CN102102132A - 一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法，其步骤为：胃肠炎病毒总RNA的提取、引物设计、反转录、PCR扩增猪传染性胃肠炎病毒的S基因片段、猪传染性胃肠炎病毒的S基因的克隆与鉴定、标准品模板得制备、进行荧光定量PCR扩增，得动力学曲线及标准曲线，进行重复性、敏感性及特异性试验。本发明方法呈现出良好的S型扩增曲线，只出现扩增产物特异的单个峰，产物的Tm值均一；检测灵敏度可达3拷贝∕微升，具有很好的敏感性；该方法与其它病毒不发生交叉反应，具有良好的特异性；起始模板浓度与Ct值之间呈很好的线性关系，反应体系具有很高的精确度和良好的稳定性。

Description

一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法

技术领域

本发明属病毒检测领域，具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法。

背景技术

猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis of swine，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引发的一种高度接触传染性的肠道疾病，是引起仔猪腹泻的重要病毒性传染原。感染猪的主要临床症状有腹泻、脱水和呕吐，患病幼仔猪死亡率极高，可以达到100％，已成为重要的猪病毒性腹泻病之一，给养猪业造成巨大的经济损失。TGE属于世界动物卫生组织(OIE)法典中B类疫病中必检的猪传染病，是我国法定检疫的疫病。临床实际操作中对TGEV的诊断比较困难，因为经常存在混合感染和细菌继发感染而使临床症状复杂化，根据流行病学和临床症状，只能作出初步诊断，特别是不能有效地将TGEV与猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（PRV）及猪呼吸道冠状病毒（PRCV）进行鉴别。

目前检测TGEV的常规方法主要有病毒的分离鉴定、电镜观察、ELISA、免疫电镜观察、核酸探针杂交、免疫荧光抗体试验、普通RT-PCR、病毒中和试验、多重RT-PCR技术等，但是这些技术周期长，操作繁琐或者只能进行定性检测却不能定量分析，并且有时灵敏性不够。

发明内容

针对目前检测TGEV方法存在的问题，本发明目的在于提供一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案在于采用一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法，具体步骤如下：

1、一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法，其特征在于：所述的检测方法的具体步骤如下：

1）采用常规方法提取胃肠炎病毒总RNA；

2）引物设计：根据GenBank中发表的猪传染性胃肠炎病毒的S基因序列

(NC002306)，设计一对特异性引物，目的基因片段为250 bp，引物序列如下：

上游引物P1：5’-GTATTGGGATTATGCT-3’

下游引物P2：5’-GGTGGTGGTAGTAGGT-3’；

3）猪传染性胃肠炎病毒的S基因RT-PCR扩增

取胃肠炎病毒总RNA，加入反转录引物、5×RT Buffer、dNTP、RNasin inhibitor及反转录酶进行反转录得到cDNA；以反转录所得的cDNA为模板进行PCR扩增，得到猪传染性胃肠炎病毒的S基因片段，取 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，并纯化回收PCR产物；

4）猪传染性胃肠炎病毒的S基因的克隆与鉴定

将回收纯化后PCR产物与载体连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基中，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定；

5）标准品模板的制备

提取验证正确的阳性重组质粒，用紫外分光光度计测定阳性重组质粒的浓度，并计算基因模板拷贝数，将重组质粒进行10倍倍比梯度稀释，共做7个稀释度：10⁰， 10¹， 10²， 10³，10⁴， 10⁵，10⁶，将其作为标准品模板；

6）SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测

取标准品模板进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增，得到扩增动力学曲线及标准曲线；选取猪传染性胃肠炎病毒同一浓度的质粒标准品模板进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应，验证此方法的重复性与稳定性；

7）敏感性与特异性试验

将已计算出拷贝数的质粒做10倍倍比梯度稀释，进行敏感性试验；分别加入猪瘟病毒（HCV）、猪蓝耳病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）核酸作为阳性对照，同时设置阴性对照，验证此方法的特异性。

步骤3）所述的PCR扩增体系为：Premix Ex Taq 12 uL，浓度为0.5 umoL / L引物P1、P2各0.5 uL，cDNA 1 uL，最后用灭菌的双蒸水补至25 uL。

步骤3）所述的PCR扩增反应程序为：

（1）95℃预变性5 min；

（2） 95℃变性 50 s、48℃ 退火50 s、72℃ 延伸1 min，此步骤为一个循环，共 35个循环；

（3）72℃延伸10 min。

步骤6）所述的SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应体系为：上游引物0.5 uL，下游引物 0.5 uL，SYBR Premix Ex Taq^TMII 聚合酶10 ul，模板1 ul，灭菌去离子水8 ul。

步骤6）所述的SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应程序：

（1）95℃ 预变性5 min；

（2）95℃变性 10 s、56℃退火 15 s、72℃ 延伸15 s ，此步骤为一个循环，共45个循环；

当反应结束后先加热至95℃，然后再降至56℃，开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。

本发明的有益效果：

1、扩增曲线呈现出良好的S 型，只出现扩增产物特异的单个峰，产物的T m 值都在87.7-88.5℃之间，说明没有引物二聚体及非特异性扩增产物出现；

2、检测灵敏度可达3拷贝∕微升，且具有很好的重复性；

3、该方法与对照组的HCV，PRRSV，PRV，PCV，PPV，JEV不发生交叉反应，具有良好的特异性；

4、该方法起始模板浓度与Ct值之间呈很好的线性关系，Ct值为13.42～25.04，标准曲线斜率为-2.932，相关系数R2为0.9845，说明此反应体系具有很高的精确度和良好的稳定性；

5、与常规PCR 相比较，不但可以定性检测TGEV，也可以定量检测TGEV，而且能够检测出常规PCR无法检测的病料，同时也免去了DNA水平电泳的步骤，更加省时，且操作简单。

附图说明

图1 为TGEV实时定量PCR扩增动力学曲线；

图2 为TGEV实时定量PCR标准曲线；

图3 为TGEV实时定量PCR扩增产物溶解曲线；

图4 为TGEV 实时定量PCR度重复性试验扩增动力学曲线；

图5 为TGEV实时定量PCR特异性试验扩增动力学曲线。

具体实施方式

实施例1  胃肠炎病毒总RNA提取

取增殖的猪传染性胃肠炎病毒液400 uL，加入400 ul的Trizol，剧烈振荡1-2 min，使其充分混匀；加入100 ul氯仿/异戊醇（24：1），剧烈振荡混匀30 s，12 000 rpm离心5 min；将上清液小心转移到无菌EP管中，加入200 ul 无水乙醇，混匀；将上述溶液全部转移到放于2 ml的收集管内的GenClean柱中，室温放置2 min，8 000 rpm离心1 min；小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管；在柱子上加入450 ul RPE solution（漂洗液加5倍无水乙醇），10 000 rpm，室温离心30 s；倒掉废液，重复洗涤一次，小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，12 000 rpm 室温离心3 min；将柱子放入新EP管，加DEPC（预先预热）20 ul于柱中；封口膜封口，水浴70℃ 2-3 min，12 000 rpm 1 min 即得到胃肠炎病毒总RNA样品，用紫外分光光度计测定其0D260值及0D280值，计算出0D260/0D280为1.9， 测得样品的浓度为4 ug/ul，取5ul提取总RNA，用DEPC水稀释成0.2ug/ul。

实施例2  设计引物

根据GenBank中发表的猪传染性胃肠炎病毒的S基因序列（NC002306）， 应用Primer Premier 5.0软件设计一对引物，用设计的引物可扩增S基因部分片段（TGEV-S）250 bp，引物序列如下：

上游引物p1：5’-GTATTGGGATTATGCT-3’

下游引物p2：5’-GGTGGTGGTAGTAGGT-3’；

引物由上海生物工程技术有限公司合成。

实施例3  猪传染性胃肠炎病毒的S基因RT-PCR扩增

取5ul RNA样品加DEPC水补足11ul，然后加入反转录引物1 ul 70℃水浴10 min，后迅速置冰上5 min，稍离心；取出依次加入5×Buffer 4 ul，dNTP 2 ul，RNasinhibiter 1 ul，瞬时离心；42℃水浴2 min，快速加入1 ul反转录酶，封口膜封好；42℃水浴60 min，转至70℃水浴15 min，反转录结束；取反转录所得的cDNA为模板进行PCR扩增，

PCR扩增体系为：Premix Ex Taq 12 ul，浓度为0.5 umoL / L引物P1、P2各0.5 uL，cDNA 1 ul，最后用灭菌的双蒸水补至25 ul；

PCR扩增反应程序为：

（1）95℃预变性5 min；

（2） 95℃变性 50 s、48℃ 退火50 s、72℃ 延伸1 min，此步骤为一个循环，共 35个循环；

（3）72℃延伸10 min；

     取5 ul PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，结果显示扩增出一条片段大小为250bp特异性条带，按DNA凝胶回收试剂盒说明书回收PCR产物。

实施例4猪传染性胃肠炎病毒的S基因的克隆与鉴定

（1）将回收纯化后PCR产物与pGEM-T Easy载体相连，连接反应体系为：

2×buffer                                         5.0 ul

纯化PCR产物                              3.0 ul

pGEM-T Easy vector                    0.5 ul

ddH2O                                           0.5 ul

T4 DNA Ligase                             1.0 ul

总体积                                           10 ul

将上述反应体系混匀后4℃连接过夜，连接产物直接用于转化；

（2）取100 ul DH5α感受态细胞，加入连接产物5 ul，冰浴30 min，42℃热休克90 sec，冰浴15 min，加入950 ul不含抗生素的LB液体培养基，37℃ 250r/min振荡培养45 min，8000 rpm离心5 min，弃上清液，加入200 ul液体培养基重悬沉淀，再加入42 ul IPTG（20 mg/mL）和42  ul X-gal（20 mg/mL），混匀，均匀涂布于含50 ug/mL Amp的LB固体平板上，37℃培养12 h；

（3）挑选单菌落，接入含50 ug/mL Amp的LB液体培养基中，37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒（北京博大泰克生物公司），提取质粒，以提取的质粒为模板进行PCR鉴定，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，取PCR验证正确的阳性质粒送上海生物工程有限公司测序鉴定，将测序验证正确的重组质粒命名为pGEM-TGEV。

实施例5标准品模板的制备

挑选测序验证正确的阳性克隆，接入含50 ug/mL Amp的LB液体培养基中，37℃过夜培养，用碱裂解法提取重组质粒pGEM-TGEV，用紫外分光光度计检测并计算质粒浓度，按下面公式计算拷贝数：

经计算得pGEM-TGEV浓度为3×10¹⁰copies/??L，根据得到的结果，将重组质粒进行10倍倍比梯度稀释，得浓度为3×10⁶，3×10⁵，3×10⁴，3×10³，3×10²，3×10¹，3×10⁰拷贝数/微升的重组质粒，将其作为标准品模板；

实施例6  SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测

（1）分别取浓度为3×10⁶，3×10⁵，3×10⁴，3×10³，3×10²，3×10¹，3×10⁰拷贝数/微升的重组质粒为模板进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增，得到扩增动力学曲线、标准曲线，如图1及图2所示，标准曲线的相关系数为0.9845，斜率为-2.932，

其中PCR扩增反应体系为：上游引物0.5 uL，下游引物 0.5 uL，SYBR Premix Ex Taq^TM II 聚合酶10 ul，模板1 ul，灭菌去离子水8 ul；

PCR反应程序为：

（1）95℃ 预变性5 min；

（2）95℃变性 10 s、56℃退火 15 s、72℃ 延伸15 s ，此步骤为一个循环，共45个循环；

当反应结束后先加热至95℃，然后再降至56℃，开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，如图3所示，标准品的溶解温度都在87.7-88.5℃之间；

（2）选取猪传染性胃肠炎病毒同一浓度的质粒标准品模板进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应，验证此方法的重复性与稳定性，结果显示如图4所示，两次试验所得的S曲线相似，其Ct值相同，说明本方法具有很好的重复性与稳定性；

（3）将已计算出拷贝数的质粒做10倍倍比梯度稀释，进行敏感性试验，试验结果显示，浓度为3拷贝∕微升时，仍可以得到S型荧光曲线；

（4）SYBR GreenⅠ实时定量PCR体系中分别加入猪瘟病毒（HCV）、猪蓝耳病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）核酸作为阳性对照，同时以水作为阴性对照，验证此方法的特异性，试验结果如图5所示，阳性对照及阴性对照均无S型曲线，只有以重组质粒pGEM-TGEV为模板的PCR扩增，有S型曲线，说明本方法具有很好的特异性。

Claims (5)

1.一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法，其特征在于：所述的检测方法的具体步骤如下：

1）采用常规方法提取胃肠炎病毒总RNA；

2）引物设计

根据GenBank中发表的猪传染性胃肠炎病毒的S基因序列(NC002306)，设计一对特异性引物，目的基因片段为250 bp，引物序列如下：

 上游引物P1：5’-GTATTGGGATTATGCT-3’

下游引物P2：5’-GGTGGTGGTAGTAGGT-3’；

3）猪传染性胃肠炎病毒的S基因RT-PCR扩增

取胃肠炎病毒总RNA，加入反转录引物、5×RT Buffer、dNTP、RNasin inhibitor及反转录酶进行反转录得到cDNA；以反转录所得的cDNA为模板进行PCR扩增，得到猪传染性胃肠炎病毒的S基因片段，取 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，并纯化回收PCR产物；

 4）猪传染性胃肠炎病毒的S基因的克隆与鉴定

将回收纯化后PCR产物与载体连接，将连接产物转化至感受态细胞， 筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基中，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定；

5）标准品模板的制备

提取验证正确的阳性重组质粒，用紫外分光光度计测定阳性重组质粒的浓度，并计算基因模板拷贝数，将重组质粒进行10倍倍比梯度稀释，共做7个稀释度：10⁰， 10¹， 10²， 10³，10⁴， 10⁵，10⁶，将其作为标准品模板；

6）SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测

取标准品模板进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增，得到扩增动力学曲线及标准曲线；选取猪传染性胃肠炎病毒同一浓度的质粒标准品模板进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应，验证此方法的重复性与稳定性；                                              

 7）敏感性与特异性试验

将已计算出拷贝数的质粒做10倍倍比梯度稀释，进行敏感性试验；分别加入猪瘟病毒（HCV）、猪蓝耳病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）核酸作为阳性对照，同时设置阴性对照，验证此方法的特异性。

2.根据权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法，其特征在于：步骤3）所述的PCR扩增体系为：Premix Ex Taq 酶12 μl，浓度为0.5 μmoL / L引物P1、P2各0.5 μl，cDNA 1 μl，最后用灭菌的双蒸水补至25 μl。

3.根据权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法，其特征在于：步骤3）所述的PCR扩增反应程序为：

（1）95℃预变性5 min；

（2） 95℃变性 50 s、48℃ 退火50 s、72℃ 延伸1 min，此步骤为一个循环，共 35个循环；

（3）72℃延伸10 min。

4.根据权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法，其特征在于：步骤6）所述的SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应体系为：上游引物0.5μl，下游引物 0.5μl，SYBR Premix Ex Taq^TM II 聚合酶10μl，模板1μl，灭菌去离子水8μl。

5.根据权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法，其特征在于：步骤6）所述的SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应程序：

（1）95℃ 预变性5 min；

（2）95℃变性 10 s、56℃退火 15 s、72℃ 延伸15 s ，此步骤为一个循环，共45个循环；

当反应结束后先加热至95℃，然后再降至56℃，开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。

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