CN105112560A - 一种快速扩增猪圆环病毒2型全基因组序列的pcr方法及其应用 - Google Patents

一种快速扩增猪圆环病毒2型全基因组序列的pcr方法及其应用 Download PDF

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魏文康
温肖会
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Abstract

本发明公开了一种快速扩增猪圆环病毒2型全基因组序列的PCR方法。用于扩增猪圆环病毒2型全基因组序列的引物，包括如SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2所示的引物。本发明特异性强，敏感度高，可以快速有效地扩增出目的片段，有利于研究不同动物来源猪圆环病毒2型的遗传进化、分子流行病学及感染性克隆等。

Description

一种快速扩增猪圆环病毒2型全基因组序列的PCR方法及其应用
技术领域
本发明专利属于分子生物学领域，具体涉及猪圆环病毒2型全基因组序列快速扩增方法及其应用。
背景技术
猪圆环病毒2型是猪圆环病毒病的主要病原，临床上常导致仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾病综合征、母猪繁殖障碍、间质性肺炎等表现，严重危害养猪业健康发展(Zhaietal.，2014，VirologyJournal，11：88)。猪圆环病毒有猪圆环病毒1型和猪圆环病毒2型两个型，其中猪圆环病毒2型又有多种基因型，如PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d及PCV2e。猪圆环病毒1型对猪不致病，而猪圆环病毒2型对猪有致病性，是科学研究的重点。猪圆环病毒无处不在，目前，在猪群、野猪群、人群、牛肉、啮齿类动物、生物制品、水环境等中都有猪圆环病毒2型的存在。猪圆环病毒2型病毒株可以发生基因型间和基因型内的同源重组(Zhaietal.，2014，VirologyJournal，11：88)。然而，这些研究中扩增猪圆环病毒2型的全基因组时，用到的扩增引物往往是多条引物，这往往会导致人为的同源重组产生，同时，也不利于不同来源猪圆环病毒2型全基因组序列的快速扩增与获取。
基于以上问题，公开一种快速、准确的猪圆环病毒2型全基因组序列快速扩增方法很有必要。
发明内容
本专利的目的在于运用分子生物学、生物信息学等方法进行引物设计、序列比对及反应体系优化，提供猪圆环病毒2型全基因组序列快速扩增方法及其扩增引物对。
本发明提供的猪圆环病毒2型全基因组序列快速扩增方法，其涉及的一对引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。
本发明还提供猪圆环病毒2型全基因组序列快速扩增方法，包括以下步骤：
(1)提取猪圆环病毒2型的DNA；
(2)用SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的引物对猪圆环病毒2型全基因组序列进行PCR扩增；
(3)目的片段的回收、连接、转化、阳性菌的鉴定及测序；
(4)利用DNAStar等生物信息学软件对所测定的序列进行比对分析、序列拼接，获到猪圆环病毒2型得全基因组序列。
其中，所述的50μLPCR反应体系包括：2×PCRMix(北京天根公司)25μL，上下游引物各1μL，病毒DNA5μL，灭菌ddH2O18mL；
其中，所述的PCR反应程序包括：94℃预变性2min，35个循环(94℃变性20s，63℃退火20s，68℃延伸3min)，68℃再延伸5min。
本发明将猪圆环病毒2型基因组序列分为1个片段扩增，将扩增的PCR片段克隆到pGM-T载体上进行核酸测序。本发明可以在2个小时内(仅117分钟)快速有效地扩增出目的片段，有利于研究猪圆环病毒2型的遗传进化、分子流行病学及感染性克隆等。
附图说明
图1所示为扩增猪源猪圆环病毒2型的琼脂糖凝胶电泳图片。M：DNAMarker2000；1：猪源猪圆环病毒2型毒株；2：阴性；
图2所示为扩增水牛源猪圆环病毒2型的琼脂糖凝胶电泳图片。M：DNAMarker2000；1：水牛源猪圆环病毒2型毒株；2：阴性；
图3所示为扩增褐家鼠源猪圆环病毒2型的琼脂糖凝胶电泳图片。M：DNAMarker2000；1：阴性；2：褐家鼠源猪圆环病毒2型毒株；
图4所示为猪圆环病毒2型各基因型的遗传进化树。其中，Buffalo1、Buffalo2和Buffalo3是水牛源猪圆环病毒2型病毒株；RN1和RN2是褐家鼠源猪圆环病毒2型病毒株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，其操作步骤会进一步明确。
优化实施例：
(1)病毒DNA抽提
取经过PCR鉴定为猪圆环病毒2型阳性的水牛和褐家鼠样本，进行研磨、组织匀浆，1∶2进行稀释，反复冻融3次，按照病毒DNA提取试剂盒(Axygen公司)进行DNA抽提，最后，用50～100μLRNase-free双蒸水进行DNA洗脱，保存于-20℃冰箱；
(2)引物设计与合成
通过猪圆环病毒2型多个基因型全基因组序列的比对，应用PrimerPremier5.0软件设计1对引物(苏州金唯智生物科技有限公司化学合成)，具体引物序列如表1所示。“F”代表正向引物，“R”代表反向引物。
表1引物信息
(3)PCR扩增
猪圆环病毒2型全基因组进行一次扩增，引物如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。50μLPCR反应体系包括：2×PCRMix(北京天根公司)25μL，上下游引物各1μL，病毒DNA5μL，灭菌ddH2O18mL；
PCR反应程序包括：94℃预变性2min，35个循环(94℃变性20s，63℃退火20s，68℃延伸3min)，68℃再延伸5min。
(4)目的基因片段的回收
PCR胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，具体回收方法如下：
①.柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。②.估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀(无需去除石蜡油或矿物油)。③.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。④.向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。⑤.重复操作步骤④。⑥.将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。⑦.将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(～13,400×g)离心2min收集DNA溶液。
(5)将目的基因片段连接到pGM-T载体上：
具体操作方法如下：在0.2mlPCR管中加入目的DNA3μl，10×T4DNA连接酶1μl，pGM-T克隆载体1μl，ddH2O5μl，轻轻混匀，于22℃连接1-2h。反应结束后，将管置于冰上冷却。
(6)连接产物的转化
取5μL连接产物加到50-100μLTOP10感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min；然后将离心管置于42℃水浴90sec，取出管后立即置于冰浴中放置2-3min，其间不要摇动离心管；向离心管中加入250-500μL37℃预热的LB(不含抗生素)培养基，150rpm，37℃振荡培养1h。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏；将离心管中的菌液混匀，吸取100μL加到含氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻地将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16h；将得到的白色菌落接种到4mLLB液体培养基中，37℃摇床振荡培养12-16h，保存菌种后，待质粒提取。
(7)阳性质粒的鉴定
取少许质粒进行PCR扩增，见(3)描述。
(8)序列测定
对鉴定为阳性的质粒，送北京六合华大基因科技股份有限公司广州测序部进行测序。
(9)序列拼接
使用DNAStar软件中的SeqMan程序，将测序结果进行序列拼接、编辑及校正。同时，结合测序峰图对不同批次的测序结果进行碱基校对，最终获得水牛源和褐家鼠源猪圆环病毒2型全基因组(1768bp或1767bp)。
PCR的特异性试验
以优化好的PCR反应体系及条件，对猪圆环病毒2型、猪博卡病毒1型、2型、3型、伪狂犬病毒、猪蓝耳病病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪细环病毒等进行PCR扩增，来检测该方法的特异性。结果仅有猪圆环病毒2型出现阳性结果，如表2所示。
表2PCR的特异性试验
PCV2 PBoV1 PBoV2 PBoV3 PRV PRRSV PPV CSFV JEV TTSuV
(+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
表2所示为用于扩增猪圆环病毒2型全基因组PCR方法的特异性实验结果。PCV2：猪圆环病毒2型；PBoV1：猪博卡病毒1型；PBoV2：猪博卡病毒2型；PBoV3：猪博卡病毒3型；PRV：伪狂犬病毒；PRRSV：猪蓝耳病病毒；PPV：猪细小病毒；CSFV：猪瘟病毒；JEV：乙型脑炎病毒；TTSuV：猪细环病毒；+：阳性；-：阴性；
PCR的敏感性试验
测定一株猪圆环病毒2型阳性重组质粒的模板浓度为95.6μg/ml，然后进行倍比稀释，来测定该方法的敏感性，最小可检测浓度达到95.6pg/ml，如表3所示。
表3扩增猪圆环病毒2型全基因组PCR方法的敏感性实验结果
95.6μg/ml 9.56μg/ml 956ng/ml 95.6ng/ml 9.56ng/ml 956pg/ml 95.6pg/ml 9.56pg/ml
(++++) (++++) (++++) (+++) (+++) (++) (+) (-)

Claims (4)

1.一种快速扩增猪圆环病毒2型全基因组序列的PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取猪圆环病毒2型的DNA；
(2)配置50μLPCR反应体系，用引物对猪圆环病毒2型全基因组序列进行PCR扩增；
(3)目的片段的回收、连接、转化、阳性菌的鉴定及测序；
(4)利用DNAStar等生物信息学软件对所测定的序列进行比对分析，得到猪圆环病毒2型全基因组序列。
2.如权利要求1所述的PCR方法，所述引物的序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：50μLPCR反应体系包括：2×PCRMix25μL，上下游引物各1μL，病毒DNA5μL，灭菌ddH2O18mL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：PCR扩增包括：94℃预变性2min，35个循环(94℃变性20s，63℃退火20s，68℃延伸3min)，68℃再延伸5min。
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