CN109837329A - 一种检测油乳剂全病毒灭活疫苗中有效抗原含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测油乳剂全病毒灭活疫苗中有效抗原含量的方法，涉及兽药技术领域。本发明所述方法包括以下步骤：(1)准备标准品；(2)疫苗用有机溶剂破乳分离水相；(3)提取标准品和疫苗水相中核酸；(4)实时荧光定量PCR检测；(5)根据检测的标准品Ct值及对应有效抗原含量建立标准曲线，将检测的疫苗Ct值代入标准曲线，计算疫苗水相中有效抗原含量，从而换算得到疫苗中有效抗原含量。本发明所述方法重复性和稳定性好，过程简单，操作性强，样品处理不需经过浓缩步骤，减少样品处理产生的误差，所需样品量少，周期短。
Description
技术领域
本发明属于兽药技术领域，具体涉及一种检测油乳剂全病毒灭活疫苗中有效抗原含量的方法。
背景技术
全病毒灭活疫苗由完整的病毒组成，灭活剂使其致病性丧失，但是仍然保持病毒的全部免疫原性，接种后病毒抗原可以刺激机体产生免疫应答，达到保护作用。活病毒疫苗可以通过测定TCID50来评价疫苗中有效抗原的含量。而全病毒灭活疫苗中有效抗原含量的检测，传统方法是用蔗糖密度梯度离心法纯化，采用紫外分光光度计检测各梯度区带抗原并收集各吸收峰。该方法需配置超速离心机，一般实验室无法承受该仪器的采购价格。
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一项以PCR反应为基础的DNA定量技术，通过对目标基因在扩增过程中产生的拷贝数进行实时的定量，从而达到对目的基因的定性和定量分析。现有两种常用的方法进行荧光定量：一种是利用荧光染料与双链DNA结合，通过荧光强度进行定量；另一种是利用携带了荧光报告基团的特异DNA探针对目标基因进行定量。
目前成品疫苗的质检，一般采用成品疫苗按照规定的免疫程序免疫靶动物，跟踪后续的抗体效价结果或进行免疫攻毒实验，从而验证本批次疫苗是否符合要求。因此找到一种替代方法检测成品疫苗中有效抗原含量是目前兽用疫苗的一个研究热点，这不仅能够节约成本和时间，也能够避免使用动物进行实验，从而节约实验动物的使用量。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测油乳剂全病毒灭活疫苗中有效抗原含量的方法，过程简单，操作性强，样品需求量少，周期短，重复性和稳定性好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测油乳剂全病毒灭活疫苗中有效抗原含量的方法，包括以下步骤：(1)以所述油乳剂全病毒灭活疫苗对应的病毒产品为原料制备标准品；
(2)利用有机溶剂对所述油乳剂全病毒灭活疫苗进行破乳分离水相，得疫苗水相；所述油乳剂全病毒灭活疫苗的灭活剂包括：二乙烯亚胺、N-乙酰乙烯亚胺、2-乙基乙烯亚胺和β-丙内酯；
(3)分别提取步骤(1)所述标准品和步骤(2)所述疫苗水相的核酸，得到标准品核酸和疫苗水相核酸，分别以所述标准品核酸和疫苗水相核酸为模板，进行实时荧光定量PCR；
(4)根据所述标准品核酸的Ct值和对应有效抗原含量建立标准曲线，将所述疫苗水相核酸的Ct值代入标准曲线，计算疫苗水相中有效抗原含量，从而得到疫苗中有效抗原含量；
所述步骤(1)与步骤(2)不存在时间上的前后限制关系。
优选的，所述油乳剂全病毒灭活疫苗的佐剂类型包括：水包油佐剂、油包水佐剂和水包油包水佐剂。
优选的，步骤(1)所述病毒产品包括：活病毒、灭活病毒、病毒PCR产物或病毒质粒。
优选的，步骤(2)所述有机溶剂包括：氯仿、苯甲醇、正戊醇、正己醇和卞醇中的一种。
本发明提供了一种检测油乳剂全病毒灭活疫苗中有效抗原含量的方法，所述方法包括以下步骤：(1)准备标准品；(2)疫苗用有机溶剂破乳分离水相；(3)提取标准品和疫苗水相中核酸；(4)实时荧光定量PCR检测；(5)根据检测的标准品Ct值及对应有效抗原含量建立标准曲线，将检测的疫苗Ct值代入标准曲线，计算疫苗水相中有效抗原含量，从而得到疫苗中有效抗原含量。在本发明实施例中，所述方法重复性和稳定性好，同一样品检测结果偏差基本在5％以内；过程简单，操作性强，样品处理不需经过浓缩步骤，减少样品处理产生的误差；所需样品量少，仅需300μL便可检测，而传统方法至少需要10mL；周期短，仅需2小时便能完成。
附图说明
图1为本发明实施例1中的标准品对应的标准曲线；
图2为本发明实施例1中标准品的扩增曲线；
图3为本发明实施例1中所有样品和标准品的熔解曲线；
图4为本发明实施例2中标准品的标准曲线；
图5为本发明实施例2中标准品的扩增曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种检测油乳剂全病毒灭活疫苗中有效抗原含量的方法，包括以下步骤：(1)以所述油乳剂全病毒灭活疫苗对应的病毒产品为原料制备标准品；
(2)利用有机溶剂对所述油乳剂全病毒灭活疫苗进行破乳分离水相，得疫苗水相；所述油乳剂全病毒灭活疫苗的灭活剂包括：二乙烯亚胺、N-乙酰乙烯亚胺、2-乙基乙烯亚胺和β-丙内酯；
(3)分别提取步骤(1)所述标准品和步骤(2)所述疫苗水相的核酸，得到标准品核酸和疫苗水相核酸，分别以所述标准品核酸和疫苗水相核酸为模板，进行实时荧光定量PCR；
(4)根据所述标准品核酸的Ct值和对应有效抗原含量建立标准曲线，将所述疫苗水相核酸的Ct值代入标准曲线，计算疫苗水相中有效抗原含量，从而得到疫苗中有效抗原含量；
所述步骤(1)与步骤(2)不存在时间上的前后限制关系。
在本发明所述方法中，以所述油乳剂全病毒灭活疫苗对应的病毒产品为原料制备标准品。在本发明中，所述油乳剂全病毒灭活疫苗的佐剂类型优选包括：水包油佐剂、油包水佐剂或水包油包水佐剂。本发明所述病毒产品优选的包括：活病毒、灭活全病毒、病毒PCR产物或病毒质粒，更优选的所述病毒产品的含量已知。本发明所述病毒与所述油乳剂全病毒灭活疫苗相对应，在本发明实施例中，当检测猪繁殖与呼吸综合征全病毒灭活疫苗中有效抗原含量时，选择猪繁殖与呼吸综合征病毒目的基因PCR产物制备标准品；当检测猪圆环全病毒灭活疫苗中有效抗原含量时，选择猪圆环病毒细胞培养液制备标准品。
本发明利用有机溶剂对所述油乳剂全病毒灭活疫苗进行破乳分离水相，得疫苗水相；所述油乳剂全病毒灭活疫苗的灭活剂包括：二乙烯亚胺、N-乙酰乙烯亚胺、2-乙基乙烯亚胺和β-丙内酯。在本发明中，所述灭活剂对疫苗进行灭活后，只影响病毒的复制，并不影响DNA聚合酶对核酸的PCR扩增。本发明所述破乳分离水相优选为将所述疫苗与所述有机溶剂等量混合后，离心取上层溶液。在本发明中所述离心的转速优选为4500～5500rpm，更优选为1800～5200rpm，最优选为5000rpm。本发明所述离心的时间优选为3～8分钟，更优选为4～6分钟，最优选为5分钟。本发明在所述离心后，优选取上层100μL液体，即为本发明所述疫苗水相。本发明所述有机溶剂的种类优选包括：氯仿、苯甲醇、正戊醇、正己醇和卞醇。
本发明所述标准品的制备以及疫苗水相的制备之间并不存在时间上的先后顺序，可以进行顺序上的颠倒。
得标准品和疫苗水相后，本发明分别提取步骤(1)所述标准品和步骤(2)所述疫苗水相的核酸，得到标准品核酸和疫苗水相核酸，分别以所述标准品核酸和疫苗水相核酸为模板，进行实时荧光定量PCR。本发明所述疫苗水相的核酸优选包括DNA或RNA，本发明对所述疫苗水相的核酸的提取方法并没有特殊限定，当所述核酸为DNA时，优选通过商品用DNA提取试剂盒提取，当所述核酸为RNA时，优选通过Trizol法抽提。本发明对所述实时荧光定量PCR的体系并没有特殊限定，优选为20μL体系。本发明所述实时荧光定量PCR的程序优选设置为：42℃5分钟，95℃10秒，循环阶段95℃5秒，60℃30秒，共计40个循环，在每次循环第二步收集荧光信号，熔解曲线默认设置。本发明所述实时荧光定量PCR的引物优选根据各种病毒的保守序列设计。
本发明根据所述标准品核酸的Ct值和对应有效抗原含量建立标准曲线，将所述疫苗水相核酸的Ct值代入标准曲线，计算疫苗水相中有效抗原含量，从而得到疫苗中有效抗原含量。在本发明中，所述标准曲线以Ct值为y值，以有效抗原含量为x值，相关系数R2大于0.98。本发明将检测的疫苗Ct值作为标准曲线的y代入函数中得到相应的x值，此x值即为水相中有效抗原含量。本发明所述疫苗中有效抗原含量＝水相中有效抗原含量×有机溶剂破乳分离水相总体积÷所取疫苗总体积，计算得到疫苗中有效抗原含量。
下面结合实施例对本发明提供的检测油乳剂全病毒灭活疫苗中有效抗原含量的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
检测猪繁殖与呼吸综合征全病毒灭活疫苗中有效抗原含量(拷贝数/μL)
1、准备标准品
提取病毒RNA，用SEQ ID NO.1和2，一步法RT-PCR试剂盒(购自上海生工，货号B532431)PCR扩增目的基因，即为PCR产物。取猪繁殖与呼吸综合征病毒目的基因PCR产物，紫外分光光度计OD260测定PCR产物吸光值。
根据公式：PCR产物拷贝数＝6.02×1023×PCR产物吸光值×稀释倍数×50/(PCR产物碱基数×660×109)拷贝数/μL，计算PCR产物拷贝数。此时PCR产物OD260吸光值为0.407，计算得到的PCR产物拷贝数为1.37×1011拷贝数/μL。
用RNase Free dH2O将PCR产物依次稀释到107拷贝数/μL、106拷贝数/μL、105拷贝数/μL、104拷贝数/μL、103拷贝数/μL，即为标准品。
2、疫苗用有机溶剂破乳分离水相
取待检猪繁殖与呼吸综合征全病毒灭活疫苗(杭州佑本动物疫苗有限公司，NVDC-JXA1株)300μL至1.5mL离心管，加入300μL氯仿，5000rpm离心5分钟，取100μL上层水相至新的1.5mL离心管。
3、用Trizol抽提水相中RNA
a.每份样品中加入1mL Trizol，充分振荡混匀，室温放置5分钟。
b.加入0.2mL氯仿，振荡15秒，室温放置3分钟，12000rpm 4℃离心10分钟。
c.吸取上层水相至新的1.5mL离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10分钟。
d.12000rpm 4℃离心10分钟，弃上清。
e.加入1mL 75％乙醇洗涤。12000rpm 4℃离心3分钟，弃上清。室温干燥5分钟。
f.加入30μLRNase-free dH2O，充分溶解RNA。
4、实时荧光定量PCR检测
实时荧光定量PCR试剂购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为RR066A。
a.按表1所示配制实时荧光定量PCR反应体系：
表1实时荧光定量PCR反应体系
表1中，PCR Forward Primer序列如SEQ ID NO.1所示：CTGTCAGATTCAGGGAGGATAAG；PCR Reverse Primer序列如SEQ ID NO.2所示：GATCAGGCGCACAGTATGA。
b.进行实时荧光定量PCR反应
在Applied Biosystems公司StepOnePlus实时荧光定量PCR仪进行如下设定：试剂选择SYBR Green Reagents，模板选择RNA，反应条件42℃5分钟，95℃10秒，循环阶段95℃5秒，60℃30秒，共计40个循环，在每次循环第二步收集荧光信号，熔解曲线默认设置。标准品的扩增曲线如图2所示，样品和标准品的熔解曲线如图3所示。
5、根据检测的标准品Ct值及对应有效抗原含量建立标准曲线如图1所示：
标准曲线为Y＝－3.361log X+37.474，R2＝0.999，扩增效率98.379％。
6、将检测的疫苗Ct值代入标准曲线，计算疫苗水相中有效抗原含量，从而换算得到疫苗中有效抗原含量，具体结果如表2所示。
表2疫苗中有效抗原含量表
由表2可知，当利用染料法荧光定量PCR时，在置信区间13-30Ct范围内，Ct SD小于0.5，证明本发明所述方法准确度高。30～33之间误差较大，可认为没有目的基因或极微量，不属于本实验的检测范围。
实施例2
检测猪圆环病毒灭活疫苗中有效抗原含量(ng/μL)
1、准备标准品
取猪圆环病毒细胞培养液，经传统方法灭活、浓缩、蔗糖密度梯度离心：取培养上清10mL，加入40mL冰丙酮，-20℃放置过夜，10000rpm离心15分钟，收集沉淀，加500μLPBS重溶沉淀。溶解样品加到配置好的蔗糖梯度液上层，100000rpm离心2小时，吸取病毒带，紫外分光光度计测量吸光值，计算抗原含量。紫外分光光度计定量抗原含量为2630ng/μL。
抗原含量＝1.45×OD280－0.74×OD260×1000(ng/μL)
2、疫苗用有机溶剂破乳分离水相
取待检猪圆环全病毒灭活疫苗(杭州佑本动物疫苗有限公司，ZJ/C株)300μL至1.5mL离心管，加入300μL氯仿，5000rpm离心5分钟，取100μL上层水相至新的1.5mL离心管。
3、用商品化试剂盒提取标准品和疫苗水相中DNA
猪圆环病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。
病毒DNA提取步骤如下：
a.每份样品加入200μL消化液和20μL蛋白酶K，充分振荡混匀，置56℃金属浴消化1小时。
b.取出样品管，降至室温后，加入300μLDNA结合液，颠倒混匀，全部液体吸入吸附柱，室温静置3分钟，10000rpm离心30秒。
c.弃去收集管液体，加入500μLDNA洗涤液，10000rpm离心30秒。重复一次。
d.弃去收集管液体，10000rpm空柱离心1分钟。
e.将吸附柱移入新的1.5mL离心管，向柱中央加入50μLDNA洗脱液，室温静置2分钟，10000rpm离心30秒，离心管液体即为模板DNA。
4、实时荧光定量PCR检测(利用购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司猪圆环病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒)
a.按表3所示配制实时荧光定量PCR反应体系：
表3实时荧光定量PCR反应体系
b.进行实时荧光定量PCR反应
在Applied Biosystems公司StepOnePlus实时荧光定量PCR仪进行如下设定：试剂选择TaqMan Reagents，模板选择DNA，反应条件95℃2分钟；循环95℃5秒，60℃35秒，共40次，在每次循环第二步收集荧光信号，报告基团FAM，淬灭集团None。其中标准品的标准曲线如图4所示，标准品的扩增曲线如图5所示。
5、根据检测的标准品Ct值及对应有效抗原含量建立标准曲线
标准曲线为Y＝－3.319log X+39.688，R2＝1，扩增效率100.135％。
6、疫苗中有效抗原含量计算
将检测的疫苗Ct值代入标准曲线，计算疫苗水相中有效抗原含量，从而换算得到疫苗中有效抗原含量，结果如表4所示。
表4疫苗中有效抗原含量表
由表4可知，当利用探针法荧光定量PCR时，在置信区间13-30Ct范围内，Ct SD小于0.5，证明本发明所述方法准确度高。30～33之间误差较大，可认为没有目的基因或极微量，不属于本实验的检测范围。
本发明提供了一种检测油乳剂全病毒灭活疫苗中有效抗原含量的方法，与传统蔗糖密度梯度离心法测量含量有较好的相关性，能够代替传统方法，简化实验步骤，缩短检测周期，降低检测成本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种检测油乳剂全病毒灭活疫苗中有效抗原含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以所述油乳剂全病毒灭活疫苗对应的病毒产品为原料制备标准品；
(2)利用有机溶剂对所述油乳剂全病毒灭活疫苗进行破乳分离水相，得疫苗水相；所述油乳剂全病毒灭活疫苗的灭活剂包括：二乙烯亚胺、N-乙酰乙烯亚胺、2-乙基乙烯亚胺和β-丙内酯；
(3)分别提取步骤(1)所述标准品和步骤(2)所述疫苗水相的核酸，得到标准品核酸和疫苗水相核酸，分别以所述标准品核酸和疫苗水相核酸为模板，进行实时荧光定量PCR；
(4)根据所述标准品核酸的Ct值和对应有效抗原含量建立标准曲线，将所述疫苗水相核酸的Ct值代入标准曲线，计算疫苗水相中有效抗原含量，从而得到疫苗中有效抗原含量；
所述步骤(1)与步骤(2)不存在时间上的前后限制关系。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述油乳剂全病毒灭活疫苗的佐剂类型包括：水包油佐剂、油包水佐剂和水包油包水佐剂。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述病毒产品包括：活病毒、灭活病毒、病毒PCR产物或病毒质粒。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述有机溶剂包括：氯仿、苯甲醇、正戊醇、正己醇和卞醇中的一种。
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