CN110438263B - 一种快速鉴别prrsv基因亚型的pcr-hrm引物、检测方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种快速鉴别PRRSV基因亚型的PCR‑HRM引物、检测方法与应用。该引物的序列如SEQ ID NO.1～2所示，其对目前市场广泛使用的PRRSV疫苗株和猪场的流行毒株均具有很好的扩增性，PCR扩增效率高，检测灵敏度高，且特异性好，重复性高。本发明提供的PCR‑HRM检测方法分析鉴别PRRSV 4个基因亚型的操作简单，全部过程只需2小时，极大缩短了基因分型所需时间；费用低，不用测序，也无需合成探针，只需添加廉价易得的荧光饱和染料。该PCR‑HRM引物可用于制备PRRSV亚型检测试剂盒、养殖场PRRSV亚型鉴定、分子流行病学调查以及养殖中PRRSV亚型风险评估，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测领域，涉及一种快速鉴别PRRSV基因亚型的PCR-HRM引物、检测方法与应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合症(Porcine Reproductive and respiratory syndrome，PRRS)最早于1987年发现于美国，我国于1996年首次分离鉴定PRRSV，确定了该病在我国存在。其症状主要表现为怀孕母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎及仔猪感染后的成活率下降，成年猪的呼吸道症状。
PRRSV依据血清学试验和基因序列划分为2种基因型，即美洲型(代表毒株为VR-2332及其疫苗株RespPRRS MLV)和欧洲型(代表毒株为LV)，我国流行毒株以美洲型为主。2006年暴发的高热病病原为PRRSV经典株变异的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，随后通过对HP-PRRSV毒株在细胞上连续传代致弱，获得了多株PRRSV疫苗株(JXA1-R、TJM-F92、GDr180、HuN4-F112)并获得广泛应用。目前国内猪场PRRSV流行毒株依据GP5基因序列分为4个亚型，即以JXA1为代表的亚型Ⅰ、以VR2332为代表的亚型Ⅱ、以NADC30为代表的亚型Ⅲ和以GM2为代表亚型Ⅳ。研究表明2017年以来国内猪场的流行毒株NADC30类毒株和GM2类毒株(美国经典毒株和中国变异毒株重组)已成为规模化猪场主要的流行毒株，这2类毒株占比达到86％。
PCR-高分辨熔解曲线分析技术(high-resolution melting curve analysis，HRM)是一种用于单核苷酸多态性(SNP)和基因分型研究方法，是一种简单、快速、低成本的PCR扩增后检测技术，可用于高通量的突变扫描和基因分型。研究发现PRRSV疫苗株的返强与野毒株的重组非常普遍，单一猪群中存在多个PRRSV毒株，现已无法通过单核苷酸的差异来鉴别疫苗株与野毒株，更不能快速准确鉴定出猪场中PRRSV的基因亚型。目前对于PRRSV基因分型需要通过PCR扩增、测序并借助序列分析软件来完成，需要2-3天时间，时间长而且成本高。所以建立一种较简单、快速和高通量的鉴别PRRSV基因亚型的方法用于鉴定猪场的流行毒株指导疫苗的选择具有重大意义。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明的首要目的在克服现有技术的缺点与不足，提供一种快速鉴别PRRSV亚型的PCR-HRM引物。
本发明的另一目的在于提供一种快速鉴别PRRSV基因亚型的PCR-HRM检测方法，该方法具有简单、快速和高通量的特点。
本发明的再一目的在于提供上述快速鉴别PRRSV基因亚型的PCR-HRM引物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种快速鉴别PRRSV基因亚型的PCR-HRM引物，包括引物对PRRSV-F和PRRSV-R，引物对的核苷酸序列如下：
PRRSV-F：5’-TTGTGGTGTATCGTGCCRT-3’；
PRRSV-R 5’-AGCCAVTYTGTGCCATTCAGC-3’。
引物PRRSV-F中引入了1个简并碱基R(相当于A/G)，在引物PRRSV-R中引入2个简并碱基V(相当于G/A/C)和Y(相当于C/T)。
一种快速鉴别PRRSV亚型的PCR-HRM检测方法，包括如下步骤：
(1)从待测样品中提取病毒RNA；
(2)将步骤(1)得到的病毒RNA逆转录成cDNA；将得到的cDNA为模板，利用上述PCR-HRM引物对PRRSV-F/PRRSV-R进行PCR-HRM扩增反应，获得扩增产物；
(3)对得到的扩增产物进行HRM分析，确定待测样品所含PRRSV所属基因亚型。
步骤(2)中所述的逆转录和PCR-HRM扩增反应通过一步法完成。
所述的一步法的反应体系如下：每20μL反应体系中，含：提取的病毒RNA 2μL、2倍浓度的一步法缓冲液(2×one Step Buffer)10μL、浓度为10μM的引物PRRSV-F 0.5μL、浓度为10μM的引物PRRSV-R 0.5μL、逆转录酶和Taq酶混合液(PrimeScript 1Step Enzyme Mix)1μL、饱和荧光染料溶液(LC Green，购自美国Sigama公司，按说明书要求稀释20倍)1μL、ddH2O余量。
所述的一步法的反应条件如下：50℃反转录5min；95℃预变性2min；95℃变性10s、72℃延伸35s，循环45次；72℃终延伸5min；HRM升温步骤为92℃1min，40℃2min；60℃至90℃，升温速率为0.02℃/S。
步骤(3)中所述的HRM分析优先通过Rotor-Gene QM软件分析。
步骤(3)中所述的确定待测样品所含PRRSV所属基因亚型的具体步骤优选如下：得到待测样品的熔解曲线峰Tm值，与已经确定的不同类型的基因亚型熔解曲线峰Tm值比较，得到待测样品的基因亚型；已经确定的不同类型的基因亚型熔解曲线峰Tm值如下：将以JXA1-R等为代表的基因亚型Ⅰ熔解曲线峰Tm值范围为80.42～80.63℃；以RespPRRS MLV等为代表的基因亚型П熔解曲线峰Tm值范围为82.89～82.97℃；以NADC30、GD-GM等为代表的基因亚型Ⅲ熔解曲线峰Tm值范围为81.80～82.11℃以及以GM2、GD-HH等为代表的基因亚型Ⅳ熔解曲线峰Tm值范围为79.63～79.94℃。
所述的快速鉴别PRRSV亚型的PCR-HRM检测方法可在非诊断目的的研究中进行应用。
上述快速鉴别PRRSV基因亚型的PCR-HRM引物在制备PRRSV亚型检测试剂盒中的应用。
一种PRRSV亚型检测试剂盒，含有上述快速鉴别PRRSV基因亚型的PCR-HRM引物和PCR-HRM扩增反应所需的试剂。
所述的PCR-HRM扩增反应所需的试剂包括一步法缓冲液(2×one Step Buffer)、逆转录酶和Taq酶混合液(PrimeScript 1Step Enzyme Mix)和饱和荧光染料溶液中的至少一种。
上述快速鉴别PRRSV基因亚型的PCR-HRM引物或上述RRSV亚型检测试剂盒在养殖场PRRSV基因亚型鉴别、分子流行病学调查以及养殖中PRRSV基因亚型风险评估中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明首次提供了快速鉴别PRRSV 4个基因亚型的PCR-HRM引物和相应的检测方法。PCR-HRM分析鉴别PRRSV 4个基因亚型的操作简单，全部过程只需2小时，极大缩短了基因分型所需时间；费用低，不用测序，也无需合成探针，只需添加廉价易得的荧光饱和染料。
2.本发明提供的PCR-HRM引物对目前市场广泛使用的PRRSV疫苗株和猪场的流行毒株均具有很好的扩增性，PCR扩增效率高，检测灵敏度高。
3.本发明的PCR-HRM引物特异性好，能特异性扩增PRRSV，不会扩增其他病原序列，重复性高，对PRRSV基因分型的鉴定可靠。
4.本发明的PCR-HRM引物引物可用于制备鉴别PRRSV基因亚型检测试剂盒、养殖场PRRSV净化、PRRSV分子流行病学调查以及养殖中PRRSV亚型风险评估，应用前景广阔。
附图说明
图1为PRRSV以GP5基因序列划分的4个基因亚型遗传进化图谱图。
图2为PRRSV基因分型的4个标准毒株JXA1、RespPRRS MLV、GD-GM、GD-HH以及疫苗株TJM-F92和GDr180的PCR-HRM峰型化熔解曲线图。
图3为PRRSV基因分型的4个标准毒株JXA1、RespPRRS MLV、GD-GM、GD-HH三个批次的PCR-HRM峰型化熔解曲线图。
图4为PRRSV基因分型的4个标准毒株JXA1、RespPRRS MLV、GD-GM、GD-HH以及其它猪源病毒的荧光定量PCR扩增曲线图。
具体实施例
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
除有特别说明，本发明中所用各种试剂、原料均为可以从市场上购买或者通过公知的方法制得的产品。
实施例1 PCR-HRM引物设计
本发明发明人在广东省内100多家规模化猪场的临床样品中通过PRRSV GP5基因的PCR扩增和测序，将测序结果采用序列分析软件MEGA7绘制了PRRSV的遗传进化树，结果见图1。通过基因分型软件找到PRRSV 4种基因亚型分型的特征序列设计了多对引物并反复筛选得到可以高效扩增PRRSV所有毒株的引物。该引物扩增片段的长度为117bp，包含PRRSV 4种基因亚型分型的差异基因位点，该区域也是PRRSV疫苗免疫后产生中和抗体的主要抗原位点。引物的核苷酸序列如下所示：
PRRSV-F：5’-TTGTGGTGTATCGTGCCRT-3’(SEQ ID NO：1)；
PRRSV-R 5’-AGCCAVTYTGTGCCATTCAGC-3’(SEQ ID NO：2)。
由于PRRSV的4个基因亚型目的基因在设计引物的位置存在碱基的突变，为了扩增所有的PRRSV基因型，因此在引物中引入简并碱基，在引物PRRSV-F中引入了1个简并碱基R(相当于A/G)，在引物PRRSV-R中引入2个简并碱基V(相当于G/A/C)和Y(相当于C/T)。
实施例2标准样品的制备及PCR-HRM分析
(1)阳性标准样品的制备：
为了验证本发明方法的可行性与可靠性，同时建立PRRSV的4个基因亚型PCR-HRM分析的标准毒株，亚型Ⅰ和亚型Ⅱ选取市场上广泛使用的疫苗株JXA1-R株(购自广东省动物疫苗供应站)和RespPRRS MLV株(购自广东省动物疫苗供应站)作为这两个基因亚型的标准毒株，亚型Ⅲ和亚型Ⅳ分别选取本研究室从猪群中分离的分别与NADC30株和GM2株属同一基因亚型的两个毒株GD-GM株(已在GenBank上公开，基因库登录号为：KX429681.1)和GD-HH株(已在GenBank上公开，基因库登录号为：KX429682.1)作为这两个基因亚型的标准毒株阳性样品，为后续的临床样品检测提供PCR-HRM分析的分型参考，同时设立阴性空白对照NTC。
(2)从样品中提取病毒RNA：
取上述PRRSV各基因亚型代表毒株作为建立PCR-HRM分析的标准毒株，JXA1-R、RespPRRS MLV、GD-GM和GD-HH的病毒培养液各200μL进行病毒RNA抽提，按病毒DNA/RNA提取试剂盒(Magen公司)说明书操作，最后用40μL洗脱缓冲液进行洗脱即为病毒RNA。分别抽提3个不同批次的RNA样品进行重复试验。
(3)阳性标准样品的PCR-HRM操作
分别取4个标准毒株JXA1-R、RespPRRS MLV、GD-GM和GD-HH的病毒培养液按步骤(2)制备得到的RNA，以PRRSV-F/PRRSV-R为上下游引物，在加有饱和荧光染料下的进行PCR-HRM扩增(一步法扩增)，其扩增反应体系为：模板2μL、2×one Step Buffer 10μL、引物PRRSV-F(10μM)0.5μL、引物PRRSV-R(10μM)0.5μL、PrimeScript 1Step Enzyme Mix1μL、LCGreen溶液(按说明书要求稀释20倍)1μL、ddH2O补足至20μL。
扩增反应程序为：50℃反转录5min；95℃预变性2min；95℃变性10s、72℃延伸35s，45个循环；HRM升温步骤为92℃1min，40℃2min；60℃至90℃，升温速率为0.02℃/S。
(4)HRM分析
HRM实验结果用Rotor-Gene QM软件进行分析，结果见图2，4个标准样品的PCR扩增产物均有清晰的熔解曲线。其中JXA1-R株熔解曲线峰Tm值为80.55℃；RespPRRS MLV株熔解峰Tm值为82.89℃；GD-GM株熔解峰Tm值为81.93℃；GD-HH株熔解峰Tm值为79.71℃。将获得PRRSV的4个基因亚型标准株的PCR-HRM熔解峰Tm值后，临床样品中的PRRSV进行PCR-HRM分析后获得熔解峰Tm值，将此熔解峰Tm值与标准株熔解峰Tm值进行比较分类确定所属基因亚型。对不同批次JXA1-R株、GD-GM株、GD-HH和RespPRRS MLV株PCR产物熔解曲线峰Tm进行汇总，结果见表2和图3。
表2
| 样品 | 基因亚型 | 融解曲线峰Tm(℃) |
| JXA1-R(1) | 亚型Ⅰ | 80.59 |
| JXA1-R(2) | 亚型Ⅰ | 80.55 |
| JXA1-R(3) | 亚型Ⅰ | 80.50 |
| RespPRRS MLV(1) | 亚型Ⅱ | 82.88 |
| RespPRRS MLV(2) | 亚型Ⅱ | 82.92 |
| RespPRRS MLV(3) | 亚型Ⅱ | 82.86 |
| GD-GM(1) | 亚型Ⅲ | 81.93 |
| GD-GM(2) | 亚型Ⅲ | 81.96 |
| GD-GM(3) | 亚型Ⅲ | 81.89 |
| GD-HH(1) | 亚型Ⅳ | 79.78 |
| GD-HH(2) | 亚型Ⅳ | 79.64 |
| GD-HH(3) | 亚型Ⅳ | 79.72 |
根据表2的结果进行统计，不同批次JXA1-R、RespPRRS MLV、GD-GM、GD-HH株熔解峰Tm值为参考。亚型Ⅰ代表株JXA1-R熔解峰Tm值为80.55℃士0.05℃；亚型Ⅱ代表株RespPRRSMLV株熔解峰Tm值为82.89℃士0.03℃；亚型Ⅲ代表株GD-GM的熔解曲线峰Tm值为81.93℃士0.04℃；亚型Ⅳ代表株GD-HH的熔解曲线峰Tm值为79.71℃士0.07℃。结果表明PRRSV的4个基因亚型标准株熔解曲线峰Tm值不仅有很好的重复性，而且各亚型间熔解曲线峰Tm值从小到大温度差分别为0.84、1.38和0.96，因而可以很好的对PRRSV的基因亚型进行鉴别。
实施例3临床样品的PCR-HRM检测
(1)从疑似感染PRRSV的样本中提取病毒RNA，方法同实施例2中RNA提取方法。
(2)以提取的RNA为模板，进行反转录与PCR-HRM扩增(一步法扩增)，扩增反应体系为：提取的RNA 2μL、2倍浓度的一步法缓冲液(2×one Step Buffer)10μL、引物PRRSV-F(10μM)0.5μL、引物PRRSV-R(10μM)0.5μL、PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μL、饱和荧光染料LC Green溶液(按说明书要求稀释20倍)1μL、ddH2O补足至20μL。
扩增反应程序为：50℃反转录5min；95℃预变性2min；95℃变性10s、72℃延伸35s，45个循环。HRM程序的升温步骤为92℃1min，40℃2min；60℃至90℃，升温速率为0.02℃/S。
(3)HRM分析
将HRM实验结果用Rotor-Gene QM软件进行分析。1000份临床样品来自2014～2018年采自广东省及周边4个省猪场的患病猪，其中PRRSV阳性样品347份，所有阳性样品均进行GP5基因测序鉴定分型，其中亚型Ⅰ～Ⅳ亚型分别有48、2、128和169份。
将347份PRRSV阳性样品进行PCR-HRM分析，以实施例2制备的标准毒株样品(JXA1-R、RespPRRS MLV、GD-GM和GD-HH)作为基因分型的参照，347份PRRSV阳性临床样品的PCR-HRM扩增产物均有清晰的熔解曲线峰，其融解曲线峰Tm值统计，将Tm与标准毒株相近的归为一类，结果如表3所示，从表3可知在347份PRRSV阳性样品中亚型Ⅰ～亚型Ⅳ分别有48、2、128和169份，PCR-HRM基因分型结果与GP5基因测序分型结果完全一致，说明本发明建立的鉴别PRRSV基因亚型的PCR-HRM引物和方法是可行的。
从表3统计结果形成了鉴别PRRSV基因亚型的PCR-HRM的判断标准：以JXA1-R等为代表的基因亚型Ⅰ熔解曲线峰Tm值范围为80.42～80.63℃；以RespPRRS MLV等为代表的基因亚型П熔解曲线峰Tm值范围为82.89～82.97℃；以NADC30、GD-GM等为代表的基因亚型Ⅲ熔解曲线峰Tm值范围为81.80～82.11℃以及以GM2、GD-HH等为代表的基因亚型Ⅳ熔解曲线峰Tm值范围为79.63～79.94℃。如果样品的PCR-HRM熔解曲线峰Tm值在上述范围外以GP5基因测序分型为准。
表3
| 基因亚型 | 标准毒株 | 样品数量 | 融解曲线峰Tm(℃) |
| 亚型Ⅰ | JXA1-R | 48 | 80.42～80.63 |
| 亚型П | RespPRRS MLV | 2 | 82.89～82.97 |
| 亚型Ⅲ | GD-GM | 128 | 81.80～82.11 |
| 亚型Ⅳ | GD-HH | 169 | 79.63～79.94 |
实施例4 PCR-HRM方法特异性实验
分别将猪源性病毒株猪流行性腹泻病毒疫苗株(PEDV-ZJ08株，已在中国专利“201310722106.8、一株猪流行性腹泻病毒及其应用”中公开)、猪传染性胃肠炎病毒疫苗株(TGEV-HB08株，已在中国专利“201310722168.9、一株猪传染性胃肠炎病毒及其应用”中公开)，猪伪狂犬疫苗株(PRV-Bartha K61，购自广东省动物疫苗供应站)、猪瘟疫苗株(SCFV-C株，购自广东永顺生物制药有限公司)和市场上广泛销售的PRRSV疫苗株GDr180、TJM-F92、CH1-R(购自广东省动物疫苗供应站)的RNA反转录为cDNA，将其与无模板阴性样品对照NTC以及实施例1中的PRRSV 4个基因亚型的标准毒株(JXA1-R、RespPRRS MLV、GD-GM、GD-HH)的RNA反转录得到的cDNA用PRRSV-F/PRRSV-R引物进行PCR-HRM扩增分析，结果如图4所示，曲线1-5为PEDV-ZJ08株、TGEV-HB08株、PRV-Bartha K61、SCFV-C株和阴性对照样品，结果表明没有扩增曲线，扩增曲线6-12分别为PRRSV 4个基因亚型代表株JXA1-R、RespPRRS MLV、GD-GM、GD-HH株和PRRSV其它疫苗株(GDr180、TJM-F92和CH1-R)，说明本发明的PRRSV-F/PRRSV-R引物扩增的特异性较好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 一种快速鉴别PRRSV基因亚型的PCR-HRM引物、检测方法与应用
<130> 1
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物PRRSV-F
<220>
<222> (18)..(18)
<223> R相当于A/G
<400> 1
ttgtggtgta tcgtgccrt 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物PRRSV-R
<220>
<222> (6)..(6)
<223> V相当于G/A/C
<220>
<222> (8)..(8)
<223> Y（当于C/T）
<400> 2
agccavtytg tgccattcag c 21
Claims (8)
1.一种快速鉴别PRRSV基因亚型的PCR-HRM引物，其特征在于：包括引物对PRRSV-F和PRRSV-R，引物对的核苷酸序列如下：
PRRSV-F：5’-TTGTGGTGTATCGTGCCRT-3’；
PRRSV-R 5’-AGCCAVTYTGTGCCATTCAGC-3’；
R为A/G，V为G/A/C，Y为C/T。
2.一种非诊断目的的快速鉴别PRRSV亚型的PCR-HRM检测方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）从待测样品中提取病毒RNA；
（2）将步骤（1）得到的病毒RNA逆转录成cDNA；将得到的cDNA为模板，利用权利要求1所述的PCR-HRM引物对进行PCR-HRM扩增反应，获得扩增产物；
（3）对得到的扩增产物进行HRM分析，确定待测样品所含 PRRSV所属基因亚型；
步骤（3）中所述的确定待测样品所含 PRRSV所属基因亚型的具体步骤如下：得到待测样品的熔解曲线峰Tm值，与已经确定的不同类型的基因亚型熔解曲线峰Tm值比较，得到待测样品的基因亚型；已经确定的不同类型的基因亚型熔解曲线峰Tm值如下：基因亚型Ⅰ熔解曲线峰Tm值范围为80.42～80.63℃；基因亚型П熔解曲线峰Tm值范围为82.89～82.97℃；基因亚型Ⅲ熔解曲线峰Tm值范围为81.80～82.11℃；基因亚型Ⅳ熔解曲线峰Tm值范围为79.63～79.94℃。
3.根据权利要求2所述的非诊断目的的快速鉴别PRRSV亚型的PCR-HRM检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述的逆转录和PCR-HRM扩增反应通过一步法完成。
4.根据权利要求3所述的非诊断目的的快速鉴别PRRSV亚型的PCR-HRM检测方法，其特征在于：
所述的一步法的反应体系如下：每20 μL反应体系中，含：提取的病毒RNA 2μL、 2倍浓度的一步法缓冲液10μL、浓度为10μM的引物PRRSV-F 0.5 μL、浓度为10μM的引物PRRSV-R0.5 μL、逆转录酶和Taq酶混合液1μL、饱和荧光染料溶液1μL、ddH2O 余量；
所述的一步法的反应条件如下：50℃反转录5min；95℃预变性2min；95℃变性10s、72℃延伸35s，循环45次；72℃终延伸5min；HRM升温步骤为92℃ 1min，40℃ 2min；60℃至90℃，升温速率为0.02℃/S。
5.根据权利要求2所述的非诊断目的的快速鉴别PRRSV亚型的PCR-HRM检测方法，其特征在于：
步骤（3）中所述的HRM分析通过Rotor-Gene QM软件分析。
6.权利要求1所述的快速鉴别PRRSV基因亚型的PCR-HRM引物在制备PRRSV亚型检测试剂盒中的应用。
7.一种PRRSV亚型检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的快速鉴别PPPSV基因亚型的PCR-HRM引物。
8.根据权利要求7所述的PRRSV亚型检测试剂盒，其特征在于：还包括PCR-HRM扩增反应所需的试剂。
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