CN102102132A - 一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法 - Google Patents
一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,其步骤为:胃肠炎病毒总RNA的提取、引物设计、反转录、PCR扩增猪传染性胃肠炎病毒的S基因片段、猪传染性胃肠炎病毒的S基因的克隆与鉴定、标准品模板得制备、进行荧光定量PCR扩增,得动力学曲线及标准曲线,进行重复性、敏感性及特异性试验。本发明方法呈现出良好的S型扩增曲线,只出现扩增产物特异的单个峰,产物的Tm值均一;检测灵敏度可达3拷贝∕微升,具有很好的敏感性;该方法与其它病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性;起始模板浓度与Ct值之间呈很好的线性关系,反应体系具有很高的精确度和良好的稳定性。
Description
技术领域
本发明属病毒检测领域,具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法。
背景技术
猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis of swine,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引发的一种高度接触传染性的肠道疾病,是引起仔猪腹泻的重要病毒性传染原。感染猪的主要临床症状有腹泻、脱水和呕吐,患病幼仔猪死亡率极高,可以达到100%,已成为重要的猪病毒性腹泻病之一,给养猪业造成巨大的经济损失。TGE属于世界动物卫生组织(OIE)法典中B类疫病中必检的猪传染病,是我国法定检疫的疫病。临床实际操作中对TGEV的诊断比较困难,因为经常存在混合感染和细菌继发感染而使临床症状复杂化,根据流行病学和临床症状,只能作出初步诊断,特别是不能有效地将TGEV与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)及猪呼吸道冠状病毒(PRCV)进行鉴别。
目前检测TGEV的常规方法主要有病毒的分离鉴定、电镜观察、ELISA、免疫电镜观察、核酸探针杂交、免疫荧光抗体试验、普通RT-PCR、病毒中和试验、多重RT-PCR技术等,但是这些技术周期长,操作繁琐或者只能进行定性检测却不能定量分析,并且有时灵敏性不够。
发明内容
针对目前检测TGEV方法存在的问题,本发明目的在于提供一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法。
为了实现本发明目的,本发明的技术方案在于采用一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,具体步骤如下:
1、一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,其特征在于:所述的检测方法的具体步骤如下:
1)采用常规方法提取胃肠炎病毒总RNA;
2)引物设计:根据GenBank中发表的猪传染性胃肠炎病毒的S基因序列
(NC002306),设计一对特异性引物,目的基因片段为250 bp,引物序列如下:
上游引物P1:5’-GTATTGGGATTATGCT-3’
下游引物P2:5’-GGTGGTGGTAGTAGGT-3’;
3)猪传染性胃肠炎病毒的S基因RT-PCR扩增
取胃肠炎病毒总RNA,加入反转录引物、5×RT Buffer、dNTP、RNasin inhibitor及反转录酶进行反转录得到cDNA;以反转录所得的cDNA为模板进行PCR扩增,得到猪传染性胃肠炎病毒的S基因片段,取 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,并纯化回收PCR产物;
4)猪传染性胃肠炎病毒的S基因的克隆与鉴定
将回收纯化后PCR产物与载体连接,将连接产物转化至感受态细胞,筛选得到单菌落,挑选单菌落至含抗生素的液体培养基中,过夜培养,提取质粒,以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定,并对重组质粒进行测序鉴定;
5)标准品模板的制备
提取验证正确的阳性重组质粒,用紫外分光光度计测定阳性重组质粒的浓度,并计算基因模板拷贝数,将重组质粒进行10倍倍比梯度稀释,共做7个稀释度:100, 101, 102, 103,104, 105,106,将其作为标准品模板;
6)SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测
取标准品模板进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增,得到扩增动力学曲线及标准曲线;选取猪传染性胃肠炎病毒同一浓度的质粒标准品模板进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应,验证此方法的重复性与稳定性;
7)敏感性与特异性试验
将已计算出拷贝数的质粒做10倍倍比梯度稀释,进行敏感性试验;分别加入猪瘟病毒(HCV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)核酸作为阳性对照,同时设置阴性对照,验证此方法的特异性。
步骤3)所述的PCR扩增体系为:Premix Ex Taq 12 uL,浓度为0.5 umoL / L引物P1、P2各0.5 uL,cDNA 1 uL,最后用灭菌的双蒸水补至25 uL。
步骤3)所述的PCR扩增反应程序为:
(1)95℃预变性5 min;
(2) 95℃变性 50 s、48℃ 退火50 s、72℃ 延伸1 min,此步骤为一个循环,共 35个循环;
(3)72℃延伸10 min。
步骤6)所述的SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应体系为:上游引物0.5 uL,下游引物 0.5 uL,SYBR Premix Ex TaqTMII 聚合酶10 ul,模板1 ul,灭菌去离子水8 ul。
步骤6)所述的SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应程序:
(1)95℃ 预变性5 min;
(2)95℃变性 10 s、56℃退火 15 s、72℃ 延伸15 s ,此步骤为一个循环,共45个循环;
当反应结束后先加热至95℃,然后再降至56℃,开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。
本发明的有益效果:
1、扩增曲线呈现出良好的S 型,只出现扩增产物特异的单个峰,产物的T m 值都在87.7-88.5℃之间,说明没有引物二聚体及非特异性扩增产物出现;
2、检测灵敏度可达3拷贝∕微升,且具有很好的重复性;
3、该方法与对照组的HCV,PRRSV,PRV,PCV,PPV,JEV不发生交叉反应,具有良好的特异性;
4、该方法起始模板浓度与Ct值之间呈很好的线性关系,Ct值为13.42~25.04,标准曲线斜率为-2.932,相关系数R2为0.9845,说明此反应体系具有很高的精确度和良好的稳定性;
5、与常规PCR 相比较,不但可以定性检测TGEV,也可以定量检测TGEV,而且能够检测出常规PCR无法检测的病料,同时也免去了DNA水平电泳的步骤,更加省时,且操作简单。
附图说明
图1 为TGEV实时定量PCR扩增动力学曲线;
图2 为TGEV实时定量PCR标准曲线;
图3 为TGEV实时定量PCR扩增产物溶解曲线;
图4 为TGEV 实时定量PCR度重复性试验扩增动力学曲线;
图5 为TGEV实时定量PCR特异性试验扩增动力学曲线。
具体实施方式
实施例1 胃肠炎病毒总RNA提取
取增殖的猪传染性胃肠炎病毒液400 uL,加入400 ul的Trizol,剧烈振荡1-2 min,使其充分混匀;加入100 ul氯仿/异戊醇(24:1),剧烈振荡混匀30 s,12 000 rpm离心5 min;将上清液小心转移到无菌EP管中,加入200 ul 无水乙醇,混匀;将上述溶液全部转移到放于2 ml的收集管内的GenClean柱中,室温放置2 min,8 000 rpm离心1 min;小心取出柱子,弃去收集管中的废液,将柱子放回收集管;在柱子上加入450 ul RPE solution(漂洗液加5倍无水乙醇),10 000 rpm,室温离心30 s;倒掉废液,重复洗涤一次,小心取出柱子,弃去收集管中的废液,将柱子放回收集管中,12 000 rpm 室温离心3 min;将柱子放入新EP管,加DEPC(预先预热)20 ul于柱中;封口膜封口,水浴70℃ 2-3 min,12 000 rpm 1 min 即得到胃肠炎病毒总RNA样品,用紫外分光光度计测定其0D260值及0D280值,计算出0D260/0D280为1.9, 测得样品的浓度为4 ug/ul,取5ul提取总RNA,用DEPC水稀释成0.2ug/ul。
实施例2 设计引物
根据GenBank中发表的猪传染性胃肠炎病毒的S基因序列(NC002306), 应用Primer Premier 5.0软件设计一对引物,用设计的引物可扩增S基因部分片段(TGEV-S)250 bp,引物序列如下:
上游引物p1:5’-GTATTGGGATTATGCT-3’
下游引物p2:5’-GGTGGTGGTAGTAGGT-3’;
引物由上海生物工程技术有限公司合成。
实施例3 猪传染性胃肠炎病毒的S基因RT-PCR扩增
取5ul RNA样品加DEPC水补足11ul,然后加入反转录引物1 ul 70℃水浴10 min,后迅速置冰上5 min,稍离心;取出依次加入5×Buffer 4 ul,dNTP 2 ul,RNasinhibiter 1 ul,瞬时离心;42℃水浴2 min,快速加入1 ul反转录酶,封口膜封好;42℃水浴60 min,转至70℃水浴15 min,反转录结束;取反转录所得的cDNA为模板进行PCR扩增,
PCR扩增体系为:Premix Ex Taq 12 ul,浓度为0.5 umoL / L引物P1、P2各0.5 uL,cDNA 1 ul,最后用灭菌的双蒸水补至25 ul;
PCR扩增反应程序为:
(1)95℃预变性5 min;
(2) 95℃变性 50 s、48℃ 退火50 s、72℃ 延伸1 min,此步骤为一个循环,共 35个循环;
(3)72℃延伸10 min;
取5 ul PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果,结果显示扩增出一条片段大小为250bp特异性条带,按DNA凝胶回收试剂盒说明书回收PCR产物。
实施例4猪传染性胃肠炎病毒的S基因的克隆与鉴定
(1)将回收纯化后PCR产物与pGEM-T Easy载体相连,连接反应体系为:
2×buffer 5.0 ul
纯化PCR产物 3.0 ul
pGEM-T Easy vector 0.5 ul
ddH2O 0.5 ul
T4 DNA Ligase 1.0 ul
总体积 10 ul
将上述反应体系混匀后4℃连接过夜,连接产物直接用于转化;
(2)取100 ul DH5α感受态细胞,加入连接产物5 ul,冰浴30 min,42℃热休克90 sec,冰浴15 min,加入950 ul不含抗生素的LB液体培养基,37℃ 250r/min振荡培养45 min,8000 rpm离心5 min,弃上清液,加入200 ul液体培养基重悬沉淀,再加入42 ul IPTG(20 mg/mL)和42 ul X-gal(20 mg/mL),混匀,均匀涂布于含50 ug/mL Amp的LB固体平板上,37℃培养12 h;
(3)挑选单菌落,接入含50 ug/mL Amp的LB液体培养基中,37℃过夜培养,采用质粒提取试剂盒(北京博大泰克生物公司),提取质粒,以提取的质粒为模板进行PCR鉴定,并用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果,取PCR验证正确的阳性质粒送上海生物工程有限公司测序鉴定,将测序验证正确的重组质粒命名为pGEM-TGEV。
实施例5标准品模板的制备
挑选测序验证正确的阳性克隆,接入含50 ug/mL Amp的LB液体培养基中,37℃过夜培养,用碱裂解法提取重组质粒pGEM-TGEV,用紫外分光光度计检测并计算质粒浓度,按下面公式计算拷贝数:
经计算得pGEM-TGEV浓度为3×1010copies/??L,根据得到的结果,将重组质粒进行10倍倍比梯度稀释,得浓度为3×106,3×105,3×104,3×103,3×102,3×101,3×100拷贝数/微升的重组质粒,将其作为标准品模板;
实施例6 SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测
(1)分别取浓度为3×106,3×105,3×104,3×103,3×102,3×101,3×100拷贝数/微升的重组质粒为模板进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增,得到扩增动力学曲线、标准曲线,如图1及图2所示,标准曲线的相关系数为0.9845,斜率为-2.932,
其中PCR扩增反应体系为:上游引物0.5 uL,下游引物 0.5 uL,SYBR Premix Ex TaqTM II 聚合酶10 ul,模板1 ul,灭菌去离子水8 ul;
PCR反应程序为:
(1)95℃ 预变性5 min;
(2)95℃变性 10 s、56℃退火 15 s、72℃ 延伸15 s ,此步骤为一个循环,共45个循环;
当反应结束后先加热至95℃,然后再降至56℃,开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线,如图3所示,标准品的溶解温度都在87.7-88.5℃之间;
(2)选取猪传染性胃肠炎病毒同一浓度的质粒标准品模板进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应,验证此方法的重复性与稳定性,结果显示如图4所示,两次试验所得的S曲线相似,其Ct值相同,说明本方法具有很好的重复性与稳定性;
(3)将已计算出拷贝数的质粒做10倍倍比梯度稀释,进行敏感性试验,试验结果显示,浓度为3拷贝∕微升时,仍可以得到S型荧光曲线;
(4)SYBR GreenⅠ实时定量PCR体系中分别加入猪瘟病毒(HCV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)核酸作为阳性对照,同时以水作为阴性对照,验证此方法的特异性,试验结果如图5所示,阳性对照及阴性对照均无S型曲线,只有以重组质粒pGEM-TGEV为模板的PCR扩增,有S型曲线,说明本方法具有很好的特异性。
Claims (5)
1.一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,其特征在于:所述的检测方法的具体步骤如下:
1)采用常规方法提取胃肠炎病毒总RNA;
2)引物设计
根据GenBank中发表的猪传染性胃肠炎病毒的S基因序列(NC002306),设计一对特异性引物,目的基因片段为250 bp,引物序列如下:
上游引物P1:5’-GTATTGGGATTATGCT-3’
下游引物P2:5’-GGTGGTGGTAGTAGGT-3’;
3)猪传染性胃肠炎病毒的S基因RT-PCR扩增
取胃肠炎病毒总RNA,加入反转录引物、5×RT Buffer、dNTP、RNasin inhibitor及反转录酶进行反转录得到cDNA;以反转录所得的cDNA为模板进行PCR扩增,得到猪传染性胃肠炎病毒的S基因片段,取 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,并纯化回收PCR产物;
4)猪传染性胃肠炎病毒的S基因的克隆与鉴定
将回收纯化后PCR产物与载体连接,将连接产物转化至感受态细胞, 筛选得到单菌落,挑选单菌落至含抗生素的液体培养基中,过夜培养,提取质粒,以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定,并对重组质粒进行测序鉴定;
5)标准品模板的制备
提取验证正确的阳性重组质粒,用紫外分光光度计测定阳性重组质粒的浓度,并计算基因模板拷贝数,将重组质粒进行10倍倍比梯度稀释,共做7个稀释度:100, 101, 102, 103,104, 105,106,将其作为标准品模板;
6)SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测
取标准品模板进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增,得到扩增动力学曲线及标准曲线;选取猪传染性胃肠炎病毒同一浓度的质粒标准品模板进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应,验证此方法的重复性与稳定性;
7)敏感性与特异性试验
将已计算出拷贝数的质粒做10倍倍比梯度稀释,进行敏感性试验;分别加入猪瘟病毒(HCV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)核酸作为阳性对照,同时设置阴性对照,验证此方法的特异性。
2.根据权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,其特征在于:步骤3)所述的PCR扩增体系为:Premix Ex Taq 酶12 μl,浓度为0.5 μmoL / L引物P1、P2各0.5 μl,cDNA 1 μl,最后用灭菌的双蒸水补至25 μl。
3.根据权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,其特征在于:步骤3)所述的PCR扩增反应程序为:
(1)95℃预变性5 min;
(2) 95℃变性 50 s、48℃ 退火50 s、72℃ 延伸1 min,此步骤为一个循环,共 35个循环;
(3)72℃延伸10 min。
4.根据权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,其特征在于:步骤6)所述的SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应体系为:上游引物0.5μl,下游引物 0.5μl,SYBR Premix Ex TaqTM II 聚合酶10μl,模板1μl,灭菌去离子水8μl。
5.根据权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,其特征在于:步骤6)所述的SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应程序:
(1)95℃ 预变性5 min;
(2)95℃变性 10 s、56℃退火 15 s、72℃ 延伸15 s ,此步骤为一个循环,共45个循环;
当反应结束后先加热至95℃,然后再降至56℃,开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110622 |