CN102653798A - 鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒传统毒株和高致病毒株的荧光pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒传统毒株和高致病毒株的荧光PCR检测方法，为了能准确、快速的检测nsp2基因缺失的猪繁殖与呼吸系统综合征变异病毒，在nsp2基因核苷酸序列上设计了一条上游引物和两条下游引物，其中一条下游引物设计在缺失碱基序列区域。通过条件优化建立了区分传统株和高致病性nsp2基因缺失株的PCR方法；并将最优化条件运用于SYBR Green荧光定量PCR分析，建立了根据熔解曲线鉴别nsp2缺失变异株的荧光定量PCR方法，灵敏度达到可检出3-6个基因拷贝。与常规PCR相比，本发明的荧光定量PCR方法能快速准确的检测出传统株和缺失株，灵敏度约比常规PCR高10倍。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，公开了一种鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒传统毒株和高致病毒株的荧光PCR检测方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸系统综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)俗称“蓝耳病”，是一种由猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道征状，以及高死亡率为特征的高度接触性传染病。1987年该病首次爆发于美国，世界各国也相继呈流行性感染，给世界养猪业造成了巨大的损失。该病于2006年在我国大部分省份开始流行起来，即所谓的“猪无名高热”，给我国养猪业造成了巨大的损失。PRRSV的变异分为基因组变异和抗原性变异两类，PRRSV的nsp2(非结构蛋白)基因具有非常高的变异性，如HB-2株和MN184株在该区分别缺失了12个和100多个氨基酸，sp184212株则在该区插入了30多个氨基酸。从我国患病猪体内提取到的高致病性PRRSV进行全基因测序后发现在nps2基因片段存在约80个碱基序列的缺失，推测nsp2基因缺失为高致病性PRRSV的毒力增强的重要原因。传统的PCR方法不能对样品进行精确的定量测定，并且在时效性上存在一定的不足。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种根据PRRSV变异毒株在nsp2存在86个碱基的缺失这一特点建立一种利用荧光PCR方法快速检测nsp2基因缺失变异毒株的方法，具有操作方便、敏感性强、特异性好的优点。
为了实现上述目的本发明实施例采取的技术方案是：
鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒传统毒株和高致病毒株的荧光PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)准备材料：
提供已克隆PRRSV高致病性毒株TJ-H1和传统株TJ-H3的nsp2基因的质粒TJ-H1nsp2-T和TJ-H3 nsp2-T，并提取该质粒的DNA；
(2)设计引物：
运用DNAMAN软件对nsp2基因缺失的PRRSV高致病性毒株TJ-H1与传统株TJ-H3的nsp2基因的核苷酸序列和GenBank数据库中其他株PRRSV的nsp2基因序列进行比对，找出缺失部分的核苷酸序列和所有参与比对的PRRSV株的nsp2基因序列高度保守区域，利用Primer Premier5.0引物设计软件，在缺失区域上游的高度保守区域设计一条上游引物nsp2-1，在缺失区域设计一条下游引物1nsp2-2，在缺失区域下游的高度保守区域设计一条下游引物2nsp2-3；
(3)PCR反应体系及其反应程序和参数的优化
分别以TJ-H1 nsp2-T和TJ-H3 nsp2-T质粒DNA为模板，对退火温度、循环次数、引物浓度及双重PCR反应中三条引物的最佳浓度配比进行优化，确定PCR反应的最佳条件；
(4)检测最佳PCR反应条件下的PCR反应特异性和敏感性
利用步骤(3)优化的PCR反应的最佳条件，以TJ-H1nsp2-T和TJ-H3nsp2-T质粒DNA为模板，各自分别用nsp2-1，nsp2-2引物对、nsp2-1，nsp2-3引物对和nsp2-1，nsp2-2，nsp2-3引物对进行扩增，确定PCR反应的特异性；
将TJ-H1nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释后作为模板，各自用nsp2-1，nsp2-3引物对进行扩增；以及，将TJ-H3 nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释后作为模板，各自分别用nsp2-1，nsp2-3引物对、nsp2-1，nsp2-2，nsp2-3引物对进行扩增，确定PCR反应的灵敏性。
(5)实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time FQ-PCR)，建立标准曲线
利用步骤(3)优化的PCR反应体系，将已知拷贝数的TJ-H3 nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释作为模板，各自用nsp2-1，nsp2-2引物对、nsp2-1，nsp2-3引物对和nsp2-1，nsp2-2，nsp2-3引物对进行实时荧光定量PCR扩增；以及将已知拷贝数的TJ-H1 nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释作为模板，各自用nsp2-1，nsp2-3引物对进行实时荧光定量PCR扩增，扩增反应的程序和参数为：95℃10min，1个循环；95℃15s，57℃45s，40个循环，得到相应的熔解曲线，最后进行标准曲线的绘制，以模板起始拷贝数的对数值(横坐标)对PCR反应的Ct值(纵坐标)作图，建立标准曲线；
(6)未知样品的检测
用总RNA提取试剂(Trizol试剂)提取待测样品细胞的总RNA，焦碳酸乙二酯(DEPC)水(1wt％)溶解后置-40℃冰箱备用；以该总RNA的反转录产物作为模板，利用(3)优化的PCR反应体系，用nsp2-1，nsp2-3引物对进行SYBR Green(核苷酸胶体染料，分子式为C32H37IN4S)实时荧光定量PCR反应，扩增反应的程序和参数为：95℃10min，1个循环；95℃15s，57℃45s，40个循环，检测结果与(5)中建立的标准曲线进行比较，并根据其熔解曲线鉴别该样本是否为PRRSV高致病性毒株TJ-H1。
上述步骤(2)中所述缺失部分的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示；缺失部分上游的高度保守区域的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.2所示；缺失部分下游的高度保守区域的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.3所示；扩增的引物如下：
上游引物nsp2-1的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.4所示：CCTAACGGTT GGGAAGATTT GACTG；
下游引物1nsp2-2的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.5所示：CCACC TGCTG AAATTTGTGT CGC；
下游引物2nsp2-3的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.6所示：ACACA GGTGCAGGGT TGATG TCATT。
进一步分别以TJ-H1nsp2-T和TJ-H3 nsp2-T质粒DNA为模板，对退火温度、循环次数、引物浓度及双重PCR反应中三条引物的最佳浓度配比等进行优化，确定PCR反应的最佳条件，其中，50μL PCR反应体系为：10×Buffer(含MgCl2 25mM)5μL，模板DNA 1μL(3copies/μL)，上游引物(25pmol/μL)1μL，下游引物(25pmol/μL)1μL，dNTPs(每种10mmol/L)1μL，TaqDNA聚合酶(2.5M/μL)1μL，双蒸水补至50μL；双重PCR反应的50μL反应体系为：上游引物(25pmol/μL)1μL，下游引物1(25pmol/μL)0.5μL，下游引物2(25pmol/μL)1μL，其他同上；反应程序和参数为：94℃3min，1个循环；94℃40s，55℃30s，72℃30s，共5个循环；94℃40s，57℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃8min，1个循环；4℃3min。
本发明实施例的有益效果是：本发明根据PRRSV基因变异毒株的nsp2基因缺失了86个碱基的这一特点建立一种利用荧光定量PCR方法快速检测该变异毒株的方法，敏感性高于常规PCR。建立的SYBR Green荧光定量PCR方法比传统PCR方法在灵敏度、准确性、时效性等方面具有明显的优势，可满足临床上简便、快速、准确进行区分鉴定的要求。
附图说明
图1是TJ-H1和TJ-H3的nsp2基因PCR扩增产物的1.0％琼脂糖凝胶电泳图；
图2是梯度稀释的TJ-H3 nsp2-T质粒DNA的nsp2基因PCR扩增产物的1.0％琼脂糖凝胶电泳图；
图3是梯度稀释的TJ-H1 nsp2-T质粒DNA的nsp2基因PCR扩增产物的1.0％琼脂糖凝胶电泳图；
图4是梯度稀释的TJ-H3nsp2-T质粒DNA的nsp2基因双重PCR扩增产物的1.0％琼脂糖凝胶电泳图；
图5a是TJ-H3 nsp2-T质粒DNA加入nsp2-1和nsp2-3引物对的SYBR Green荧光定量PCR反应的标准曲线；
图5b是TJ-H3nsp2-T质粒DNA加入nsp2-1和nsp2-3引物对的SYBR Green荧光定量PCR反应的熔解曲线；
图6a是TJ-H3nsp2-T质粒DNA加入nsp2-1和nsp2-2引物对的SYBR Green荧光定量PCR反应的标准曲线；
图6b是TJ-H3nsp2-T质粒DNA加入nsp2-1和nsp2-2引物对的SYBR Green荧光定量PCR反应的熔解曲线；
图7a是TJ-H1nsp2-T质粒DNA加入nsp2-1和nsp2-3引物对的SYBR Green荧光定量PCR反应的标准曲线；
图7b是TJ-H1nsp2-T质粒DNA加入nsp2-1和nsp2-3引物对的SYBR Green荧光定量PCR反应的熔解曲线；
图8a是TJ-H3nsp2-T质粒DNA加入nsp2-1、ns p2-2和nsp2-3引物对的SYBR Green荧光定量PCR反应的标准曲线；
图8b是TJ-H3nsp2-T质粒DNA加入nsp2-1、ns p2-2和nsp2-3引物对的SYBR Green荧光定量PCR反应的熔解曲线；
图9a是12株PRRSV抗体阳性样本的总RNA反转录产物加入nsp2-1和nsp2-3引物对的SYBR Green荧光定量PCR反应的扩增曲线；
图9b是12株PRRSV抗体阳性样本的总RNA反转录产物加入nsp2-1和nsp2-3引物对的SYBR Green荧光定量PCR反应的熔解曲线。
图1中的M为DGL 2000Marker，1-6泳道分别为TJ-H3nsp2-T DNA+nsp2-1、nsp2-2；TJ-H1 nsp2-T DNA+nsp2-1、nsp2-2；TJ-H3 nsp2-T DNA+nsp2-1、nsp2-3；TJ-H1 nsp2-TDNA+nsp2-1、nsp2-3；TJ-H3 nsp2-T DNA+nsp2-1、nsp2-2和nsp2-3；TJ-H1 nsp2-T DNA+nsp2-1、nsp2-2和nsp2-3；7泳道为阴性对照(1μL上游引物，1μL下游引物，5uL 10×Buffer(含MgCl225mM)，1uL(各10mmol/L)dNTPs，1uL(2.5U/uL)TaqDNA聚合酶，双蒸水补至50μL)。
图2中的M为DGL 2000Marker，1-7泳道分别为10-1-10-7稀释的TJ-H3 nsp2-T DNA+nsp2-1、nsp2-3；8泳道为阴性对照(1μL上游引物，1μL下游引物，5uL 10×Buffer(含MgCl225mM)，1uL(各10mmol/L)dNTPs，1uL(2.5U/uL)TaqDNA聚合酶，双蒸水补至50μL)。
图3中M为DGL 2000Marker，1-6泳道分别为10-3-10-8稀释的TJ-H1 nsp2-T DNA+nsp2-1、nsp2-3；7泳道为阴性对照(1μL上游引物，1μL下游引物，5uL 10×Buffer(含MgCl225mM)，1uL(各10mmol/L)dNTPs，1uL(2.5U/uL)TaqDNA聚合酶，双蒸水补至50μL)。
图4中M为DGL 2000Marker，1-6泳道分别为10-3-10-8稀释的TJ-H3 nsp2-T DNA+nsp2-1、nsp2-2和nsp2-3；0泳道为阴性对照(1μL上游引物，0.5μL下游游引物1，1μL下游引物2，5uL 10×Buffer(含MgCl225mM)，1uL(各10mmol/L)dNTPs，1uL(2.5U/uL)TaqDNA聚合酶，双蒸水补至50μL)。
图5a和图5b中R2＝99.48％；
图6a和图6b中R2＝99.77％；
图7a和图7b中R2＝99.79％；
图8a和图8b中R2＝99.60％；
图5a、图6a、图7a和图8a中：横坐标为Log(模板中拷贝数)，纵坐标为Ct值；
图5b、图6b、图7b、图8b和图9b中：横坐标为温度，纵坐标为荧光量；
图9a中：横坐标为循环数，纵坐标为荧光量。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
1、准备材料：
1.1质粒和毒株
已克隆了PRRSV高致病性毒株TJ-H1和传统株TJ-H3的nsp2基因的质粒(TJ-H1 nsp2-T和TJ-H3 nsp2-T)由本实验室构建(已发表在“动物医学进展”，2010年第31期，论文题为：“PRRSV天津分离株Nsp2基因的克隆和遗传进化分析”，并可向公众提供该两种质粒)，Genbank登录号分别为GQ923891、GQ923892、GQ923893(GQ923891、GQ923892为高致病性毒株TJ-H1，并且同源性达到100％；GQ923893为传统株TJ-H3)。猪繁殖与呼吸系统综合征病毒抗体阳性血清12份由天津市动物疫病预防控制中心提供。
1.2仪器和试剂
高速冷冻离心机购自力康公司，Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR仪购自Applied Biosystems公司。Trizol试剂购自北京康为世纪生物公司，反转录酶购自杭州博日科技公司，Taq DNA聚合酶购自北京全式金生物公司，引物由北京奥科生物公司合成。
2、方法
2.1引物的设计
运用DNAMAN软件对nsp2基因缺失株TJ-H1与传统株TJ-H3的nsp2基因核苷酸序列(该核苷酸序列可在Genebank中查到，登录号分别为GQ923891、GQ923892和GQ923893)和GenBank数据库中其他PRRSV株的nsp2基因序列比对，找出缺失部分的核苷酸序列和所有参与比对的PRRSV株的nsp2基因序列高度保守区域，利用Primer Premier5.0引物设计软件，在缺失部分上游的高度保守区域设计一条上游引物nsp2-1，在缺失部分设计一条下游引物nsp2-2，在缺失部分下游的高度保守区域设计一条下游引物nsp2-3。其中所述缺失部分的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示；缺失部分上游的高度保守区域的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.2所示；缺失部分下游的高度保守区域的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.3所示；
三条扩增引物的序列如下表所示：
表1三条引物核苷酸序列
2.2PCR反应条件的优化
分别以TJ-H1 nsp2-T和TJ-H3 nsp2-T质粒DNA为模板，对退火温度、循环次数、引物浓度及双重PCR反应中三条引物的最佳浓度配比等进行优化，确定PCR反应的最佳条件。
经过多次对dNTPs浓度、引物浓度及退火温度、循环次数、进行优化筛选，从而确立了50μL PCR反应体系为：10×Buffer(含MgCl2，浓度25mM)5μL，模板DNA(浓度3copies/μL)1μL，上游引物(25pmol/μL)1μL，下游引物(25pmol/μL)1μL，dNTPs(每种10mmol/L)1μL，TaqDNA聚合酶(2.5M/μL)1μL，双蒸水补至50μL。反应程序及参数为：94℃3min，1个循环；94℃40s，55℃30s，72℃30s，共5个循环；94℃40s，57℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃8min，1个循环；4℃3min。
双重PCR反应的最佳参数为：上游引物nsp2-1(25pmol/μL)1μL，下游引物1nsp2-2(25pmol/μL)0.5μL，下游引物2nsp2-13(25pmol/μL)1μL，其他同上。
2.3PCR反应特异性和敏感性检测
利用步骤2.2所述的PCR反应的最佳条件，以TJ-H1nsp2-T和TJ-H3nsp2-T质粒DNA为模板，各自分别用nsp2-1，nsp2-2引物对，nsp2-1，nsp2-3引物对和nsp2-1，nsp2-2，nsp2-3引物对进行扩增，确定PCR反应的特异性。
PCR扩增的特异性结果如图1所示，在1.0％琼脂糖凝胶中电泳中可以得到清晰的目的条带，大小与预期的相符合。
将TJ-H1nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释作为模板，在步骤2.2所述的PCR反应的最佳条件下，各自用nsp2-1、nsp2-3引物对扩增；以及将TJ-H3 nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释作为模板，在步骤2.2所述的PCR反应的最佳条件下，各自分别用nsp2-1、nsp2-3引物对、nsp2-1，nsp2-2，nsp2-3引物对进行扩增扩增，确定PCR反应的灵敏性。
PCR灵敏度实验结果如图2、图3和图4所示，TJ-H3 nsp2-T质粒DNA可以检测至3×102copies/μL，TJ-H1nsp2-T质粒DNA可以检测至6×102copies/μL，条带大小均与预期的相符合。TJ-H3nsp2-T质粒DNA的双重PCR可检测至3×102copies/μL。
2.4Real-time FQ-PCR(实时荧光定量聚合酶链反应)
利用优化的PCR反应体系，将已知拷贝数的TJ-H1 nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释作为模板，各自分别用nsp2-1，nsp2-2引物对、nsp2-1，nsp2-3引物对和nsp2-1，nsp2-2，nsp2-3引物对进行SYBR Green实时荧光定量PCR扩增；以及将已知拷贝数的TJ-H3 nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释作为模板，各自用nsp2-1、nsp2-3引物对进行SYBR Green实时荧光定量PCR扩增，扩增反应的程序和参数为：95℃10min，1个循环；95℃15s，57℃45s，40个循环，得到相应的熔解曲线，最后进行标准曲线的绘制：以模板起始拷贝数的对数值(横坐标)对PCR反应的Ct值(纵坐标)作图，建立标准曲线。
图5a、图5b、图7a和图7b表明在加入nsp-1、nsp-3引物后TJ-H3nsp2-T质粒DNA和TJ-H1nsp2-T质粒DNA分别可检测至3copies/μL和6copies/μL，通过熔解曲线分析发现，TJ-H3nsp2-T和TJ-H1nsp2-T质粒DNA扩增产物的Tm值分别为89℃和77℃，以此可以鉴别PRRSV高致病性毒株TJ-H 3和传统毒株TJ-H1。图6a和图6b表明在加入nsp-1、nsp-2引物对时，TJ-H3nsp2-T质粒DNA可检测至3copies/μL，并且在89℃出现峰值，另外在84℃附近也出现一个小峰。图8a和图8b表明同时加入nsp-1、nsp-2和nsp-3引物时，TJ-H3nsp2-T质粒DNA可检测至3×102copies/μL，Tm值约为87℃。
2.5PRRSV抗体阳性血清的检测
用SYBR Green荧光定量PCR反应检测从我国患病猪采集的12株PRRSV抗体阳性血清样本。
Trizol试剂(总RNA提取试剂)提取感染PRRSV细胞的总RNA，DEPC(焦碳酸乙二酯)水(浓度1wt％)溶解后置-40℃冰箱备用。以该总RNA的反转录产物作为模板，利用优化的PCR反应体系，用nsp2-1，nsp2-3引物对进行SYBR Green实时荧光定量PCR反应。实验结果与2.4中建立的标准曲线进行比较。
如图9a所示，12株样本的模板加入nsp2-1、nsp2-3引物对的扩增曲线表明，12株样本均为PRRSV阳性样本，通过如图9b所示的熔解曲线分析发现，12株样本扩增产物的Tm值约在77℃，符合高致病性nsp2基因缺失型的特征，确定12株样本均为TJ-H1。PCR检测结果表明扩增条带约为244bp，两者结论一致，确定样本均为TJ-H1。
12株毒株荧光定量PCR结果分析：
有报道称2006年-2007年我国大部分省份发生的猪高热综合征，从病猪体内分离到变异PRRSV。本实验中应用SYBR Green荧光定量PCR方法检测的结果显示所有12株样本均为TJ-H1阳性，这与报道中的结论相吻合，表明目前天津周边某地2009年流行的PRRSV主要为nsp2缺失的病毒毒株。
利用本发明实施例的SYBR Green荧光定量PCR方法区分TJ-H1和TJ-H3：
在利用nsp2-1和nsp2-3引物对分别对TJ-H1 nsp2-T和TJ-H3 nsp2-T进行荧光定量PCR分析时，由于两者扩增的目的片段大小、GC/AT值、核酸序列以及空间结构等存在差异，经熔解曲线分析后也会出现不同的Tm值，可根据此值区分TJ-H1和TJ-H3。12株抗体阳性的样本的荧光定量PCR的结果证明了此方法的准确性。因此，在临床应用中可以利用nsp2-1和nsp2-3引物对对样本进行扩增，便可快速的检测出TJ-H1和TJ-H3。
在PCR条件优化过程中发现，nsp2-1，nsp2-2引物对对TJ-H3nsp2-T的扩增效率要高于nsp2-1，nsp2-3引物对。这与nsp2-1，nsp2-3引物对间核苷酸序列5’端CG钳的能量和Tm值分布情况与nsp2-1，nsp2-2引物对的不同有关。通过调节3条引物的浓度，使双重PCR中检测的灵敏度、特异性条带的观察获得了理想结果。进一步将三条引物的最佳浓度配比应用于SYBR Green荧光定量PCR分析中，四组分析的熔解曲线没有明显的杂峰，说明了经过优化的引物浓度配比进一步提高了SYBR Green荧光定量PCR分析结果的稳定性和可靠性。
熔解曲线是SYBR Green荧光定量PCR分析中对扩增产物分析的重要辅助手段，一般而言，熔解曲线越高瘦，表明扩增产物的特异性越良好，产物量越多。熔解曲线矮胖时，说明扩增产物量少并且特异性差。利用设计的鉴别引物扩增PRRSV核苷酸序列，因扩增产物条带大小不同，熔解曲线Tm值有明显差异，即可鉴别基因缺失与传统株。
本发明实施例应用建立的荧光定量PCR方法，可以检出3-6个拷贝的质粒，敏感性高于常规PCR。另外，常规PCR需要进行扩增、电泳等过程，整个过程耗时大约3-4个小时，荧光定量PCR扩增和熔解曲线分析一共需要约90分钟，时效性良好。建立的SYBR Green荧光定量PCR方法比传统PCR方法在灵敏性、准确性、时效性等方面具有明显的优势，可满足临床上简变、快速、准确进行区分鉴定的要求。
本发明为了能准确、快速的检测nsp2基因缺失的猪繁殖与呼吸系统综合征变异病毒(PRRSV)，在nsp2基因核苷酸序列上设计了一条上游引物(nsp2-1)和两条下游引物(下游引物1nsp2-2，下游引物2nsp2-3)，其中下游引物1(nsp2-2)设计在缺失碱基序列区域。通过条件优化建立了区分传统株和高致病性nsp2基因缺失株的PCR方法；并将最优化条件运用于SYBR Green荧光定量PCR分析，建立了根据熔解曲线鉴别nsp2缺失变异株的荧光定量PCR方法，可检出3-6个基因拷贝。与常规PCR相比，荧光定量PCR方法能快速准确的检测出传统株和缺失株，灵敏性约比常规PCR高10倍。应用建立的方法对天津周边某地某猪场的12份阳性样本检测表明，09年感染猪群流行毒株主要为nsp2缺失变异株。
以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒传统毒株和高致病毒株的荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)准备材料
提供已克隆PRRSV高致病性毒株TJ-H1和传统毒株TJ-H3的nsp2基因的质粒TJ-H1nsp2-T和TJ-H3 nsp2-T，并提取该质粒的DNA；
(2)设计引物
运用DNAMAN软件对nsp2基因缺失的PRRSV高致病性毒株TJ-H1与传统株TJ-H3的nsp2基因的核苷酸序列和GenBank数据库中其他株PRRSV的nsp2基因序列进行比对，找出缺失部分的核苷酸序列和所有参与比对的PRRSV株的nsp2基因序列高度保守区域，利用Primer Premier5.0引物设计软件，在缺失区域上游的高度保守区域设计一条上游引物nsp2-1，在缺失区域设计一条下游引物1nsp2-2，在缺失区域下游的高度保守区域设计一条下游引物2nsp2-3；
(3)PCR反应体系及其反应程序和参数的优化
分别以TJ-H1 nsp2-T和TJ-H3 nsp2-T质粒DNA为模板，对退火温度、循环次数、引物浓度及双重PCR反应中三条引物的最佳浓度配比进行优化，确定PCR反应的最佳条件；
(4)检测最佳PCR反应条件下的PCR反应特异性和敏感性
利用步骤(3)优化的PCR反应的最佳条件，以TJ-H1nsp2-T和TJ-H3nsp2-T质粒DNA为模板，各自分别用nsp2-1，nsp2-2引物对、nsp2-1，nsp2-3引物对和nsp2-1，nsp2-2，nsp2-3引物对进行扩增，确定PCR反应的特异性；
将TJ-H1nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释后作为模板，各自用nsp2-1，nsp2-3引物对进行扩增；以及将TJ-H3 nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释后作为模板，各自分别用nsp2-1，nsp2-3引物对、nsp2-1，nsp2-2，nsp2-3引物对进行扩增，确定PCR反应的灵敏性；
(5)实时荧光定量聚合酶链反应，建立标准曲线
利用步骤(3)优化的PCR反应体系，将已知拷贝数的TJ-H3nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释作为模板，各自分别用nsp2-1，nsp2-2引物对、nsp2-1，nsp2-3引物对和nsp2-1，nsp2-2，nsp2-3引物对进行实时荧光定量PCR扩增；以及将已知拷贝数的TJ-H1nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释作为模板，各自用nsp2-1，nsp2-3引物对进行实时荧光定量PCR扩增，扩增反应的程序和参数为：95℃10min，1个循环；95℃15s，57℃45s，40个循环，得到相应的熔解曲线，最后进行标准曲线的绘制；
(6)未知样本的检测
用总RNA提取试剂提取待测样本细胞的总RNA，焦碳酸乙二酯水溶解后置-40℃冰箱备用，以该总RNA的反转录产物作为模板，利用步骤(3)优化的PCR反应体系，用nsp2-1，nsp2-3引物对进行SYBR Green实时荧光定量PCR反应，扩增反应的程序和参数参数为：95℃10min，1个循环；95℃15s，57℃45s，40个循环，检测结果与步骤(5)中建立的标准曲线进行比较，并根据其熔解曲线鉴别该样本是否为PRRSV高致病性毒株TJ-H1。
2.根据权利要求1所述的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述缺失部分的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示；缺失部分上游的高度保守区域的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.2所示；缺失部分下游的高度保守区域的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.3所示；扩增所用的引物如下：
上游引物nsp2-1的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.4所示；
下游引物1nsp2-2的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.5所示；
下游引物2nsp2-3的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1或2所述的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的PCR反应的最佳条件如下：50μL PCR反应体系为：10×Buffer(含MgCl225mM)5μL，模板DNA 1μL(3copies/μL)，上游引物(25pmol/μL)1μL，下游引物(25pmol/μL)1μL，dNTPs(每种10mmol/L)1μL，TaqDNA聚合酶(2.5M/μL)1μL，双蒸水补至50μL；双重PCR反应的50μL反应体系为：上游引物(25pmol/μL)1μL，下游引物1(25pmol/μL)0.5μL，下游引物2(25pmol/μL)1μL，其他同上；反应程序及参数为：94℃3min，1个循环；94℃40s，55℃30s，72℃30s，共5个循环；94℃40s，57℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃8min，1个循环；4℃3min。
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