴定或辅助鉴定犬细小病毒；
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的试剂盒；
(b3)检测或辅助检测待测样本是否含有犬细小病毒；
(b4)制备用于检测或辅助检测待测样本是否含有犬细小病毒的试剂盒。
9.权利要求4-7中任一所述系统的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：
(b1)鉴定或辅助鉴定犬细小病毒；
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的试剂盒；
(b3)检测或辅助检测待测样本是否含有犬细小病毒；
(b4)制备用于检测或辅助检测待测样本是否含有犬细小病毒的试剂盒。
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