CN104762414A - 荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的rt-lamp试剂盒 - Google Patents

荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的rt-lamp试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP(逆转录环介导等温扩增技术)试剂盒，包括RT-LAMP反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品；RT-LAMP反应液包含Bst DNA聚合酶大片段、AMV逆转录酶、引物、10×ThermoPol buffer、dNTPs溶液、MgSO4溶液、钙黄绿素溶液、MnCl2溶液、甜菜碱和DEPC水。引物分为外引物、内引物和环引物。本发明具有特异性好，灵敏度高，快速简便，可重复性高以及肉眼可判断结果等优点，可对导致乙脑的乙型脑炎病毒进行快速定性检测，可替代一直沿用的传统的病毒分离鉴定和免疫学检测方法。

Description

荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒
【技术领域】
本发明涉及医疗检测技术领域，具体的是指一种荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒。
【背景技术】
流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是一种人畜共患病的病原体，可引发以中枢神经系统损害为主的、通过蚊虫传播的一种急性病毒传染病，临床症状为高热、沉郁或狂暴、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭和脑膜刺激症。乙型脑炎病毒的主要感染对象是猪，感染乙脑病毒后，其症状主要表现为繁殖障碍：母猪表现为流产、死胎、木乃伊胎；公猪多表现为单侧睾丸炎，精液品质不良，失去配种能力，给养猪业造成巨大的经济损失，严重危害着养猪业的健康发展。另外，本病也多见于10岁以下的儿童，目前，我国是乙脑发病人数最多的国家，占世界总发病数的80％以上。因此，快速检测出这种病毒是十分有必要的。
近年发展起来的环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)是一种新型的体外核酸扩增技术，因其具有简便、快速、特异性和灵敏性高等特点，而被广泛应用于病原菌、病毒等病原体的快速分子检测，并且已经成为当前病毒核酸定性检测的重要方法之一。
环介导等温扩增技术可针对靶基因的6个区域设计4条特异引物(根据这4条引物又可设计出2条环引物)，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNA聚合酶)，在恒温条件(65℃左右)温育约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀以及绿色荧光。该技术具有不需要PCR仪、扩增产物不需要开盖，用肉眼即可判断结果及反应时间短，特异性强，灵敏度高等优点。
传统检测流行性流行性乙型脑炎病毒的方法，需要分离和生化鉴定，必要时还需要血清学鉴定，一般为4～6d，费时费力，具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点。各种常规PCR方法具有敏感性强、特异性高、简便、快速等优点，有较多应用于病毒检测的报道，但由于存在PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题以及需要特殊的仪器设备而限制了其在基层地区及条件落后地区的应用。因此亟待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。
【发明内容】
有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明提供一种特异性好、灵敏度高的荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供的荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于：包括RT-LAMP反应液，标准阳性模板和阴性质控标准品；
RT-LAMP反应液含有引物，引物如下:
上游外引物F3：5'-TTCATAGAAGGAGCCAGTG-3'；(SEQ ID No.1)
下游外引物B3：5'-TGGGCTTCTCCAGTCGTG-3'；(SEQ ID No.2)
上游内引物FIP：5'-GCGGACGTCCAATGTTGGTTTGGCCACTTGGGTGGACTTG-3'；(SEQ IDNo.3)
下游内引物BIP：5'-AAGCTAGCCAACTTGCTGAGGTCCGAGCCACCGTCGAGATG-3'；(SEQ IDNo.4)
环引物LF：5'-CAAGCAGCTGTCTCCTTCTAGCAC-3'；(SEQ ID No.5)
环引物LB：5'-TACTGCTATCATGCTTCAGTCACT-3'。(SEQ ID No.6)
具体如下：
(1)RT-LAMP反应液
RT-LAMP反应液是由8.0U/μL Bst DNA聚合酶大片段、10U/μL AMV逆转录酶、10×ThermoPol buffer、10～20μmol/L的外引物、10～20μmol/L的内引物、10～20μmol/L的环引物、5.0mol/L甜菜碱、50mmol/L MgSO4溶液、10mmol/LdNTPs溶液、1.0mmol/L钙黄绿素溶液、10mmol/L MnCl2溶液和DEPC水组成。
在本发明的一个具体方案中，RT-LAMP反应液由10×ThermoPol buffer 2.5μL，10～20μmol/L内引物FIP、BIP各1.5μL，10～20μmol/L外引物F3、B3各0.25μL，10～20μmol/L环引物LF、LB各0.6μL，10mmol/L dNTPs溶液2.0μL，50mmol/L MgSO4溶液3.0μL，5.0mol/L甜菜碱3.0μL，8.0U/μL BstDNA聚合酶大片段1.0μL，10U/μLAMV逆转录酶1.0μL，1.0mmol/L钙黄绿素溶液0.6μL、10mmol/L MnCl2溶液1.3μL和DEPC水0.9μL组成，反应液总体积20μL。
(2)标准阳性模板
标准阳性模板是含有流行性乙型脑炎病毒高度保守基因E基因的230个碱基对的核苷酸片段构成的pUC57-E230重组质粒，该重组质粒可在大肠杆菌DH5α中增殖。
E基因的230个核苷酸序列为：
5'-CAATCGTGACTTCATAGAAGGAGCCAGTGGAGCCACTTGGGTGGACTTGGTGCTAGAAGGAGACAGCTGCTTGACAATCATGGCAAACGACAAACCAACATTGGACGTCCGCATGATTAACATCGAAGCTAGCCAACTTGCTGAGGTCAGAAGTTACTGCTATCATGCTTCAGTCACTGACATCTCGACGGTGGCTCGGTGCCCCACGACTGGAGAAGCCCACAACGAGA-3'(SEQ ID No.7)
实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒pUC57-E230，该质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，-20℃保存。
(3)阴性质控标准品
阴性质控标准品为无核酸酶的无菌水。
本发明应用RT-LAMP试剂盒检测流行性乙型脑炎病毒的方法，包括以下步骤：
(1)用Trizol法从待测样品中提取RNA；
(2)将RNA加入到RT-LAMP试剂盒的反应体系中，64℃保温50min；
(3)反应结束后，肉眼观察溶液颜色的变化，对样品进行定性分析。
本发明的优点在于：本发明荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒可对流行性乙型脑炎病毒进行定性检测，替代一直沿用的传统的病毒分离鉴定和免疫学检测方法；应用本发明的试剂盒与传统方法相比，检测速度快，仅需50min，加上样品RNA的提取制备，总共不超过4h；特异性好，灵敏度高；步骤简单，可重复性高；可同时进行多个样品检测。
【附图说明】
图1是本发明流行性乙型脑炎病毒经RT-LAMP反应后的荧光可视化结果。
图中：1、标准阳性模板，2、流行性乙型脑炎病毒阳性样本，3、流行性乙型脑炎病毒阳性样本，4、阴性对照。
图2是本发明流行性乙型脑炎病毒2％琼脂糖凝胶电泳检测结果图。
图中：M、DNA Marker，1、标准阳性模板，2、流行性乙型脑炎病毒阳性样本，3、流行性乙型脑炎病毒阳性样本，4、阴性对照。
图3是本发明流行性乙型脑炎病毒RT-LAMP试剂盒特异性实验荧光可视化结果。
图中：1、标准阳性模板，2、流行性人乙型脑炎病毒阳性样本，3、丙型肝炎病毒样本，4、流行性猪乙型脑炎病毒阳性样本，5、猪瘟病毒样本，6、猪蓝耳病毒样本，7、阴性对照。
图4是本发明流行性乙型脑炎病毒2％琼脂糖凝胶电泳检测结果图。
图中：M、DNA Marker，1、标准阳性模板，2、流行性人乙型脑炎病毒阳性样本，3、丙型肝炎病毒样本，4、流行性猪乙型脑炎病毒阳性样本，5、猪瘟病毒样本，6、猪蓝耳病毒样本，7、阴性对照。
图5是本发明流行性乙型脑炎病毒RT-LAMP试剂盒灵敏度实验荧光可视化结果。
图中：1、标准阳性模板，2、稀释10-4倍，3、稀释10-5倍，4、稀释10-6倍，5、稀释10-7倍，6、稀释10-8倍，7、稀释10-9倍，8、稀释10-10倍，9、阴性对照。
图6是本发明流行性乙型脑炎病毒2％琼脂糖凝胶电泳检测结果图。
图中：M、DNA Marker，1、标准阳性模板，2、稀释10-4倍，3、稀释10-5倍，4、稀释10-6倍，5、稀释10-7倍，6、稀释10-8倍，7、稀释10-9倍，8、稀释10-10倍，9、阴性对照。
【具体实施方式】
下面结合附图和具体实例对本发明进行详细的说明。
本发明下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。
实施例一：荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒组成与配制
1)RT-LAMP反应混合液
RT-LAMP反应液由10×ThermoPol buffer 2.5μL，10～20μmol/L内引物FIP、BIP各1.5μL，10～20μmol/L外引物F3、B3各0.25μL，10～20μmol/L环引物LF、LB各0.6μL，10mmol/L dNTPs溶液2.0μL，50mmol/L MgSO4溶液3.0μL，5.0mol/L甜菜碱3.0μL，8.0U/μL BstDNA聚合酶大片段1.0μL，10U/μLAMV逆转录酶1.0μL，1.0mmol/L钙黄绿素溶液0.6μL、10mmol/LMnCl2溶液1.3μL和DEPC水0.9μL组成，反应液总体积20μL。其中引物序列如下：
上游外引物F3：5'-TTCATAGAAGGAGCCAGTG-3'；
下游外引物B3：5'-TGGGCTTCTCCAGTCGTG-3'；
上游内引物FIP：5'-GCGGACGTCCAATGTTGGTTTGGCCACTTGGGTGGACTTG-3'；
下游内引物BIP：5'-AAGCTAGCCAACTTGCTGAGGTCCGAGCCACCGTCGAGATG-3'；
环引物LF：5'-CAAGCAGCTGTCTCCTTCTAGCAC-3'；
环引物LB：5'-TACTGCTATCATGCTTCAGTCACT-3'。
2)标准阳性模板
标准阳性模板是含有流行性乙型脑炎病毒高度保守基因E基因的230个碱基对的核苷酸片段构成的pUC57-E230重组质粒，该重组质粒可在大肠杆菌DH5α中增殖；实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒pUC57-E230，该质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，-20℃保存。
3)阴性质控标准品
阴性质控标准品为无核酸酶的无菌水。
实施例二：使用制得的RT-LAMP试剂盒检测流行性乙型脑炎病毒，具体步骤如下：
1)病毒RNA模板的制备：
(1)在所得的样品中1:1加入Trizol(1:1)，充分匀浆；
(2)向上述步骤(1)的匀浆裂解液中加入氯仿(Trizol的1/5体积量)，盖紧离心管盖，采用振荡器振荡均匀，混合至溶液乳化成乳白色；室温静置5分钟；12000g 4℃离心15分钟，从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液(含RNA)、中间的白色层(大部分为DNA)及带有颜色的下层有机相；吸取上清液转移至另一新的离心管中(切勿吸出白色中间层)；向上清中加入0.5-1倍Trizol体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟；12000g 4℃离心10分钟，一般在离心后，试管底部会出现RNA沉淀。
(3)RNA沉淀的清洗：小心弃去上清，切勿触及沉淀，残留少量异丙醇没有关系。加入与Trizol等量的75％的酒精，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500g4℃离心5分钟后小心弃去上清，切勿触及沉淀。
(4)RNA的溶解：打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟，沉淀干燥后，加入适量的DEPC水溶解沉淀。(不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解)。
2)RT-LAMP反应：分别取5μL步骤a中提取的样本加入到20μL RT-LAMP反应液中，64℃恒温扩增50min。同时用标准阳性模板和阴性质控标准品分别做阳性对照和阴性对照。
3)结果判定：待反应结束后肉眼观察溶液颜色，结果显示阳性样本呈现绿色(紫外线下观察呈现绿色荧光)，阴性样本则为橘黄色(注：为呈现绿色荧光的阳性结果；为呈现橘黄色的阴性结果)(见图1)。取5μL RT-LAMP产物用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样本都有条带，阴性样本则无条带(见图2)。
4)结论：反复重复试验3次，所得检测结果相同，实验组均有绿色荧光或电泳条带，对照组均无绿色荧光或电泳条带，与预期结果一致。说明本发明的试剂盒检测流行性乙型脑炎病毒效果良好，荧光观察法与电泳检测法效果一致，并且不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。
实施例三：荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒的特异性实验
1)RNA模板的制备：采用Trizol法对流行性乙型脑炎病毒样本、轮状病毒样本、丙型肝炎病毒样本、猪瘟病毒样本、猪蓝耳病毒样本的RNA分别进行提取。
2)RT-LAMP反应：分别取5μL步骤1)中提取的不同样本加入到对应的20μL RT-LAMP反应液中，64℃恒温扩增50min。同时用标准阳性模板和阴性质控标准品分别做阳性对照和阴性对照。
3)结果判定：反应结束后，肉眼观察反应液颜色变化情况，阳性样本呈现绿色(紫外线下呈现绿色荧光)，阴性样本则为橘黄色(注：为呈现绿色荧光的阳性结果；为呈现橘黄色的阴性结果)(见图3)。取5μL RT-LAMP产物用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样本都有梯状条带，阴性样本则无梯状条带，与肉眼观察反应液颜色的结果相符(见图4)。
4)结论：结果显示只有阳性对照组、流行性人乙型脑炎病毒阳性样本、流行性猪乙型脑炎病毒阳性样本有绿色荧光产生，而丙型肝炎病毒样本、猪瘟病毒样本、猪蓝耳病毒样本和阴性对照没有绿色荧光产生。该实验说明本发明的试剂盒具有良好的特异性。
实施例四：荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒灵敏度实验
1)RNA模板的制备：取10μL经过Trizol法提取的流行性乙型脑炎病毒RNA溶解液做10倍倍比稀释，稀释至10-10。
2)RT-LAMP反应：取5μL步骤1)中提取的各个稀释度的样本加入到20μLRT-LAMP反应液中，64℃恒温扩增50min。同时用标准阳性模板和阴性质控标准品分别做阳性对照和阴性对照。
3)结果判定：反应结束后，肉眼观察反应液颜色变化情况，结果显示阳性对照组、10-4-10-8样本在日光下呈现绿色(紫外线下呈现绿色荧光)，而10-9和10-10样本和阴性样本则为橘黄色(注：为呈现绿色荧光的阳性结果；为呈现橘黄色的阴性结果)(见图5)。取5μL RT-LAMP产物用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示阳性对照组、10-4-10-8样本对应的泳道有梯状条带产生，而10-9、10-10样本和阴性对照组则无条带产生，与肉眼观察反应液颜色的结果相符(见图6)。
4)结论：结果显示当病毒液稀释至10-8时仍能检测出，最低检测极限为5.06copies/μL。该实验说明本试剂盒具有良好的灵敏度。
实施例五：荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒临床样品验证
1)将在医院取来的28份血清样品(其中包含3份阳性样品)进行处理获得实验所需模板；
2)RT-LAMP反应：取5μL步骤1)中的模板加入到20μL RT-LAMP反应液中，64℃恒温扩增50min。同时用标准阳性模板和阴性质控标准品分别做阳性对照和阴性对照。
3)结果判定：反应结束后，肉眼观察反应液颜色变化情况，结果显示阳性对照组及3个血清样品在日光下呈现绿色(紫外线下呈现绿色荧光)，而其他样品和阴性样本则为橘黄色(注：为呈现绿色荧光的阳性结果；为呈现橘黄色的阴性结果)(见图5)。取5μL RT-LAMP产物用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示阳性对照组及3个血清样品对应的泳道有梯状条带产生，而其他样品和阴性样本对照组则无条带产生，与肉眼观察反应液颜色的结果相符(见表1)。
4)结论：结果显示RT-LAMP检测出的阳性样品数与得到的阳性样品数相符即100％吻合。该实验说明本试剂盒可信度较高。
表1
上述实施例可以说明，RT-LAMP检测试剂盒特异性好，灵敏度高，重复性好，可信度高，操作简便，而且RT-LAMP检测试剂盒对样品的检测仅需不到4h就能完成，而传统的方法需1周左右才能完成，因此，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。该试剂盒的操作只需1人即可完成整个操作过程，一次可检测多个样品，这样也减少了人力资源的浪费。
本发明的工作原理如下：使用本发明提供的荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒，在恒温条件下(65℃左右)保温约60min，即可完成核酸扩增反应，并伴随产生肉眼可见的绿色，在紫外线下则产生绿色荧光。在本发明的试剂盒中，针对流行性乙型脑炎病毒检测中的特殊性，对目的靶片段进行反应体系，如引物、dNTPs、Mg2+浓度、甜菜碱等的优化，通过优化方案，反复实验，建立了检测流行性乙型脑炎病毒的环介导等温扩增方法，并研制出荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速检测流行性乙型脑炎病毒的要求。

Claims (3)

1.一种荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于：包括RT-LAMP反应液，标准阳性模板和阴性质控标准品；
所述RT-LAMP反应液含有引物，所述引物如下:
上游外引物F3：5'-TTCATAGAAGGAGCCAGTG-3'；
下游外引物B3：5'-TGGGCTTCTCCAGTCGTG-3'；
上游内引物FIP：
5'-GCGGACGTCCAATGTTGGTTTGGCCACTTGGGTGGACTTG-3'；
下游内引物BIP：
5'-AAGCTAGCCAACTTGCTGAGGTCCGAGCCACCGTCGAGATG-3'；
环引物LF：5'-CAAGCAGCTGTCTCCTTCTAGCAC-3'；
环引物LB：5'-TACTGCTATCATGCTTCAGTCACT-3'。
2.根据权利要求1所述的荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于：所述RT-LAMP反应液包括8.0U/μL BstDNA聚合酶大片段、10U/μLAMV逆转录酶、10×ThermoPol buffer、10～20μmol/L的外引物、10～20μmol/L的内引物、10～20μmol/L的环引物、5.0mol/L甜菜碱、50mmol/L MgSO4溶液、10mmol/L dNTPs溶液、1.0mmol/L钙黄绿素溶液、10mmol/L MnCl2溶液和DEPC水。
3.根据权利要求1或2所述的荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于：所述标准阳性模板是含有流行性乙型脑炎病毒高度保守基因E基因的230个碱基对的核苷酸片段构成的pUC57-E230重组质粒，所述E230核苷酸序列为SEQ ID No.7所示。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105331749A (zh) * 2015-12-16 2016-02-17 广西壮族自治区兽医研究所 一种猪流行性乙型脑炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN111254226A (zh) * 2020-04-07 2020-06-09 北京市动物疫病预防控制中心 用于快速检测犬瘟热病毒的引物组、荧光可视化rt-lamp试剂盒及方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101629215A (zh) * 2009-03-06 2010-01-20 中国人民解放军第二军医大学 一种联合快速检测流行性乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒试剂盒及其检测方法
CN101724714A (zh) * 2009-12-30 2010-06-09 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒
CN103695561A (zh) * 2013-11-29 2014-04-02 华南农业大学 检测日本乙型脑炎病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用
CN204058465U (zh) * 2014-07-04 2014-12-31 沧州市中心医院 病毒性脑炎相关rna病毒多重rt-pcr检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101629215A (zh) * 2009-03-06 2010-01-20 中国人民解放军第二军医大学 一种联合快速检测流行性乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒试剂盒及其检测方法
CN101724714A (zh) * 2009-12-30 2010-06-09 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒
CN103695561A (zh) * 2013-11-29 2014-04-02 华南农业大学 检测日本乙型脑炎病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用
CN204058465U (zh) * 2014-07-04 2014-12-31 沧州市中心医院 病毒性脑炎相关rna病毒多重rt-pcr检测试剂盒

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105331749A (zh) * 2015-12-16 2016-02-17 广西壮族自治区兽医研究所 一种猪流行性乙型脑炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN111254226A (zh) * 2020-04-07 2020-06-09 北京市动物疫病预防控制中心 用于快速检测犬瘟热病毒的引物组、荧光可视化rt-lamp试剂盒及方法

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