CN111254226A

CN111254226A - 用于快速检测犬瘟热病毒的引物组、荧光可视化rt-lamp试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111254226A
Application number: CN202010264904.0A
Authority: CN
Inventors: 王林; 张启龙; 孙丹; 吴迪; 高晓龙; 栗云鹏; 程汝佳; 韦海涛; 宋彦军; 周德刚; 刘晓冬
Original assignee: Center For Animal Disease Control And Prevention Of Beijing
Current assignee: Center For Animal Disease Control And Prevention Of Beijing
Priority date: 2020-04-07
Filing date: 2020-04-07
Publication date: 2020-06-09

Abstract

本发明公开了用于快速检测犬瘟热病毒的引物组、荧光可视化RT‑LAMP试剂盒及方法。本发明的试剂盒中包含了针对犬瘟热病毒设计的引物组合，所述引物组合中包含了一对外引物、一对内引物和两条环引物。利用本发明制备的RT‑LAMP试剂盒可实现对犬瘟热病毒的高灵敏度和高特异性检测，检测灵敏度为10copies，同时检测方法操作简便，成本较低，设备适用范围广，可用于现场快速检测核酸，及时筛查，检测结果可肉眼直接观察，不需进行电泳，荧光检测LAMP即可获知检测结果。

Description

用于快速检测犬瘟热病毒的引物组、荧光可视化RT-LAMP试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于快速检测犬瘟热病毒的引物组、荧光可视化RT-LAMP试剂盒及方法。

背景技术

犬瘟热(canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)引起犬的一种高度接触性传染病，传染性强，死亡率可高达80％以上，病犬以典型的双相热、上呼吸道、肺及胃肠道卡他性炎症，非化脓性脑膜-脊髓炎为特征。CDV属于副黏病毒科麻疹病毒属，基因组为不分节段的负链RNA，主要编码囊膜相关的蛋白(M)，两个糖蛋白(血凝素H和融合蛋白F)，两个转录酶相关的蛋白质(磷蛋白质P和大蛋白L)和核衣壳蛋白(N)。N基因序列保守性高，是CDV的主要抗原基因。

传统的犬瘟热检测方法主要包括胶体金免疫学诊断方法和分子生物学诊断方法。目前常用免疫学诊断方法是胶体金试纸检测方法。胶体金试纸在敏感性和特异性方面欠佳，还存在易受环境影响，一直未形成相应的诊断技术标准。常用分子生物学诊断方法有常规PCR和荧光定量PCR等。RT-PCR和Real-time RT-PCR虽然较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等特点，但是对于操作人员的分子生物学技术背景要求很高，试剂成本很贵，特定仪器要求高，难以在基层实际生产中普及应用。临床动物医院或养殖户急需高效快速诊断的技术来满足临床快速诊断。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，能在等温(60～65℃)条件下，短时间(通常是一小时内)内进行大量的核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点；在灵敏度、特异性和检测范围等指标上也能媲美甚至优于PCR技术，且该方法不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

LAMP的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15～60分钟内实现10⁹～10¹⁰倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。LAMP方法的优势除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，在应用阶段对仪器的要求低，一个简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单，直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光即可，不像普通PCR方法需要进行凝胶电泳观察结果，是一种适合现场、基层快速检测的方法。荧光可视化快速检测犬瘟热病毒的RT-LAMP试剂盒是在LAMP技术的基础上添加了荧光，无需后续的电泳检测，直接在仪器上检测荧光或者肉眼判定，提高了检测的灵敏度。

虽然目前有一些研究者针对犬瘟热病毒开发了基于LAMP的检测方法，但上述方法中依然存在着检测灵敏度相对较低、易产生假阳性，严重制约着在它们在实际检测中的应用。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一组用于快速检测犬瘟热病毒的引物组，并制备具有高灵敏度、高特异性、高准确度、荧光可视化的RT-LAMP试剂盒，用于犬瘟热病毒的快速、精确地检测。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一组用于快速检测犬瘟热病毒的引物组，其包括一对特异性外引物，一对特异性内引物和一条环引物，其核苷酸序列分别为：

外引物F3：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

外引物B3：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

内引物FIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

内引物BIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

环引物LF：核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

环引物LB：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

第二方面，本发明提供了一种用于快速检测犬瘟热病毒的引物组在制备检测试剂中的应用，所述检测试剂优选为试剂盒，所述试剂盒优选为RT-LAMP试剂盒，本发明的试剂盒适用于水浴锅、PCR仪、恒温金属浴、恒温扩增仪等一系列恒温扩增设备。

第三方面，本发明提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和操作简单的快速检测犬瘟热病毒的检测试剂盒，其包含一对特异性外引物、一对特异性内引物和两条环引物，所述引物的核苷酸序列如上所述。

一种用于快速检测犬瘟热病毒的荧光可视化RT-LAMP试剂盒，其包括如上所述的外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF、环引物LB、荧光目视检测剂、含有Bst DNA聚合酶和逆转录酶的酶反应液。

如上所述的荧光可视化RT-LAMP试剂盒，优选地，还包括2×反应缓冲液；

或10×Thermopol buffer、50mmol/L MgSO₄溶液、5.0mmol/L甜菜碱溶液和10mmol/L dNTPs。

如上所述的荧光可视化RT-LAMP试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括阳性质控标准品和阴性质控标准品，所述阳性质控标准品为含有犬瘟热病毒N基因的质粒，犬瘟热病毒N基因的序列如SEQ ID NO.7所示，阴性质控标准品为无RNA酶蒸馏水。

本发明的一个优选试剂盒中，用于检测时，所述RT-LAMP反应液的配方(一个反应体系中RT-LAMP反应液20μL)为：

1、RT-LAMP预混液(18μL)：2×反应缓冲液12.5μL、5μmol/L的外引物F3 1μL、5μmol/L的外引物B3 1μL、40μmol/L的内引物FIP 1μL、40μmol/L的内引物BIP 1μL、20μmol/L的环引物LF 0.75μL、20μmol/L的环引物LB 0.75μL；

2、酶溶液1μL；

3、荧光目视检测试剂1μL。

本发明的一个优选试剂盒，用于检测时，所述RT-LAMP反应液(一个反应体系中RT-LAMP反应液20μL)的配方为：

1、RT-LAMP预混液(17μL)：10×Thermopol buffer 2.5μL、50mmol/L MgSO₄ 3.5μL溶液、5.0mmol/L甜菜碱溶液2.5μL、10mmol/L dNTPs 3μL、5μmol/L的外引物F3 1μL、5μmol/L的外引物B3 1μL、40μmol/L的内引物FIP 1μL、40μmol/L的内引物BIP 1μL、20μmol/L的环引物LF 0.75μL、20μmol/L的环引物LB 0.75μL。

2、酶溶液(1μL):8.0U/μL的Bst DNA聚合酶0.8μL和10U/μL AMV逆转录酶0.2μL。

3、荧光目视检测试剂(2μL)：10mmol/L MnCl₂溶液1.5μL、1.0mmol/L的钙黄绿素溶液0.5μL。

本发明的试剂盒，其工作程序为：

(1)在RT-LAMP专用反应试管里，配制RT-LAMP反应体系；RT-LAMP反应体系25μL配方为：RT-LAMP反应液20μL，待测样品RNA模板为5μL；

(2)将配置好、分装完毕的反应试管置于恒温测定装置中，在63℃下恒温60分钟。

(3)分析数据，显示检测结果。

本发明试剂盒检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：60分钟内呈现绿色。(2)阴性对照：60分钟内呈现橘黄色。待测样本结果判定：(1)阳性：60分钟内呈现绿色。(2)阴性：60分钟内呈现橘黄色。

第四方面，本发明提供了一种用于检测犬瘟热病毒的方法，该方法包括利用本发明中第一方面的引物组合或第三方面的试剂盒对犬瘟热病毒进行检测。具体地：

一种用于检测犬瘟热病毒的方法，其包括如下步骤：

S1、从样品中提取RNA；

S2、对步骤S1提取的所述RNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用如权利要求要求1所述的引物组，置于63℃恒温反应；

S3、结果判定：60分钟内呈现绿色为阳性，60分钟内呈现橘黄色为阴性。

如上所述的用于检测犬瘟热病毒的方法，优选地，在步骤S2中，所述反应体系包括：

18μL的RT-LAMP预混液：2×反应缓冲液12.5μL、5μmol/L的外引物F31μL、5μmol/L的外引物B3 1μL、40μmol/L的内引物FIP 1μL、40μmol/L的内引物BIP 1μL、20μmol/L的环引物LF 0.75μL、20μmol/L的环引物LB 0.75μL；

酶溶液1μL；

荧光目视检测试剂1μL；

和样品RNA 5μL。

17μL的RT-LAMP预混液：10×Thermopol buffer 2.5μL、50mmol/L MgSO₄ 3.5μL溶液、5.0mmol/L甜菜碱溶液2.5μL、10mmol/L dNTPs 3μL、5μmol/L的外引物F3 1μL、5μmol/L的外引物B3 1μL、40μmol/L的内引物FIP 1μL、40μmol/L的内引物BIP 1μL、20μmol/L的环引物LF 0.75μL、20μmol/L的环引物LB 0.75μL；

8.0U/μL的Bst DNA聚合酶0.8μL和10U/μL AMV逆转录酶0.2μL；

10mmol/L MnCl₂溶液1.5μL、1.0mmol/L的钙黄绿素溶液0.5μL；

和样品RNA 5μL。

为了保证检测结果的准确性，及试剂的有效性，在步骤S2中，设置阳性质控和阴性质控进行检测，其中，所述阳性质控为含有犬瘟热病毒N基因的质粒，所述犬瘟热病毒N基因的序列如SEQ ID NO.7所示，所述阴性质控为无RNA酶蒸馏水。

本发明的检测方法可用于临床样品中病毒的检测，也可用于动物饲料、饮水等环境中的病毒检测，此外，本发明的方法还可用于实验室用途。

本发明的发明人经过大量的探索和尝试，通过调整Tm值、GC含量、dG临界值、扩增长度及片段区域等参数，最终设计并筛选出用于检测犬瘟热病毒的最佳引物组合，本发明的引物组合相对于备选的其他引物及现有技术中已知的引物而言，在病毒检测方面具有更高的灵敏度、特异性和准确性，能够更好的实现对犬瘟热病毒的检测。荧光可视化快速检测犬瘟热病毒的RT-LAMP试剂盒是在LAMP技术的基础上添加了荧光目视检测试剂，无需后续的电泳检测，直接在仪器上检测荧光或者肉眼即可判定，提高了检测的灵敏度和灵活性。

利用本发明的引物组合所制备的试剂盒，具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、操作简便等优点，最低检测限在10copies，与实时荧光定量PCR相当，但操作上相对于后者更简便，成本也更低，由于在病毒疫情爆发初期病毒载量较低，因此本发明的试剂盒特别适于在疫情预爆发时现场快速诊断疫病，及时控制疫情。

本发明的引物组合是在犬瘟热病毒流行毒株N基因序列比对基础上，针对其保守区域而进行设计的，从而可以实现对流行病毒株的检测，适用范围更广，检测结果也更准确。

附图说明

图1.本发明引物组合1组的扩增效果验证，其中，1为犬瘟热病毒阳性样本核酸，2为犬细小病毒，3为犬冠状病毒，4为健康犬血液。

图2为引物组合2组的扩增效果验证，其中，1为犬瘟热病毒阳性样本核酸，2为犬细小病毒，3为犬冠状病毒，4为健康犬血液。

图3为利用本发明的引物组合进行LAMP的检测结果，其中，管1为10⁴copies，管2为10³copies，管3为10²copies，管4为10copies，管5为1copies，管6为0.1copies，管7为阴性对照，管8为阳性对照。

图4为Real-time PCR检测结果，其中，POS为阳性对照，编号1-4的曲线分别表示10⁴copies-10copies，编号5、6、7的曲线分别表示1copies、0.1copies和阴性对照。

图5为本发明的引物组合制备的试剂盒特异性检测结果，其中，管1为犬瘟热病毒，管2为犬细小病毒，管3为犬冠状病毒病，管4为狂犬病毒，管5为犬流感病毒，管6为健康犬血液，管7为阴性对照，管8为阳性对照。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 LAMP引物的设计与验证

1、引物的设计

通过对Genbank已发表的30个不同犬细小病毒全基因的数据比对分析，找出一段高度保守的N基因序列(参考序列GenBank:JN896331.1)，运用在线生物软件(http://primerexplorer.jp/)，通过调整Tm值、GC含量、dG临界值、扩增长度和片段区域等参数值，进行设计适用于LAMP的特异性引物组若干组，包括基础引物(F3、B3、FIP、BIP)、环引物(LB)和环引物(LF)，其中2组如表1所示，环引物为非必须引物，但设计环引物的主要目的是加速反应过程，缩短反应时间，通过对引物组进行大量实验筛选，选出特异性好、灵敏度高的1个引物组，实验验证最终得到本发明的引物组合为引物1组。具体见表1所示。

表1引物序列

2、引物的筛选及验证

(1)毒株与试剂

犬瘟热病毒阳性样本核酸、犬细小病毒、犬冠状病毒由北京市动物疫病预防控制中心实验室保存。LAMP扩增试剂购自荣研生物科技(中国)有限公司。

(2)在

实时浊度测定仪器(LA-320C)上使用设计的引物组合(表1)进行LAMP扩增，扩增反应体系(25μL)为：

RT-LAMP预混液(18μL)：2×反应缓冲液12.5μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP246)、5μmol/L的外引物F3 1μL、5μmol/L的外引物B3 1μL、40μmol/L的内引物FIP 1μL、40μmol/L的内引物BIP 1μL、20μmol/L的环引物LF 0.75μL、20μmol/L的环引物LB 0.75μL；

Bst DNA聚合酶溶液1μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP246)；

荧光目视检测试剂1μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP221)；

RNA样品5μL；

扩增反应工作程序为：63℃，120min。

(3)扩增结果如图1和图2所示，引物1组在第28min检出犬瘟热病毒阳性样本核酸(见图1中的编号1)，犬细小病毒、犬冠状病毒、犬健康血液(见图1中的编号2-4)在120min内均未检出。引物2组在第45min检出犬瘟热病毒阳性样本核酸(见图2中的编号1)，犬细小病毒、犬冠状病毒、犬健康血液(见图2中的编号2-4)在120min内均未检出。结果表明，本发明的引物组1具有较高的扩增效率和特异性。

实施例2在

实时浊度测定仪器上检测犬瘟热病毒的RT-LAMP方法退火温度的优化

1、选择引物组合为：实施例1表1中的引物组1组。

2、RT-LAMP扩增反应体系如实施例1，即RT-LAMP预混液18μL，酶溶液1μL，荧光目视检测试剂1μL，RNA 5μL。

3、在Loopamp仪上进行扩增，设置61℃，63℃，65℃，67℃四个温度。

4、分析结果：结果显示，63℃条件下扩增效果最好，选择63℃作为本发明的引物组合的扩增温度。

实施例3病毒RNA提取

1、样品采集：采集发病犬口鼻眼分泌物和血液，病死犬的肝脏、脾脏，采集的样品2～8℃保存，送实验室检测(要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料)。

2、样品处理：每份样品分别处理。

(1)分泌物及血液样品处理：分泌物棉签拭子样品加灭菌PBS，搅拌混匀后保存备用；血液样品3000转/分钟离心后取上清保存备用。

(2)组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。

(3)阳性对照处理：取阳性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

(4)阴性对照处理：取阴性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

3、病毒RNA的提取(可采用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的柱式RNA核酸提取试剂盒)

(1)取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600μL，充分颠倒混匀，室温静置3～5min。

(2)将液体吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱)，13000rpm离心30s。

(3)弃去收集管中液体，加入600μL洗液，13000rpm离心30s。

(4)重复步骤(3)。

(5)弃去收集管中液体，13000rpm空柱离心2min，以除去残留的洗涤液。

(6)将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，向柱中央加入洗脱液50μL，室温静置1min，13000rpm离心30s，离心管中液体即为模板RNA。

实施例4使用制备的RT-LAMP试剂盒检测犬瘟热病毒

1、荧光可视化快速检测犬瘟热病毒的RT-LAMP试剂盒的组装

RT-LAMP试剂盒中可含有如表1中引物1组所示的各引物，含有Bst DNA聚合酶和逆转录酶的酶反应液(可购置于荣研生物科技有限公司)，荧光目视检测剂(可购置于荣研生物科技有限公司)，阳性质控标准品，阴性质控标准品，2×反应缓冲液(RM)。RT-LAMP试剂盒的组装可根据需要制备成检测24次、48次、96次、192次等不同次数的试剂盒，用合适的外包装盒包装试剂，贴标签，标示名称、批号、生产日期、有效期等，下面例举可检测48次的试剂盒。

规格及数量(48T/盒)。

溶液A(RT-LAMP预混液)1支，864μL；溶液B(Bst DNA聚合酶反应液)1支48μL，溶液C(荧光目视检测剂)1支，48μL；溶液D(阳性质控标准品)1支，100μL；溶液E(阴性质控标准品)1支，100μL。阳性质控标准品使用含有犬瘟热病毒N基因的重组质粒为阳性模板，N基因序列如SEQ ID NO.7所示，阴性质控标准品使用空载体质粒为阴性模板，使用Tris-EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)稀释后冷冻保存。将检验合格的阳性对照和阴性对照制剂均按100μL定量分装。

上述RT-LAMP预混液一个检测反应18μL的配方为：2×反应缓冲液12.5μL、5μmol/L的外引物F3 1μL、5μmol/L的外引物B3 1μL、40μmol/L的内引物FIP 1μL、40μmol/L的内引物BIP 1μL、20μmol/L的环引物LF 0.75μL、20μmol/L的环引物LB 0.75μL。

2、实验流程

(1)使用时，在18μL的RT-LAMP预混液中加入1μL Bst DNA聚合酶反应液、1μL荧光目视检测剂和5μL的RNA模板，得到25μL的RT-LAMP反应体系，用于反应。

(2)将配置好、分装完毕的反应试管置于

实时浊度测定仪器中在63℃下恒温60分钟。

(3)分析数据，显示检测结果。

3、结果分析和判定

本发明试剂盒检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：60分钟内呈现绿色。(2)阴性对照：60分钟内呈现橘黄色。

待测样本结果判定：(1)阳性：60分钟内呈现绿色。(2)阴性：60分钟内呈现橘黄色。

实施例5RT-LAMP试剂盒

RT-LAMP试剂盒可制成含有如表1中引物1组所示的各引物，8.0U/μL的Bst DNA聚合酶，10U/μL AMV逆转录酶，10mmol/L MnCl₂溶液，1.0mmol/L的钙黄绿素溶液，50mmol/LMgSO₄溶液，5.0mmol/L甜菜碱溶液，10mmol/L dNTPs。

用于检测时，配制的一个反应体系中RT-LAMP反应液20μL的配方如下：

进一步，试剂盒还可含质控品：有犬瘟热病毒N基因的质粒的阳性质控标准品和无RNA酶蒸馏水的阴性质控标准品。

实施例6灵敏度检验

1、模板的制备：将犬瘟热病毒N基因片段(序列如SEQ ID NO.7所示)合成质粒，质粒浓度经计算定量为2×10³copies/μL，进行10倍倍比稀释，分别进行RT-LAMP和Real-timePCR扩增，检测灵敏度。

2、RT-LAMP反应体系，采用实施例4中的试剂盒：RT-LAMP预混液18μL，酶反应液1μL，荧光目视检测剂1μL，模板5μL，总体积25μL。反应程序为：63℃ 60min。

LAMP检测结果如图3所示，其中，管1为10⁴copies，管2为10³copies，管3为10²copies，管4为10copies，管5为1copies，管6为0.1copies，管7为阴性对照，管8为阳性对照。结果表明，管1-管4均为阳性(显示绿色)，管5-管8均为阴性，即该方法的检测最低限为10copies。

3、Real-time PCR反应体系：按照犬瘟热病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒(购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，生产批号CD20190704P)进行操作。反应体系是：无菌无核酸酶水2.7μL，RT-PCR反应液10μL，酶混合液0.4μL，荧光探针1.9μL，模板5μL，总体积20μL。反应程序为：45℃ 15min，95℃ 1min；循环95℃ 5s，60℃ 35s，循环数为40。在每次循环第二步(60℃ 35s)收集荧光信号(报告基团“FAM”，淬灭基团“None”)。

Real-time PCR的检测结果如图4所示，其中，POS为阳性对照，编号1的曲线为10⁴copies，编号2的曲线为10³copies，编号3的曲线为10²copies，编号4的曲线为10copies，编号5的曲线为1copies，编号6的曲线为0.1copies，编号7的曲线为阴性对照，结果显示Real-time PCR的灵敏度为10copies。结果说明本发明的LAMP检测灵敏度与Real-time PCR检测灵敏度基本一致。

实施例7特异性检验

1、用本发明制备的试剂盒按照实施例4表述的方法分别检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒病、狂犬病毒、犬流感病毒、健康犬血液等提取的基因组，验证反应体系的特异性，上述病毒由北京市动物疫病预防控制中心提供。

2、检测结果如图5所示，从该图可以看出，本发明的试剂盒可以成功检测出犬瘟热病毒(管1)；犬细小病毒、犬冠状病毒病、狂犬病毒、犬流感病毒、健康犬血液均未检出(分别对应管2、管3、管4、管5、管6)，结果表明本发明的引物组合制备的试剂盒具有良好的特异性。

实施例8临床样品检测

1、用本发明实施例5的试剂盒和实施例6中的实时荧光定量RT-PCR方法同时检测30份临床样品(其中22份为阴性样本，8份为阳性样品)，分析两种检测结果的符合率。

2、检测结果显示，用所建立的LAMP方法与荧光定量PCR方法检测结果一致(表2)，符合率为100％。但LAMP方法设备依赖低，结果可视化，适用于现场的快速检测。

表2 RT-LAMP与荧光定量RT-PCR方法检测结果

以上检测结果证明了本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、检测方便快捷、结果准确可靠。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京市动物疫病预防控制中心

<120> 用于快速检测犬瘟热病毒的引物组、荧光可视化RT-LAMP试剂盒及方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatcaacaac ccccaacc 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gactgagcat cttagtaagc at 22

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taccctggaa accgttcatc attgcaagag gtccgaaaac caa 43

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acagctccga atggagtgaa tccatcgatt tccggtcatc 40

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggatggggt atttgtctcc t 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acccagacta ttcaagatga tgga 24

<210> 7

<211> 229

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aatcaacaac ccccaaccat caacaagagg tccgaaaacc aaggaggaga caaatacccc 60

atccacttca atgatgaacg gtttccaggg tacacccctg atgtcaacag ctccgaatgg 120

agtgaatcac gctatgatac ccagactatt caagatgatg gaaacgacga tgaccggaaa 180

tcgatggaag caatcgccaa gatgagaatg cttactaaga tgctcagtc 229

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcttggcatc accaagga 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggggtattt gtctcctcct 20

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtgcgaatcg tccggtcctc agaggctcag ctagtgtca 39

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgctggtccc aagcaatctc aattgatggt tgggggttgt t 41

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcacttttct gcactcagaa agatc 25

Claims

1.一组用于快速检测犬瘟热病毒的引物组，其特征在于，其包括：

外引物F3：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

外引物B3：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

内引物FIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

内引物BIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

环引物LF：核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

环引物LB：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.权利要求1所述的引物组在制备检测犬瘟热病毒的RT-LAMP试剂盒中的应用。

3.一种用于快速检测犬瘟热病毒的荧光可视化RT-LAMP试剂盒，，其特征在于，其包括如权利要求1中所述的外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF、环引物LB、荧光目视检测剂、含有Bst DNA聚合酶和逆转录酶的酶反应液。

4.根据权利要求3所述的荧光可视化RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×反应缓冲液。

5.根据权利要求3所述的荧光可视化RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒10×Thermopol buffer、50mmol/L MgSO₄溶液、5.0mmol/L甜菜碱溶液和10mmol/L dNTPs。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的荧光可视化RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控标准品和阴性质控标准品，所述阳性质控标准品为含有犬瘟热病毒N基因的重组质粒，所述犬瘟热病毒N基因的序列如SEQ ID NO.7所示，阴性质控标准品为无RNA酶蒸馏水。

7.一种用于检测犬瘟热病毒的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1、从样品中提取RNA；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述反应体系包括：

18μL的RT-LAMP预混液：2×反应缓冲液12.5μL、5μmol/L的外引物F3 1μL、5μmol/L的外引物B3 1μL、40μmol/L的内引物FIP 1μL、40μmol/L的内引物BIP 1μL、20μmol/L的环引物LF0.75μL、20μmol/L的环引物LB 0.75μL；

酶溶液1μL；

荧光目视检测试剂1μL；

和样品RNA 5μL。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述反应体系包括：

17μL的RT-LAMP预混液：10×Thermopol buffer 2.5μL、50mmol/L MgSO₄ 3.5μL溶液、5.0mmol/L甜菜碱溶液2.5μL、10mmol/L dNTPs 3μL、5μmol/L的外引物F3 1μL、5μmol/L的外引物B3 1μL、40μmol/L的内引物FIP 1μL、40μmol/L的内引物BIP 1μL、20μmol/L的环引物LF0.75μL、20μmol/L的环引物LB 0.75μL；

8.0U/μL的Bst DNA聚合酶0.8μL和10U/μL AMV逆转录酶0.2μL；

10mmol/L MnCl₂溶液1.5μL、1.0mmol/L的钙黄绿素溶液0.5μL；

和样品RNA 5μL。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，设置阳性质控和阴性质控进行检测，其中，所述阳性质控为含有犬瘟热病毒N基因的质粒，所述犬瘟热病毒N基因的序列如SEQ ID NO.7所示，所述阴性质控为无RNA酶蒸馏水。