CN103290142A - 荧光定量rt-pcr检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法，属疫苗质量检测技术领域。该方法包括猪蓝耳病病弱毒疫苗病毒特异性引物设计、RNA提取、cDNA制备、实时荧光定量RT-PCR扩增、标准质粒构建及检测标准曲线建立、有效性验证和结果判定。外侧引物（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2）用于构建标准质粒，内侧引物（SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4）用于样品检测，内侧引物扩增片段包含于外侧引物扩增片段之内，两对引物均能特异性扩增猪蓝耳病弱毒疫苗株病毒，扩增产物大小分别为287bp和130bp。本方法检测灵敏度高，检测时间短，能同时进行大批量的样本分析，具有良好的敏感性、特异性、重复性，适用于各品牌猪蓝耳病病毒弱毒疫苗病毒含量的测定。

Description

荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法

技术领域：

本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法，属疫苗质量检测技术领域。

背景技术：

猪繁殖与呼吸障碍综合征（Porcine Peproductive and Pespiratory Syndrome, PRRS）,中国国内又俗称猪蓝耳病，是由猪蓝耳病病毒（PRRSV）引起的猪繁殖障碍及仔猪出现严重呼吸道疾病，该病毒具有高度传染性和免疫抑制性，常常造成其它疾病继发感染，是一种严重影响经济效益的猪传染病。PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，为单股正链、不分节段RNA病毒，病毒棵粒有囊膜，似球状，直径45到65纳米，囊膜表面有纤突。

目前，疫苗接种仍然是预防和控制猪蓝耳病的重要手段，国内外多个疫苗厂商均有猪蓝耳病弱毒疫苗的生产和销售，在临床上被广泛使用。因此，疫苗病毒抗原含量的高低是疫苗质量的关键指标。传统的检验方法主要是通过疫苗注射后检测免疫动物血清来确定疫苗效价，如使用兔体定型热反应法、ELISA、免疫过氧化酶单层实验、血清中和实验等，但随着生物技术的快速发展，这些方法已经越来越凸显出其劣势：如免疫动物后才能确定疫苗的质量，需时长，同时，实验操作过程繁琐、准确度低等，无法满足现有的需要。因此，通过荧光定量RT-PCR技术来检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒弱毒疫苗的病毒含量，有其重要的意义。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种省时、省力，特异性高、重复性好、敏感度高的荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法。

本发明的荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法的步骤如下：

1、通过生物学软件DNAstar比对GenBank数据库中登录的CH-1R、HUN4-F112、R98、TJM-F92的国内主要疫苗厂家所使用的毒株全序列，在其高度保守区ORF7片段设计了两对针对于猪蓝耳病毒的特异性引物。其位置如图1所示。引物序列详见序列表，其中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2用于构建标准浓度质粒，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4用于建立荧光定量PCR标准曲线及检测未知样品.

2.猪蓝耳病病毒弱毒疫苗病毒RNA的提取

a.使用RNase Free水将疫苗稀释，每10头份分量加入2ml RNase Free水，充份混均。

b.吸取200μl RNase Free水稀释的疫苗，加入到含有1ml Trizol的离心管里，充分混匀，室温静置五分钟。

c.加入200μl 氯仿到离心管，充分混匀后于-20℃静置10分钟，取出立即于4℃低温离心10分钟，12000g/min。

d.小心吸取全部上清液体到新的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀后-20℃静置20min，取出后立即于4℃低温离心10分钟，12000g/min。

e.弃掉所有上清，并加入1ml 75%的冰乙醇，取出后立即于4℃低温离心5分钟，12000g/min。

f.弃掉管内全部液体，室温静置三分钟，待残余乙醇挥发完毕，立即加入30μl RNase Free水溶解核酸，即得到猪蓝耳病毒弱毒疫苗中的病毒RNA。

3.cDNA的制备

使用以下体系配制RNA反转录体系：

本体系全套采用宝生物工程（大连）有限公司产品，配制好以上体系后，于PCR仪内42℃反应 60min，完毕后置于-80℃超低温冰箱保存。

4.标准品质粒的构建

a.使用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2引物扩增上述步骤得到的cDNA，所得产物经过凝胶电泳后纯化回收大小为287bp的目的片段，经大连宝生物公司测序，确认该片段为猪蓝耳病弱毒疫苗病毒基因目的片段。

b.使用宝生物工程（大连）有限公司的pMD19-T Vector载体试剂盒，按照其说明书操作，将上述胶回收纯化的DNA连接到pMD19-T质粒中，并转化到宝生物工程（大连）有限公司的大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

c.经过纯化培养和蓝白斑筛选、PCR鉴定，确定了一株能稳定表达猪蓝耳病弱毒疫苗病毒基因目的片段的菌株，将该菌株进行增菌培养，并进行质粒纯化回收。

d.使用微量紫外分光光度计测定出质粒的浓度，并经过计算，确定其拷贝数。

e.将确定拷贝数的质粒浓溶液进行10倍体积的梯度稀释，从10^-1倍稀释至10^-12倍，依次命名为1号质粒标准品、2号质粒标准品、3号质粒标准品......12号质粒标准品。置于-20℃低温保存。

5.实时荧光定量RT-PCR检测标准曲线的建立

按以下体系（模板除外）进行预混，分装至荧光定量PCR专用反应管中，然后分别加入标准品质粒、阳性对照、阴性对照、空白对照，混匀后立即放入BIO-RAD公司的myiQ型荧光定量PCR仪内。

预先在荧光定量PCR仪设置好以下反应程序，并在每个循环的72℃结束时采集荧光，根据荧光强度变化由电脑自动制作标准曲线。

6.结果判定

实验完毕后，若阳性对照的Ct值＜32，阴性对照的Ct值＞35，电脑绘制的标准曲线各点相关度大于95%，反应效率在80%～120%之间，标准浓度质粒的熔解温度Tm值在85.0±0.5℃则说明实验数据准确、有效，实验成立。

在实验成立的前提下，待测样品的Ct值＜35，Tm值为85.0±0.5℃判为阳性；待测样品的Ct值＞35或Tm值不为85.0±0.5℃则判为阴性。

本发明与传统方法检测相比,具有以下优点：

1、特异性好：本发明所使用的引物是针对猪蓝耳病毒弱毒疫苗病毒毒株的特异性引物，具有高度特异性，能实时准确的测定出疫苗中病毒的含量。

2、灵敏度高：本发明所使用的标准品质粒，经实验证明至少能检测出7.43×10⁴copy/ml的病毒含量。

3、重复性好：本发明所使用的检测模版是cDNA,性质稳定，结果准确，经过三次重复实验其误差低于2%，克服传统方法的缺点，并能快速对疫苗中病毒含量进行准确定量，淘汰不合格批次。

4、成本低：本实验所需的样品和所花费的试剂耗材极少，大大节省了检测成本。

5、检测速度快，操作简便：不需后续处理，不用电泳、照胶、及显色处理，整个过程只需要3小时。

附图说明：

图1为本发明所使用的引物在猪蓝耳病毒弱毒疫苗毒株基因中的位置。

图2为本发明所使用的引物常规PCR扩增结果在电泳检测的图谱，其中：1为DL2000 mark DNA对照，2为SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2引物扩增产物，3为SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4引物扩增产物。

图3为猪蓝耳病病毒弱毒疫苗毒株实时荧光定量RT-PCR扩增图谱，其中：1～5为标准品质粒曲线，其浓度分别为7.43×10¹⁰、7.43×10⁹、7.43×10⁸、7.43×10⁷、7.43×10⁶，6为阳性对照，7为阴性对照，8为猪蓝耳病病毒弱毒疫苗毒株的cDNA。

图4为该疫苗及标准品质粒的对数关系图，其中：1～5为标准品质粒，6为猪蓝耳病病毒弱毒疫苗毒株的cDNA。

图5为该疫苗及标准品质粒的熔点曲线图，其中：1～5为标准品质粒，6为阳性对照，7为猪蓝耳病病毒弱毒疫苗毒株的cDNA，8为阴性对照。

图6为该疫苗及标准品质粒的熔解峰图，其中：1～５为标准品质粒，６为阳性对照，７为猪蓝耳病病毒弱毒疫苗毒株的cDNA，８为阴性对照。

图7为标准品质粒敏感性实验的实时荧光定量RT-PCR扩增图谱，其中：从左到右的曲线代表的质粒浓度依次是：7.43×10¹⁰copy/ml、7.43×10⁹copy/ml、7.43×10⁸copy/ml、7.43×10⁷copy/ml、7.43×10⁶copy/ml、7.43×10⁵copy/ml、7.43×10⁴copy/ml、阴性对照。

图8为标准品质粒敏感性实验的对数关系图，其中：1～７号为图７中所对应的各点。

图9为特异性检测的实时荧光定量RT-PCR扩增图谱，其中：1号曲线为阳性对照、2号曲线为猪伪狂犬病活疫苗、3号曲线为猪瘟兔化弱毒疫苗、4号曲线为猪乙型脑炎活疫苗、5号曲线为仔猪副伤寒活疫苗。

具体实例方式：

下面结合附图和实例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

1.准备材料

1.1 主要实验仪器

伯乐公司myiQ荧光定量PCR仪、超低温冰箱、紫外分光光度计、低温离心机、超净操作台、电泳仪、及紫外凝胶成像系统。

1.2实验材料

猪蓝耳病毒弱毒疫苗引物SEQ ID NO:1（5’-GTCAATCAGCTGTGCCAAATGCTG-3’）、SEQ ID NO:2（5’-CAGACGCACAGTATGTTGCGTCG-3’）、SEQ ID NO:3

(5’-GAGAAGCCCCATTTCCCTCTAGC-3’)、SEQ ID NO:4 (5’-CTGACAGGGCACAAGTTCCAGC-3’)由宝生物工程（大连）有限公司合成，pMD19-T Vector载体试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、SYBR GREEN I  MIX荧光染料均购自宝生物工程（大连）有限公司。

    猪蓝耳弱毒疫苗、猪伪狂犬活疫苗、猪瘟兔化弱毒疫苗、猪乙型脑炎活疫苗、仔猪副伤寒活疫苗，均购于云南省兽医防疫总站，所购疫苗均用4ml的RNase Free水稀释，然后分装于eppendorf管中，每管200μl，-80℃保存。

2.实验方法和结果

2.1标准品质粒的构建

2.1.1 按照说明书发明内容描述的方法提取猪蓝耳病弱毒疫苗病毒的RNA

提取猪蓝耳病弱毒疫苗病毒的RNA，反转录成cDNA，使用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2引物对cDNA进行PCR扩增，之后将产物进行凝胶电泳，并切胶做胶回收处理，将纯化回收的DNA，与载体质粒pMD19-T相连接，并转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，将转化成功的菌株进行纯化培养之后，使用细菌质粒小量提取试剂盒提取其中的质粒，并在微量紫外分光光度计进行浓度测定，确定其拷贝数浓度。将该质粒作10倍梯度稀释，作为标准品质粒，-20℃低温保存。

2.1.2 荧光定量PCR反应条件的优化

以猪蓝耳病弱毒疫苗的病毒cDNA为模板，对退火温度、引物浓度、进行优化，确定PCR反应的最佳条件。最终确定了一种25μl反应体系为最佳反应体系：模板DNA 2μl、SYBR Green I MIX荧光染料 12.5μl、上下游引物各0.5μl、RNase Free水  9.5μl。最佳退火温度为56℃，反应程序为：95℃ 30秒，一个循环，95℃ 10秒、56℃ 15秒、72℃10秒，40个循环，并于每个循环的72℃结束时采集荧光信号，绘制出实时荧光定量扩增曲线图（图3）和疫苗与标准品质粒的对数关系图（图4）。最后从81℃升高到89℃，每0.2℃停留10秒，并采集荧光信号，绘制出熔点曲线图（图5）和熔解峰图（图6）。

2.2荧光定量PCR反应的敏感性和特异性检测

利用步骤2.1中的最佳反应体系和反应程序，以七个稀释的标准品质粒为模板，浓度分别为7.43×10¹⁰copy/ml、7.43×10⁹copy/ml、7.43×10⁸copy/ml、7.43×10⁷copy/ml、7.43×10⁶copy/ml、7.43×10⁵copy/ml、7.43×10⁴copy/ml,并设置阴性对照，进行敏感性检测，结果如图7，结果表明，本实验能检测出浓度为7.43×10⁴copy/ml的未知样品。

提取猪伪狂犬活疫苗、猪瘟兔化弱毒疫苗、猪乙型脑炎活疫苗、仔猪副伤寒活疫苗这四种疫苗的RNA或DNA，RNA需反转录为cDNA作为模板，进行荧光定量PCR检测，其中1号曲线为阳性对照，其Ct值＜32，说明本次实验结果有效；2号～5号曲线的Ct值＞35，均为阴性，说明本实验方法结果可靠，对于猪伪狂犬活疫苗、猪瘟兔化弱毒疫苗、猪乙型脑炎活疫苗、仔猪副伤寒活疫苗具有良好的特异性，如图9。

序列表

 

<110>  云南农业大学

 

<120>  荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  24

<212>  DNA

<213>  Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

 

<400>  1

gtcaatcagc tgtgccaaat gctg                                              24

 

 

<210>  2

<211>  23

<212>  DNA

<213>  Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

 

<400>  2

cagacgcaca gtatgttgcg tcg                                               23

 

 

<210>  3

<211>  23

<212>  DNA

<213>  Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

 

<400>  3

gagaagcccc atttccctct agc                                               23

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

 

<400>  4

ctgacagggc acaagttcca gc                                                22

Claims (1)

1.一种荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法，包括用于实时荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的特异性引物、标准质粒的制备及建立标准曲线、确定实验的成立标准、确定阳性或阴性的判定标准，其具体特征如下：

（1）引物特征：

SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2能特异性扩增猪蓝耳病病毒的cDNA，扩增产物大小为287bp，用于构建标准浓度的质粒；

SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4能特异性扩增包含于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2扩增产物片段之内的猪蓝耳病病毒cDNA，扩增产物大小为130bp，用于建立荧光定量PCR标准曲线及检测未知样品；

（2）标准曲线的建立方法：

提取猪蓝耳病弱毒疫苗的RNA，并反转录为cDNA，作为模板；以SEQID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，进行PCR扩增；将扩增产物纯化回收，连接到pMD19-T载体上，转化到感受态细胞DH5α内，提取质粒DNA，获得猪蓝耳病弱毒疫苗检测用的标准质粒；

将制备的标准质粒作10倍梯度稀释，以稀释液为模板，进行荧光定量PCR，采集荧光信号，使用Bio-Rad iQ5软件绘制出实时荧光定量标准曲线，并获得其产物Tm值；

（3）实验成立标准：

若阳性对照的Ct值＜32，阴性对照的Ct值＞35，电脑绘制的标准曲线各点相关度大于95%，反应效率在80%～120%之间，标准浓度质粒样品熔解温度Tm值在85.0±0.5℃则说明实验数据准确、有效，实验成立；

（4）判定阳性或阴性的标准：

在实验成立的前提下，待测样品的Ct值＜35，Tm值为85.0±0.5℃判为阳性；待测样品的Ct值＞35或Tm值不为85.0±0.5℃则判为阴性。

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