CN102382905A - 一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法 - Google Patents
一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，利用PRRSV、PCV2和CSFV3种病毒核酸设计3对特异性探针，利用PCR制备探针标记的报告基因，然后再通过报告基因的环化和反向PCR扩增，实现对3种病毒的环介导间接PCR检测。本发明针对3种病毒设计3对特异性探针，标记相同的报告基因，设计1对反向PCR扩增引物，建立环介导间接PCR检测体系，可同时检测病料组织中PRRSV、PCV2和CSFV3种病原，旨在为科学防控猪病提供一定参考。通过临床试验表，本发明具有检测背景单一，灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，既可用于单病毒检测，又可用于多病毒同时检测，为PRRSV、PCV2和CSFV3种病毒临床诊断及流行病学调查提供了一种工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种环介导间接PCR检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法，属于生物医药体外分子诊断技术。
技术背景
我国是养猪大国，养殖规模化、集约化程度不断提高，以病毒性传染病为首的猪病是目前影响养猪效益的主要因素之一，给养猪业造成了极大危害，尤以高致病性PRRSV引起的猪高热病为主。在引起猪高热症状的众多病毒因子中PRRSV扮演重要角色，是主要病原，其次为PCV2，再次为CSFV等。近年来，PRRSV在我国猪群中感染已极为普遍，并常因感染猪的免疫抑制，导致其它病原体的混合感染；PCV2感染无明显的临床症状，但可破坏免疫系统，造成免疫抑制，易继发并发其它病原体感染，尤其是和PRRSV的混合感染，使患病猪的致死率显著上升；由于PRRSV或PCV2感染猪的免疫抑制，促使了猪瘟的进一步流行，猪瘟的发病率和死亡率都有所回升。随着PRRSV、PCV2和CSFV等病毒因子在大范围内长期流行，病毒变异，毒力增强，一种和两种以上病原的混合感染，导致猪高热疾病仍将呈高发态势，如何防控仍将是未来很长时间内我国养猪业必须面临的实际问题。这3种病毒是引起猪“高热病”的主要病原，目前针对这3种病毒的实验室检测多采用剖检观察病理组织变化，再综合临床症状进行初步判断，对于多病毒混合感染的猪“高热病”，则很难通过剖检鉴别不同病原，而血清学检测如中和试验、ELISA和胶体金试纸等检测技术，普遍存在灵敏度和特异性低，不利于流行病监测和疾病管理。PCR技术是一种高度特异性和敏感性的分子诊断技术，广泛应用于上述3种病原的检测。常规PCR是利用1对特异性引物检测1种病原，对于多病原的混合感染需要多次PCR检测，检测时间长、成本高；在常规PCR基础上发展起来的多重PCR是在1支PCR管中利用多对特异性引物进行PCR扩增，可同时检测多种病原感染，在临床上对混合感染的鉴别诊断具有独特的应用价值。然而，多重PCR除具有易污染，假阳性和假阴性较高等常规PCR的缺点外，由于多重PCR扩增一般涉及2对或2对以上的引物，引物之间的交叉反应常常导致多重PCR检测灵敏度和特异性出现不同程度的下降，限制了多重PCR的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，以实现对3种病毒的环介导间接PCR检测。
为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，利用PRRSV、PCV2和CSFV3种病毒核酸设计3对特异性探针，利用PCR制备探针标记的报告基因，然后再通过报告基因的环化和反向PCR扩增，实现对3种病毒的环介导间接PCR检测。
具体包括以下步骤：
(1)探针和引物的设计
根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的高度保守性核苷酸序列设计3对特异性探针；选择大豆Lectin基因作为报告基因，并以此基因片段的核苷酸序列为模板设计1对正向PCR扩增引物和1对反向PCR扩增引物；将3对特异性探针分别置于正向PCR扩增引物的上下游引物的末端，即构成3对针对不同病毒的标记用引物，将标记用引物和反向PCR扩增引物进行合成，用于环介导间接PCR扩增；
(2)病毒核酸的制备；
(3)报告基因的制备；
用3对标记用引物分别扩增大豆Lectin基因，经PCR产物回收后获得3种标记的报告基因，每条报告基因两端带有2条探针，此3种报告基因分别针对不同病毒；
(4)单病毒环介导间接PCR检测；
将不同的报告基因与待检核酸混合，报告基因携带的探针与目的基因进行杂交，形成杂合分子，之后在嗜热DNA聚合酶和嗜热DNA连接酶作用下，经缺口补平及连接，实现报告基因的环化，再采用反向PCR扩增报告基因，间接检测3种病毒；
(5)多病毒环介导间接PCR检测；
将3种报告基因与待检核酸混合，经探针杂交、缺口补平及连接，实现报告基因的环化，再采用反向PCR扩增报告基因，间接检测3种病毒。
所述步骤(1)中用于检测PCV病毒的标记引物序列为：
上游引物P1TCAAGAAGCCTCATCAC
下游引物P2
CTGTCATTTCACCAGGGTTTAGTT
其中斜体部分为探针序列；
所述步骤(1)用于检测PRRSV病毒的标记引物序列为：
上游引物P3
TCAAGAAGCCTCATCACA
下游引物P4
TTTCACCAGGGTTTAGTT
其中斜体部分为探针序列；
所述步骤(1)用于检测PRRSV病毒的标记引物序列为：
上游引物P5
CAAGAAGCCTCATCACA
下游引物P6
TTTCACCAGGGTTTAGTT
其中斜体部分为探针序列；
所述步骤(1)进行反向PCR扩增的引物序列为：
上游引物P7ACGTGCTAGTGATGGCTAAG
下游引物P8TGTTGAGTCCTCTAGGTTGT。
所述步骤(1)检测3种病毒的标记引物序列在合成时，引物的5’末端均进行磷酸化修饰。
所述步骤(1)检测3种病毒的报告基因为大豆Lectin基因。
所述步骤(2)用氯仿+蛋白酶K法制备核酸DNA，采用Trizol试剂法制备核酸RNA。
所述步骤(3)备的针对PCV病毒的报告基因序列包含列表中的SEQIDNO.1。
所述步骤(3)备的针对PRRSV病毒的报告基因序列包含列表中的SEQIDNO.2。
所述步骤(3)中制备的针对CSFV病毒的报告基因序列包含列表中的SEQIDNO.3。
所述步骤(4)、(5)中环介导间接PCR检测主要包括2步反应：
第一步反应：报告基因的环化，通过探针与目的基因的杂交形成杂合分子，再经缺口补平及连接实现报告基因的环化，将目的基因的检测置换为对报告基因的检测；
第二步反应：反向PCR扩增，以环化的报告基因为模板，利用反向引物扩增报告基因，实现对目的基因的间接检测。
所述步骤(4)、(5)中环介导间接PCR检测为反应体系为30μl，其中反向PCR扩增引物P7、P8各10pmol，dNTPs 0.3mM，10×Taq DNALigase ReactionBuffer 3μl，10×Ex Taq Buffer 3μl，Taq DNA Ligase 0.3μl，Ex Taq 0.20μl，探针标记的报告基因和待检样本的核酸溶液各2μl；反应分三步进行，首先，进行95℃变性5min；之后按95℃50sec，60℃8min进行5个循环；最后按95℃30sec，52℃30sec，72℃30sec进行25个循环。
所述步骤(4)、(5)中环介导间接PCR检测所用连接酶为Taq DNA Ligase。
本发明的方法是针对常规PCR和多重PCR检测的缺点，对PRRSV、PCV2和CSFV 3种病毒核酸设计3对特异性探针，利用PCR制备探针标记的报告基因，然后再通过报告基因的环化和反向PCR扩增，实现对3种病毒的环介导间接PCR检测。
针对多重PCR的缺点，本研究在常规PCR基础上建立环介导环间接PCR，其基本原理是将两段相邻的特异性探针分别连接在一段无关的报告基因首尾两端，带探针的报告基因可通过首尾探针序列与待测模板互补杂交，杂交体单链部分经缺口补平、连接环化后，再采用反向PCR扩增含探针的环状报告基因而实现对病原菌的间接检测，目前尚未有利用该技术同时检测PCV2，CSFV和PRRSV 3种病原的报道。本研究中，针对3种病毒设计3对特异性探针，标记相同的报告基因，设计1对反向PCR扩增引物，建立环介导间接PCR检测体系，可同时检测病料组织中PRRSV、PCV2和CSFV 3种病原，旨在为科学防控猪病提供一定参考。
通过临床试验表，本发明具有检测背景单一，灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，既可用于单病毒检测，又可用于多病毒同时检测，为PRRSV、PCV2和CSFV 3种病毒临床诊断及流行病学调查提供了一种工具。
附图说明
图1为以质粒pMD18-T-Lectin为模板，采用常规PCR扩增大豆Lectin基因片段用作报告基因的产物电泳图；
图2为利用制备好的DNA或cDNA溶液和特异性探针标记的报告基因分别进行PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒环介导间接PCR检测的电泳图；
图3为利用制备好的DNA或cDNA溶液和特异性探针标记的报告基因同时进行PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒环介导间接PCR检测的电泳图；
图4为制备好的PCV2，CSFV，PRRSV，PRV，PPV，Haemophilus parasuis和ETEC 7种病原核酸分别进行PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒环介导间接PCR检测结果，以评估单病毒检测的特异性；
图5为制备好的PCV2，CSFV，PRRSV，PRV，PPV，Haemophilus parasuis和ETEC 7种病原核酸同时进行PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒环介导间接PCR检测结果，以评估多病毒检测的特异性；
图6为将PCV2，CSFV，PRRSV 3种病毒核酸样本进行倍比稀释后，分别进行PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒环介导间接PCR检测结果，以评估单病毒检测的灵敏度；
图7为将PCV2，CSFV，PRRSV 3种病毒核酸样本进行倍比稀释后，同时进行PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒环介导间接PCR检测结果，以评估多病毒检测的灵敏度。
具体实施方式
实施例1环介导间接PCR检测PCV、PRRSV和CSFV 3种猪源性病毒的方法
1.1探针与引物的设计
分析GenBank数据库已发表的PCV2、PRRSV和CSFV基因序列，以基因的保守区为模板，利用Primer Premier 5.0软件设计针对不同病毒靶标的探针，用以标记报告基因，本实验中所采用的报告基因为大豆Lectin基因，PCR标记所用引物及反向PCR扩增引物均由上海生工合成，引物P1～P6的5’端进行磷酸化修饰，划线部分为探针序列。引物序列见表1。
表1标记引物和反向PCR扩增引物序列及特性
1.2病毒的核酸制备
病毒DNA的制备：采用经典的酚：氯仿+蛋白酶K法制备病毒DNA，制备的DNA置-20℃保存备用。
病毒RNA的制备及逆转录合成cDNA：RNA的制备参考Trizol试剂的使用说明，制备的RNA样品立即进行逆转录合成cDNA：取RNA样品4μl，加入25mM的随即引物1.5μl，混匀，70℃保温10min，冰上冷却2min；之后，向反应管中依次加入5×M-MLV Buffer 2μl、dNTPs Mixture 1μl、RNase Inhibitor 0.5μl和RTaseM-MLV 1μl，总体积为10μl，混匀，42℃60min，72℃10min，合成的cDNA保存于-20℃备用。
1.2报告基因的制备
分别以P1和P2、P3和P4、P5和P6为引物对，以质粒pMDl 8-T-Lectin为模板，采用常规PCR扩增大豆Lectin基因片段用作检测的报告基因，PCR反应体系总体积50μl，循环条件为95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环。产物经电泳检测(图1)并回收纯化，获得针对不同病毒的、特异性探针耦联的报告基因，-20℃保存备用。
1.3单病毒环介导间接PCR检测
取制备好的DNA或cDNA溶液和特异性探针标记的报告基因进行报告基因环化及反向PCR扩增，反应体系为30μl，其中P7、P8各10pmol，dNTPs 0.3mM，10×Taq DNA Ligase Reaction Buffer 3μl，10×Ex Taq Buffer 3μl，Taq DNALigase 0.3μl，Ex Taq 0.20μl，报告基因和DNA或cDNA溶液各2μl。反应分三步进行，首先，进行95℃变性5min；之后按95℃50sec，60℃8min进行5个循环；最后按95℃30sec，52℃30sec，72℃30sec进行25个循环，扩增结束后立即进行电泳检测(图2)。
1.5多病毒环介导间接PCR检测
取制备好的DNA或cDNA溶液和3种特异性探针标记的报告基因各2μl混合，之后依次加入引物P7、P8各10pmol，dNTPs 0.3mM，10×Taq DNA LigaseReaction Buffer 3μl，10×Ex Taq Buffer 3μl，Taq DNA Ligase 0.3μl，Ex Taq 0.20μl，最后用无菌水补足30μl。反应分三步进行，首先，进行95℃变性5min；之后按95℃50sec，60℃8min进行5个循环；最后按95℃30sec，52℃30sec，72℃30sec进行25个循环，扩增结束后立即进行电泳检测(图3)。
实施例2环介导间接PCR检测PCV、PRRSV和CSFV 3种猪源性病毒方法的评估
2.1特异性评估
分别制备PCV2DNA、PRV DNA、PPV DNA、副猪嗜血杆菌DNA和产肠毒素大肠杆菌DNA及CSFV cDNA和PRRSV cDNA溶液，以此溶液为模板分别进行单病毒环介导间接PCR检测和多病毒环介导间接PCR检测，评估环介导间接PCR检测特异性，结果如图(附图4、5)，无论单病毒检测还是多病毒检测，环介导间接PCR均表现出高度的特异性，扩增背景单一，且与其他病原无交叉反应。
2.2灵敏度评估
将制备的PCV、PRRSV和CSFV 3种病毒核酸溶液用分光光度计进行浓度测定后，用蒸馏水调整PCV2DNA浓度至200pg/μl、50pg/μl、12.5pg/μl、3.1pg/μl、0.8pg/μl和0.2pg/μl 6个浓度梯度，调整CSFV和PRRSV RNA浓度至400pg/μl、100pg/μl、25pg/μl、6.2pg/μl、1.6pg/μl和0.4pg/μl 6个浓度梯度，然后分别进行环介导间接PCR扩增，以观察评估的灵敏度，结果如图(附图6、7)，多病毒同时检测与单病毒检测灵敏度相当，没有出现因扩增干扰而导致灵敏度下降现象。
2.3临床应用评估
采集郑州市周边地区不同猪场的具有高热症状的病料20份，主要包括心肺、淋巴结等组织以及一些血清样品，组织样品经匀浆后用于DNA和RNA制备；血清样品直接进行DNA和RNA制备，然后进行3种病毒单病毒环介导间接PCR检测和多病毒环介导间接PCR同时检测，同时对20份临床样本进行3种病毒的常规PCR检测，检测方法完全参照试剂盒说明书，比较三者的符合率，以评估检测方法的稳定性，结果见表2。
表2临床样本检测结果
检测表明：采用本发明的方法既克服了常规PCR检测因污染而导致的假阴性和假阳性，又克服了多重PCR检测因多对引物之间的干扰而导致检测灵敏度下降，具有扩增背景单一、特异性强、灵敏度高、与其它病原微生物的检测无交叉反应性等优点，利用常规PCR和环介导间接PCR检测20份临床样本的PRRSV、PCV2和CSFV混合感染情况，检测结果表明单病毒常规PCR检测、单病毒环介导间接PCR检测以及多病毒环介导间接PCR同时检测的结果完全一致，3种方法检测结果的符合率为100％，进一步证实了该方法检测结果准确可靠，无漏检现象。
序列表
SEQ IDNO.1
长度：372bp
类型：DNA
来源：中间序列为大豆Lectin基因片段，两侧各18bp为针对PCV的探针序列
1
CTAGATTCCA CTATTGATTC AAGAAGCCTC ATCACACCTC AGACAAGAAC TACATAACAG 60
GGGACGACGG AGGCAAGTTC GAGATACAAC CTAGAGGACT CAACATTGTG TGGGGAAATG 120
ATTCTCGATA CTGGAAAATT CCAGAACAAA GGTCTGCGGA GCTGATCCAA GTTTCATGGT 180
TGGAGGTATC CGGCGTGGTA AACTTACCAG GTGTCAAGAA GTATAGGGTT GAATTCGAAG 240
TGAGAGTTAA AGACGATGGG TTCGGTTGGA GTGGCACGGA CGTGCTAGTG ATGGCTAAGA 300
TTGGGAAAAC GGGAAAATAT ACGTATAAGG TGACGAAACT AAACCCTGGT GAAATACTGT 360
CAAGCGAACC AC 372
SEQ IDNO.2
长度：371bp
类型：DNA
来源：中间序列为大豆Lectin基因片段，上游18bp和下游17bp为针对PRRSV的探针序列
1
AAACCAGTCC AGAGGCAATC AAGAAGCCTC ATCACACCTC AGACAAGAAC TACATAACAG 60
GGGACGACGG AGGCAAGTTC GAGATACAAC CTAGAGGACT CAACATTGTG TGGGGAAATG 120
ATTCTCGATA CTGGAAAATT CCAGAACAAA GGTCTGCGGA GCTGATCCAA GTTTCATGGT 180
TGGAGGTATC CGGCGTGGTA AACTTACCAG GTGTCAAGAA GTATAGGGTT GAATTCGAAG 240
TGAGAGTTAA AGACGATGGG TTCGGTTGGA GTGGCACGGA CGTGCTAGTG ATGGCTAAGA 300
TTGGGAAAAC GGGAAAATAT ACGTATAAGG TGACGAAACT AAACCCTGGT GAAAAAAGCC 360
TCGTGTTGGG T 371
SEQ IDNO.3
长度：380bp
类型：DNA
来源：中间序列为大豆Lectin基因片段，上游23bp和下游21bp为针对CSFV的探针序列
1
GATGACTTCA GGTCCGGGCT GTGTCAAGAA GCCTCATCAC ACCTCAGACA AGAACTACAT 60
AACAGGGGAC GACGGAGGCA AGTTCGAGAT ACAACCTAGA GGACTCAACA TTGTGTGGGG 120
AAATGATTCT CGATACTGGA AAATTCCAGA ACAAAGGTCT GCGGAGCTGA TCCAAGTTTC 180
ATGGTTGGAG GTATCCGGCG TGGTAAACTT ACCAGGTGTC AAGAAGTATA GGGTTGAATT 240
CGAAGTGAGA GTTAAAGACG ATGGGTTCGG TTGGAGTGGC ACGGACGTGC TAGTGATGGC 300
TAAGATTGGG AAAACGGGAA AATATACGTA TAAGGTGACG AAACTAAACC CTGGTGAAAT 360
CGTCAACCGA TGAGATAGGG 380
Claims (10)
1.一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：利用PRRSV、PCV2和CSFV 3种病毒核酸设计3对特异性探针，利用PCR制备探针标记的报告基因，然后再通过报告基因的环化和反向PCR扩增，实现对3种病毒的环介导间接PCR检测。
2.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
(1)探针和引物的设计
根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的高度保守性核苷酸序列设计3对特异性探针；选择大豆Lectin基因作为报告基因，并以此基因片段的核苷酸序列为模板设计1对正向PCR扩增引物和1对反向PCR扩增引物；将3对特异性探针分别置于正向PCR扩增引物的上下游引物的末端，即构成3对针对不同病毒的标记用引物，将标记用引物和反向PCR扩增引物进行合成，用于环介导间接PCR扩增；
(2)病毒核酸的制备；
(3)报告基因的制备；
用3对标记用引物分别扩增大豆Lectin基因，经PCR产物回收后获得3种标记的报告基因，每条报告基因两端带有2条探针，此3种报告基因分别针对不同病毒；
(4)单病毒环介导间接PCR检测；
将不同的报告基因与待检核酸混合，报告基因携带的探针与目的基因进行杂交，形成杂合分子，之后在嗜热DNA聚合酶和嗜热DNA连接酶作用下，经缺口补平及连接，实现报告基因的环化，再采用反向PCR扩增报告基因，间接检测3种病毒；
(5)多病毒环介导间接PCR检测；
将3种报告基因与待检核酸混合，经探针杂交、缺口补平及连接，实现报告基因的环化，再采用反向PCR扩增报告基因，间接检测3种病毒。
3.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(1)中用于检测PCV病毒的标记引物序列为：
上游引物P1
TCAAGAAGCCTCATCAC
下游引物P2
TTTCACCAGGGTTTAGTT
其中斜体部分为探针序列；
所述步骤(1)用于检测PRRSV病毒的标记引物序列为：
上游引物P3
TCAAGAAGCCTCATCACA
下游引物P4
TTTCACCAGGGTTTAGTT
其中斜体部分为探针序列；
所述步骤(1)用于检测PRRSV病毒的标记引物序列为：
上游引物P5
TCAAGAAGCCTCATCACA
下游引物P6TTTCACCAGGGTTTAGTT
其中斜体部分为探针序列；
所述步骤(1)进行反向PCR扩增的引物序列为：
上游引物P7ACGTGCTAGTGATGGCTAAG
下游引物P8TGTTGAGTCCTCTAGGTTGT。
4.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(1)检测3种病毒的标记引物序列在合成时，引物的5’末端均进行磷酸化修饰。
5.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(1)检测3种病毒的报告基因为大豆Lectin基因。
6.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(2)用氯仿+蛋白酶K法制备核酸DNA，采用Trizol试剂法制备核酸RNA。
7.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(3)备的针对PCV病毒的报告基因序列包含列表中的SEQIDNO.1。
8.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(3)备的针对PRRSV病毒的报告基因序列包含列表中的SEQIDNO.2。
9.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(3)中制备的针对CSFV病毒的报告基因序列包含列表中的SEQIDNO.3。
10.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(4)、(5)中环介导间接PCR检测主要包括2步反应：
第一步反应：报告基因的环化，通过探针与目的基因的杂交形成杂合分子，再经缺口补平及连接实现报告基因的环化，将目的基因的检测置换为对报告基因的检测；
第二步反应：反向PCR扩增，以环化的报告基因为模板，利用反向引物扩增报告基因，实现对目的基因的间接检测；所述步骤(4)、(5)中环介导间接PCR检测为反应体系为30μl，其中反向PCR扩增引物P7、P8各10pmol，dNTPs 0.3mM，10×Taq DNA Ligase Reaction Buffer 3μl，10×Ex Taq Buffer3μl，Taq DNA Ligase 0.3μl，Ex Taq 0.20μl，探针标记的报告基因和待检样本的核酸溶液各2μl；反应分三步进行，首先，进行95℃变性5min；之后按95℃50sec，60℃8min进行5个循环；最后按95℃30sec，52℃30sec，72℃30sec进行25个循环。
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2011
- 2011-11-02 CN CN2011103413873A patent/CN102382905A/zh active Pending
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