CN103088039B - 一种猪流行性腹泻病毒s基因抗原表位的扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，包括1）提取病毒RNA；2）RT-PCR扩增；3）套式PCR扩增；4）PCR产物的克隆及测序分析等步骤。扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的S部分基因，扩增片段长782bp(位于S基因的1316bp-2097bp)，并且包含位于S基因1495bp-1914bp之间的中和抗原表位，实现能扩增在vero细胞上培养的不同代次的PEDV种毒的S基因，捕捉到了猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中S基因，特别是中和抗原表位的序列变化，从而能了解其与PEDV免疫效力变化的相关性。
Description
技术领域
本发明涉及猪流行性腹泻病毒技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征，各种年龄的猪均易感。猪流行性腹泻病毒（PEDV）的S基因全长4150bp，由其编码的S蛋白位于病毒粒子表面。PEDV的S基因存在中和抗原表位，在S基因的1495bp-1914bp(420bp)之间。
刘邓等人在《猪流行性腹泻病毒CH/ZJ分离株S基因的克隆、原核表达和疫苗原性分析》（黑龙江畜牧兽医,2010,.2:9-12）中从猪流行性腹泻病毒CH/ZJ分离株中扩增出长966bp（61bp-1026bp）的S部分基因，但是该序列不包含位于S基因1495bp-1914bp之间的中和抗原表位。姜艳平等人在《猪流行性腹泻病毒S基因片段的原核表达及其表达产物的反应原性》（中国兽医科学,2009,39(07):602-607）从猪流行性腹泻病毒地方流行株LJB/03中扩增出了长420bp的PEDV中和抗原表位。但是这两种扩增方法均未说明是否能扩增出不同培养代次包括高代次的PEDV的S基因。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的S部分基因，扩增片段长782bp(位于S基因的1316bp-2097bp)，并且包含位于S基因1495bp-1914bp之间的中和抗原表位，实现能扩增在vero细胞上培养的不同代次的PEDV种毒的S基因，以捕捉到猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中S基因，特别是中和抗原表位的序列变化，从而了解其与PEDV免疫效力变化的相关性。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其包括以下步骤：
1）提取病毒RNA：原病料经12000rpm离心5分钟后取上清液或者细胞培养液-20℃反复冻融2-3次，然后采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0提取病毒RNA；
2）RT-PCR扩增：设计引物SEQ ID NO:1和引物SEQ ID NO:2，采用TaKaRa PrimeScript one step RT-PCR Kit Ver.2进行扩增；
3）套式PCR扩增：设计引物SEQ ID NO:3和引物SEQ ID NO:4，对步骤2中的RT-PCR扩增产物采用TaKaRa Premix Taq Version 2.0扩增；
4）PCR产物的克隆及测序分析：采用BIOMIGA Gel/PCR Extraction Kit进行PCR产物的纯化；将纯化的PCR产物连接到pMD20-T Vector载体上；连接产物转化DH5α感受态细胞；筛选阳性克隆并进行测序。
步骤1）采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0提取病毒RNA顺次按以下步骤进行：
①取200μl病料处理液或冻融的细胞培养液放入1.5ml离心管中，加入200μl的Solution A,剧烈振荡混匀后，室温放置5分钟；
②加入75μl的Solution B，混合均匀后，12000rpm离心5分钟；
③将上清液转移到新的Collection Tube中，加250μl异丙醇，上下颠倒混匀；
④将试剂盒中的Spin column安置于另一新的Collection Tube上，将③中的上清液转移至Spin column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；
⑤将500μl的Rinse A加入至Spin column中，室温静置1分钟，12000rpm离心1分钟，弃滤液；
⑥将800μl的Rinse B加入至Spin column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；
⑦再次进行12000rpm离心1分钟；
⑧将Spin column安置于新的1.5ml离心管上，在Spin column膜的中央处加入50μl的灭菌蒸馏水或者Elution Buffer,室温静置1分钟；
⑨12000rpm离心1分钟洗脱病毒RNA，提取的病毒RNA立即用于后续试验或-20℃保存。
步骤2）中RT-PCR反应体系为
PrimeScript one step enzyme Mix 1μl
2×1 step buffer 12.5μl
SEQ ID NO:1 (10μM) 2μl
SEQ ID NO:2 (10μM) 2μl
RNA样品 3μl
RNase Free dH2O 4.5μl；
反应程序为94℃预变性2min；94℃变性30s，53-54℃退火30s，72℃延伸1min，设置30个循环；72℃延伸7min；16℃保存。
步骤3）中套式PCR扩增反应体系为
Premix Taq 12.5μl
RT-PCR产物 1.5μl
SEQ ID NO:3 (10μM) 2μl
SEQ ID NO:4 (10μM) 2μl
灭菌蒸馏水 7μl；
反应程序为94℃预变性2min；98℃变性10s，52-55℃退火30s，72℃延伸50s，设置30个循环；72℃延伸7min；16℃保存。
步骤4）中，所述PCR产物的纯化具体步骤如下：
①取100-200μl的PCR产物，加入2倍体积的Buffer GC，混合均匀，瞬时离心，将溶液收集到底部；
②将以上混合液加入带有收集管的吸附柱中，室温下，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中；重复步骤②，直至剩余的混合液全部通过吸附柱；
③加入650μL DNA Wash Buffer至吸附柱下，室温下，13000rpm离心30秒，弃去流出液；重复步骤③；
④室温下，13000rpm，将吸附柱开盖离心2分钟，去除残留的乙醇；
⑤转移吸附柱至1.5ml收集管中，加入30-50μl 60℃预热的Elution Buffer或灭菌蒸馏水到吸附柱膜中央，室温放置1分钟，13000rpm离心1分钟，洗脱DNA，将洗脱液加回到吸附柱中重新洗脱一次，洗脱的DNA立即用于后续试验或-20℃保存。
步骤4）中，将纯化的PCR产物连接到pMD20-T Vector载体上具体步骤如下：
①在1.5ml离心管中配制下列溶液，全量为5μl；
pMD20-T Vector 1μl
PCR纯化产物 2μl
蒸馏水 2μl
②加入5μl的SolutionⅠ；
③16℃反应30分钟；
④洗脱的DNA与pMD20-T Vector的连接产物-20℃保存。
步骤4）中，连接产物转化DH5α感受态细胞顺次按以下步骤进行：
①取3μl连接产物放入100μl DH5α感受态细胞悬液中，轻轻混匀；
②冰上放置20-30分钟，然后42℃水浴热激90秒，迅速冰上冷却2分钟；
③立即加入0.8mlLB液体培养基，摇匀后于37℃150-180rpm振荡培养45-60分钟；
④取培养液200μl接种于含有100μg//ml氨苄青霉素的LB平板培养基上，用玻璃涂棒涂匀；
⑤倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养14-16小时。
步骤4）中，筛选阳性克隆并进行测序顺次按以下步骤进行：
①挑取培养皿上的单个菌落，每个单菌落接种于2ml含100μg//ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃180-200rpm振荡培养14-16小时；
②采用引物SEQ ID NO:3和引物SEQ ID NO:4， 用TaKaRa Premix Taq Version 2.0 PCR鉴定阳性克隆，
反应体系为：
Premix Taq 12.5μl
菌液 4μl
SEQ ID NO:3 (10μM) 2μl
SEQ ID NO:4 (10μM) 2μl
灭菌蒸馏水 4.5μl；
反应程序为： 94℃预变性5min；98℃变性10s，52-55℃退火30s、72℃延伸50s，设置30个循环； 72℃延伸7min；16℃保存；
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，出现782bp大小的条带的为阳性克隆菌液，对阳性菌进行序列测定。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1．本发明能扩增PEDV不同培养代次，包括原病料、在vero细胞上培养的F15代、F30代、F60代甚至更多代次的S基因；
2．本发明所扩增的片段长782bp，包含位于PEDV S基因1495bp-1914bp之间的抗原表位；
3. 通过该方法可以捕捉到猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中S基因，特别是中和抗原表位的序列变化，从而达到了了解其与PEDV免疫效力变化的相关性的目的。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明的原病料病毒RNA和病毒RNA在vero细胞上培养的第15代、第30代、第60代毒的RNA分别用外围引物扩增后的产物琼脂糖凝胶电泳图；
M：DL2000；1：原病料RNA RT-PCR产物，目的片段为920bp；2-4：分别为病毒在vero细胞上培养第15代、第30代、第60代毒的RNA RT- PCR结果；5：原病料套式PCR产物，目的片段为782bp；6-8：分别为病毒在vero细胞上培养第15代、第30代、第60代毒的套式PCR产物，片段为782bp。
具体实施方式
实施例1
一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其包括以下步骤：
1）提取病毒RNA：猪的水样粪便经12000rpm离心5分钟后取上清液或者细胞培养液-20℃反复冻融2-3次，然后采用Ta Ka Ra mini BEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0(DV819A)提取病毒RNA；
采用TaKaRa mini BEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0 (DV819A)提取病毒RNA顺次按以下步骤进行：
①取200μl病料处理液或冻融的细胞培养液放入1.5ml离心管中，加入200μl的Solution A,剧烈振荡混匀后，室温放置5分钟；
②加入75μl的Solution B，混合均匀后，12000rpm离心5分钟；
③将上清液转移到新的Collection Tube(2ml，试剂盒中提供)中，加250μl异丙醇（含有1%冰乙酸），上下颠倒混匀；
④将试剂盒中的Spin column安置于另一新的Collection Tube(2ml，试剂盒中提供)上，将③中的上清液转移至Spin column中,12000rpm离心1分钟，弃滤液；
⑤将500μl的Rinse A加入至Spin column中，室温静置1分钟，12000rpm离心1分钟，弃滤液；
⑥将800μl的Rinse B加入至Spin column中,12000rpm离心1分钟，弃滤液；
⑦再次进行12000rpm离心1分钟；
⑧将Spin column安置于新的1.5ml离心管上，在Spin column膜的中央处加入50μl的灭菌蒸馏水或者Elution Buffer,室温静置1分钟；
⑨12000rpm离心1分钟洗脱病毒RNA。提取的病毒RNA立即用于后续试验或-20℃保存。
2）RT-PCR扩增：设计引物SEQ ID NO:1（P1：5-ATGGCACTGACGATGACG-3）和引物SEQ ID NO:2（P2：5-AAGAAACCAGGCAACTCC-3），采用TaKaRa PrimeScript one step RT-PCR Kit Ver.2（DRR055A）进行扩增；
RT-PCR反应体系为
PrimeScript one step enzyme Mix 1μl
2×1 step buffer 12.5μl
SEQ ID NO:1 (10μM) 2μl
SEQ ID NO:2 (10μM) 2μl
RNA样品 3μl
RNase Free dH2O 4.5μl；
反应程序为94℃预变性2min；94℃变性30s，53-54℃退火30s，72℃延伸1min，设置30个循环；72℃延伸7min；16℃保存。
3）套式PCR扩增：设计引物SEQ ID NO:3（P3：5-GGACCGTAGCA TCGACTA-3）和引物SEQ ID NO:4（P4：5-TGGCGTAACAGAATAAACAG-3），对步骤2中的RT-PCR扩增产物采用TaKaRa Premix Taq Version 2.0(D334S)扩增；
PCR扩增反应体系为
Premix Taq 12.5μl
RT-PCR产物 1.5μl
SEQ ID NO:3 (10μM) 2μl
SEQ ID NO:4 (10μM) 2μl
灭菌蒸馏水 7μl；
反应程序为94℃预变性2min；98℃变性10s，52-55℃退火30s，72℃延伸50s，设置30个循环；72℃延伸7min；16℃保存。
4）PCR产物的克隆及测序分析
采用BIOMIGA Gel/PCR Extraction Kit进行PCR产物的纯化，具体步骤如下：
①取100-200μl的PCR产物，加入2倍体积的Buffer GC，混合均匀，瞬时离心，将溶液收集到底部；
②将以上混合液（每次不超过700μl）加入带有收集管的吸附柱中，室温下，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中；重复步骤②，直至剩余的混合液全部通过吸附柱；
③加入650μL DNA Wash Buffer至吸附柱下，室温下，13000rpm离心30秒，弃去流出液；重复步骤③；
④室温下，13000rpm，将吸附柱开盖离心2分钟，去除残留的乙醇；
⑤转移吸附柱至1.5ml收集管中，加入30-50μl 60℃预热的Elution Buffer或灭菌蒸馏水到吸附柱膜中央，室温放置1分钟，13000rpm离心1分钟，洗脱DNA，将洗脱液加回到吸附柱中重新洗脱一次，洗脱的DNA立即用于后续试验或-20℃保存；
将纯化的PCR产物连接到pMD20-T Vector载体上，具体步骤如下：
①在1.5ml离心管中配制下列溶液，全量为5μl；
pMD20-T Vector 1μl
PCR纯化产物 2μl
蒸馏水 2μl
②加入5μl的SolutionⅠ；
③16℃反应30分钟；
④洗脱的DNA与pMD20-T Vector的连接产物-20℃保存；
连接产物转化DH5α感受态细胞；筛选阳性克隆并进行测序，具体步骤如下：
①取3μl连接产物放入100μl DH5α感受态细胞悬液中，轻轻混匀；
②冰上放置20-30分钟，然后42℃水浴热激90秒，迅速冰上冷却2分钟；
③立即加入0.8mlLB液体培养基，摇匀后于37℃150-180rpm振荡培养45-60分钟；
④取培养液200μl接种于含有100μg//ml氨苄青霉素的LB平板培养基上，用玻璃涂棒涂匀；
⑤倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养14-16小时。
筛选阳性克隆并进行测序顺次按以下步骤进行：
①挑取培养皿上的单个菌落（4-6个），每个单菌落接种于2ml含100μg//ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃180-200rpm振荡培养14-16小时；
②采用引物SEQ ID NO:3（P3：5-GGACCGTAGCATCGACTA-3）和引物SEQ ID NO:4（P4：5-TGGCGTAACAGAATAAACAG-3），用TaKaRa Premix Taq Version 2.0(D334S) PCR鉴定阳性克隆，
反应体系为：
Premix Taq 12.5μl
菌液 4μl
SEQ ID NO:3 (10μM) 2μl
SEQ ID NO:4 (10μM) 2μl
灭菌蒸馏水 4.5μl；
反应程序为： 94℃预变性5min；98℃变性10s，52-55℃退火30s、72℃延伸50s，设置30个循环； 72℃延伸7min；16℃保存；
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，出现782bp大小的条带的为阳性克隆菌液，对阳性菌进行序列测定，测定序列为SEQ ID NO:5。
实施例2
将实施例1中提取病毒RNA在vero细胞上培养的第15代，按照与实施例1相同的步骤扩增出782bp的目的片段(包含S基因1495bp-1914bp之间的中和抗原表位序列)，测定序列为SEQ ID NO:6。
实施例3
将实施例1中提取病毒RNA在vero细胞上培养的第30代，按照与实施例1相同的步骤扩增出782bp的目的片段(包含S基因1495bp-1914bp之间的中和抗原表位序列)，测定序列为SEQ ID NO:7。
实施例4
将实施例1中提取病毒RNA在vero细胞上培养的第60代，按照与实施例1相同的步骤扩增出782bp的目的片段(包含S基因1495bp-1914bp之间的中和抗原表位序列)，测定序列为SEQ ID NO:8。
图1的电泳结果说明本发明的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法能扩增出猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上培养的F15、F30、F60代毒的S部分基因。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
〈110〉广东大华农动物保健品股份有限公司；肇庆大华农生物药品有限公司
〈120〉一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法
〈130〉
〈160〉 10
〈170〉 PatentIn version 3.5
〈210〉 1
〈211〉 18
〈212〉 PRT
〈213〉 artificial
〈400〉 1
ATGGC ACTGA CGATG ACG 18
〈210〉 2
〈211〉 18
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial
〈400〉 2
AAGAA ACCAG GCAAC TCC 18
〈210〉 3
〈211〉 18
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial
〈400〉 3
GGACC GTAGC ATCGA CTA 18
〈210〉 4
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial
〈400〉 4
TGGCG TAACA GAATA AACAG 20
〈210〉 5
〈211〉 782
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial
〈400〉 5
GGACCGTAGC ATCGACTAAT TTTGTTGATG CACTTATCGA AGTTCAAGGA ACTGCCATTC 60
AGCGTATTCT TTATTGTGAT GATCCTGTTA GCCAACTCAA GTGTTCTCAG GTTGCTTTTG 120
ACCTTGACGA TGGTTTCTAC CCTATTTCTT CTAGAAACCT TCTGAGTCAT GAACAGCCAA 180
TTTCTTTTGT TACTTTGCCA TCATTTAATG ATCATTCTTT TGTTAACATT ACTGTCTCTG 240
CGTCCTTTGG TGGTCATAGT GGTGCCAACC TTATTGCATC TGACACTACT ATCAATGGGT 300
TTAGTTCTTT CTGTGTTGAC ACTAGACAAT TTACCATTTC ACTGTTTTAT AACGTTACAA 360
ACAGTTATGG TTATGTGTCT AAATCACAGG ACAGTAATTG CCCTTTCACC TTGCAATCTG 420
TTAATGATTA CCTGTCTTTT AGTAAATTTT GTGTTTCCAC CAGCCTTTTG GCTAGTGCCT 480
GTACCATAGA TCTTTTTGGT TACCCTGAGT TTGGTAGTGG TGTTAAGTTT ACGTCCCTTT 540
ACTTTCAATT CACAAAGGGT GAGTTGATTA CTGGCACGCC TAAACCACTT GAAGGTGTCA 600
CGGACGTTTC TTTTATGACT CTGGATGTGT GTACCAAGTA TACTATCTAT GGCTTTAAAG 660
GTGAGGGTAT CATTACCCTT ACAAATTCTA GCTTTTTGGC AGGTGTTTAT TACACATCTG 720
ATTCTGGACA GTTGTTAGCC TTTAAGAATG TCACTAGTGG TGCTGTTTAT TCTGTTACGC 780
CA
〈210〉 6
〈211〉 782
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial
〈400〉 6
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TTTCTTTTGT TACTTTGCCA TCATTTAATG ATCATTCTTT TGTTAACATT ACTGTCTCTG 240
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CA
〈210〉 7
〈211〉 782
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial
〈400〉 7
GGACCGTAGC ATCGACTAAT TTTGTTGATG CACTTATCGA AGTTCAAGGA ACTGCCATTC 60
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ACCTTGACGA TGGTTTCTAC CCTATTTCTT CTAGAAACCT TTTGAGTCAT GAACAGCCAA 180
TTTCTTTTGT TACTTTGCCA TCATTTAATG ATCATTCTTT TGTTAACATT ACTGTCTCTG 240
CGTCCTTTGG TGGTCGTAGT GGTGCCAACC TTATTGCATC TGACACTACT ATCAATGGGT 300
TTAGTTCTTT CTGTGTTGAC ACTAGACAAT TTACCATTTC ACTGTTTTAT AACGTTACAA 360
ACAGTTATGG TTATGTGTCT AACTCACAGG ACAGTAATTG CCCTTTCACC TTGCAATCTG 420
TTAATGATTA CCTGTCTTTT AGTAAATTTT GTGTTTCCAC CAGCCTTTTG GCTAGTGCCT 480
GTACCATAGA TCTTTTTGGT TACCCTGAGT TTGGTAGTGG AGTTAAGTTT ACGTCCCTTT 540
ACTTTCAATT CACAAGGGGT GAGTTGATTA CTGGCACGCC TAAACCACTT GAAGGTGTCA 600
CGGACGTTTC TTTTATGACT CTGGATGTGT GTACCAAGTA TACTATCTAT GGCTTTAAAG 660
GTGAGGGTAT CATTACCCTT ATAAATTCTA GCTTTTTGGC AGGTGTTTAT TACACATCTG 720
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CA
〈210〉 8
〈211〉 782
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial
〈400〉 8
GGACCGTAGC ATCGACTAAT TTTGTTGATG CACTTATCGA AGTTCAAGGA ACTGCCATTC 60
AGCGTATTCT TTATTGTGAT GATCCTGTTA GCCAACTCAA GTGTTCTCAG GTTGCTTTTG 120
ACCTTGACGA TGGTTTCTAC CCTATTTCTT CTAGAAACCT TTTGAGTCAT GAACAGCCAA 180
TTTCTTTTGT TACTTTGCCA TCATTTAATG ATCATTCTTT TGTTAACATT ACTGTCTCTG 240
CGTCCTTTGG TGGTCGTAGT GGTGCCAACC TTATTGCATC TGACACTACT ATCAATGGGT 300
TTAGTTCTTT CTGTGTTGAC ACTAGACAAT TTACCATTTC ACTGTTTTAT AACGTTACAA 360
ACAGTTATGG TTATGTGTCT AACTCACAGG ACAGTAATTG CCCTTTCACC TTGCAATCTG 420
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CGGACGTTTC TTTTATGACT CTGGATGTGT GTACCAAGTA TACTATCTAT GGCTTTAAAG 660
GTGAGGGTAT CATTACCCTT ATAAATTCTA GCTTTTTGGC AGGTGTTTAT TACACATCTG 720
ATTCTGGACA GTTGTTAGCC TTTAAGAATG TCACTAGTGG TGCTGTTTAT TCTGTTACGC 780
CA
Claims (1)
1.一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于其包括以下步骤：
1）提取病毒RNA：原病料经12000rpm离心5分钟后取上清液获得细胞培养液，-20℃反复冻融2-3次，然后采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0提取病毒RNA；
2）RT-PCR扩增：设计引物SEQ ID NO:1和引物SEQ ID NO:2，采用TaKaRa PrimeScript one step RT-PCR Kit Ver.2进行扩增；
3）套式PCR扩增：设计引物SEQ ID NO:3和引物SEQ ID NO:4，对步骤2中的RT-PCR扩增产物采用TaKaRa Premix Taq Version 2.0扩增；
4）PCR产物的克隆及测序分析：采用BIOMIGA Gel/PCR Extraction Kit进行PCR产物的纯化；将纯化的PCR产物连接到pMD20-T Vector载体上；连接产物转化DH5α感受态细胞；筛选阳性克隆并进行测序。
2. 根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于步骤1）采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0提取病毒RNA顺次按以下步骤进行：
①取200μl冻融的细胞培养液放入1.5ml离心管中，加入200μl的Solution A，剧烈振荡混匀后，室温放置5分钟；
②加入75μl的Solution B，混合均匀后，12000rpm离心5分钟；
③将上清液转移到新的Collection Tube中，加250μl异丙醇，上下颠倒混匀；
④将试剂盒中的Spin column安置于另一新的Collection Tube上，将③中的上清液转移至Spin column中,12000rpm离心1分钟，弃滤液；
⑤将500μl的Rinse A加入至Spin column中，室温静置1分钟，12000rpm离心1分钟，弃滤液；
⑥将800μl的Rinse B加入至Spin column中,12000rpm离心1分钟，弃滤液；
⑦再次进行12000rpm离心1分钟；
⑧将Spin column安置于新的1.5ml离心管上，在Spin column膜的中央处加入50μl的灭菌蒸馏水或者Elution Buffer,室温静置1分钟；
⑨12000rpm离心1分钟洗脱病毒RNA，提取的病毒RNA立即用于后续试验或-20℃保存。
3. 根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于：步骤2）中RT-PCR反应体系为
PrimeScript one step enzyme Mix 1μl
2×1 step buffer 12.5μl
10μM SEQ ID NO:1 2μl
10μM SEQ ID NO:2 2μl
RNA样品 3μl
RNase Free dH2O 4.5μl；
反应程序为94℃预变性2min；94℃变性30s，53-54℃退火30s，72℃延伸1min，设置30个循环；72℃延伸7min；16℃保存。
4. 根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于：步骤3）中套式PCR扩增反应体系为
Premix Taq 12.5μl
RT-PCR产物 1.5μl
10μM SEQ ID NO:3 2μl
10μM SEQ ID NO:4 2μl
灭菌蒸馏水 7μl；
反应程序为94℃预变性2min；98℃变性10s，52-55℃退火30s，72℃延伸50s，设置30个循环；72℃延伸7min；16℃保存。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于步骤4）中，所述PCR产物的纯化具体步骤如下：
①取100-200μl的PCR产物，加入2倍体积的Buffer GC，混合均匀，瞬时离心，将溶液收集到底部；
②将以上混合液加入带有收集管的吸附柱中，室温下，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中；重复步骤②，直至剩余的混合液全部通过吸附柱；
③加入650μL DNA Wash Buffer至吸附柱下，室温下，13000rpm离心30秒，弃去流出液；重复步骤③；
④室温下，13000rpm，将吸附柱开盖离心2分钟，去除残留的乙醇；
⑤转移吸附柱至1.5ml收集管中，加入30-50μl 60℃预热的Elution Buffer或灭菌蒸馏水到吸附柱膜中央，室温放置1分钟，13000rpm离心1分钟，洗脱DNA，将洗脱液加回到吸附柱中重新洗脱一次，洗脱的DNA立即用于后续试验或-20℃保存。
6. 根据权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于步骤4）中，将纯化的PCR产物连接到pMD20-T Vector载体上具体步骤如下：
①在1.5ml离心管中配制下列溶液，全量为5μl；
pMD20-T Vector 1μl
PCR纯化产物 2μl
蒸馏水 2μl
②加入5μl的SolutionⅠ；
③16℃反应30分钟；
④洗脱的DNA与 pMD20-T Vector的连接产物-20℃保存。
7. 根据权利要求6所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于步骤4）中，连接产物转化DH5α感受态细胞顺次按以下步骤进行：
①取3μl连接产物放入100μl DH5α感受态细胞悬液中，轻轻混匀；
②冰上放置20-30分钟，然后42℃水浴热激90秒，迅速冰上冷却2分钟；
③立即加入0.8mlLB液体培养基，摇匀后于37℃150-180rpm振荡培养45-60分钟；
④取培养液200μl接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基上，用玻璃涂棒涂匀；
⑤倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养14-16小时。
8. 根据权利要求7所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于步骤4）中，筛选阳性克隆并进行测序顺次按以下步骤进行：
①挑取培养皿上的单个菌落，每个单菌落接种于2ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃180-200rpm振荡培养14-16小时；
②采用引物SEQ ID NO:3和引物SEQ ID NO:4，用TaKaRa Premix Taq Version 2.0 PCR鉴定阳性克隆，
反应体系为：
Premix Taq 12.5μl
菌液 4μl
10μM SEQ ID NO:3 2μl
10μM SEQ ID NO:4 2μl
灭菌蒸馏水 4.5μl；
反应程序为：94℃预变性5min；98℃变性10s，52-55℃退火30s、72℃延伸50s，设置30个循环；72℃延伸7min；16℃保存；
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，出现782bp大小的条带的为阳性克隆菌液，对阳性菌进行序列测定。
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