CN111996288A - 检测冠状病毒的组合物、试剂盒和方法 - Google Patents

检测冠状病毒的组合物、试剂盒和方法 Download PDF

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seq
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张萌
刘磊
李改玲
李妍
冯燕
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Genemind Biosciences Co Ltd
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

本发明提出了一种检测冠状病毒的组合物，该组合物包括Seq ID:1和Seq ID:2所示序列和/或Seq ID:3和Seq ID:4所示序列，其中，该组合物还可以包含Seq ID:5和Seq ID:6所示序列。利用本发明提供的组合物可以对新冠状病毒的ORF1ab基因和/或N基因进行有效扩增和荧光定量PCR检测，检测步骤简单、降低了污染风险，能够快速、高效、准确的检出目的基因。本发明还提供了检测冠状病毒的试剂盒及用于非诊断目的的检测冠状病毒的方法，该方法具有良好的稳定性、灵敏度及特异性。

Description

检测冠状病毒的组合物、试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及检测冠状病毒的组合物、试剂盒和用于非诊断目的的检测冠状病毒的方法。
背景技术
冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)，根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ和δ四个属，可以感染许多动物物种，包括人、蝙蝠、狗、猪、老鼠、鸟、牛、鲸、马、山羊、猴子等。已知感染人的冠状病毒有6种，包括α属的229E和NL63，β属的OC43和HKU1、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERSr-CoV)和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARSr-CoV)。2019爆发的新型冠状病毒属于β属的新型冠状病毒。
新型冠状病毒引起的新冠肺炎常见体征有发热、咳嗽、气促和呼吸困难等呼吸道症状。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，进一步导致死亡。目前对于2019新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，但许多症状可以对症进行辅助护理和支持性治疗。
针对该病毒导致的临床疾病，迫切需要开发灵敏、快速、特异、稳定和便于使用的诊断方法，第一时间提供准确、特异性的快速检测探针引物，对于该疾病的防控极为重要，在临床应用中能够为明确病原、早期诊断提供依据，促进早期合理治疗，减少经验性抗生素使用增加的耐药负担，及时控制病情。荧光定量PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。随着PCR反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，结合相应的软件分析，可以得到荧光扩增曲线，计算待测样品初始模板的量。当在荧光定量PCR检测系统中引入内参基因，其同时与目的基因检测，计算出一个待测样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列表达的相对变化。
研发一种能够快速准确检测新型冠状病毒且简单的方法具有重要意义。此外，仍然需要设计性能更优的引物和探针，以快速、特异、灵敏、精确检测新型冠状病毒。
发明内容
在本发明中，我们成功设计了针对新型冠状病毒的两个基因的引物和探针，利用该引物和探针能够特异性扩增新型冠状病毒SARS-CoV-2样本，具有较好的稳定性、灵敏度和特异度。
本发明第一方面提供了一种检测冠状病毒的组合物，组合物包括Seq ID:1和SeqID:2所示序列组成的第一对引物。利用此引物对可有效扩增新冠状病毒的ORF1ab基因，从而判断是否存在冠状病毒是否存在及是否存在ORF1ab基因片段。
本发明第二方面提供了一种试剂盒，该试剂盒包含Seq ID:1和Seq ID:2所示序列组成的第一对引物，和/或Seq ID:3和Seq ID:4所示序列组成的第二对引物，和/或Seq ID:5所示序列的探针，和/或Seq ID:5、Seq ID:6所示序列的两种探针，其中所述两种探针标记不同的荧光报告基团。
由此，根据本发明的实施例，本发明第二方面提供的试剂盒可分别用于扩增ORF1ab基因和/或N基因，荧光定量PCR检测ORF1ab基因和/或N基因，该试剂盒进行荧光定量PCR进行检测时，具有较好的灵敏度和特异度。
本发明第三方面提供了一种用于非诊断目的的检测冠状病毒的方法，该方法包括以下步骤：
获取待测样本的核酸；
使用本发明第一方面提供的组合物或第二方面提供的试剂盒对样本核酸进行扩增；
获得并分析结果。
利用此方法，可以对用于非诊断目的的检测冠状病毒进行有效检测，如对含有冠状病毒ORF1ab基因和/或N基因片段的质粒、纯病毒浓度等进行检测。
附图说明
图1显示了根据本发明一个实施例，荧光定量PCR扩增的扩增曲线；
图2显示了根据本发明一个实施例，荧光定量PCR扩增的标准曲线；
图3显示了根据本发明一个实施例，荧光定量PCR扩增的扩增曲线；
图4显示了根据本发明一个实施例，荧光定量PCR扩增的标准曲线。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。示例中的试剂、检测仪器等，如无特殊说明，可自配或者通过市售途径获取。
本发明第一方面提供了一种检测冠状病毒的组合物，组合物包括Seq ID:1和SeqID:2所示序列组成的第一对引物。利用此引物对可有效扩增新冠状病毒的ORF1ab基因，从而判断是否存在冠状病毒是否存在及是否存在ORF1ab基因片段。
根据本发明的实施例，检测冠状病毒的组合物还包含Seq ID:3和Seq ID:4所示序列组成的第二对引物。在一种情况下，这两对引物可以分别进行PCR扩增，分别获得ORF1ab基因和N基因的扩增片段。扩增的片段可通过凝胶电泳等方法进行检测。在另一种情况下，两队引物可以混合后同时进行PCR扩增，同时获得ORF1ab基因和N基因的扩增片段。
根据本发明的实施例，检测冠状病毒的组合物包含Seq ID:1和Seq ID:2所示序列组成的第一对引物和Seq ID:5所示序列的探针。利用此组合物，可以对ORF1ab基因进行荧光定量PCR扩增，从而可以确定新型冠状病毒的拷贝数或含有的ORF1ab基因片段的拷贝数。
根据本发明人的实施例，检测冠状病毒的组合物可同时包含Seq ID:1-6所示序列。利用此组合物可同时对ORF1ab基因和N基因进行荧光定量PCR扩增，也可分别对俩基因进行荧光定量PCR扩增。优先选择同时对ORF1ab基因和N基因进行荧光定量PCR扩增，其中Seq ID:5和Seq ID:6所示序列的两种探针标记不同的荧光报告基团，如分别表记FAM、HEX荧光报告基团，荧光淬灭接团选择性标记BHQ。
本发明第二方面提供了一种试剂盒，该试剂盒包含Seq ID:1和Seq ID:2所示序列组成的第一对引物，和/或Seq ID:3和Seq ID:4所示序列组成的第二对引物，和/或Seq ID:5所示序列的探针，和/或Seq ID:5、Seq ID:6所示序列的两种探针。
利用本发明第二方面提供的试剂盒可分别用于扩增ORF1ab基因和/或N基因，荧光定量PCR检测ORF1ab基因和/或N基因。
根据本发明的实施例，所述探针是标记报告基团的核酸序列，报告基团是用于荧光PCR检测的荧光报告基团，无特别限制，两种探针可标记相同的荧光基团也可标记不同的荧光基团，优选选择标记不同的荧光基团，如FAM、HEX报告基团，利用标记不同报告基团的探针在荧光PCR过程中可同时采集荧光信号进行分析，可简化操作、节省时间。
根据本发明的实施例，试剂盒还包含阳性对照。
可以理解，阳性对照在生物实验中，可用作反映实验是否成功的判断指标。阳性样品的选择与实验目的直接相关，直接影响实验结果的准确性和有效性。根据本发明的实施例，所述的阳性对照选择含有目的检测片段的质粒，其中所述目的片段为ORF1ab基因或/和N基因片段。
本发明第三方面提供了一种用于非诊断目的的检测冠状病毒的方法，该方法包括以下步骤：
获取待测样本的核酸；
使用本发明第一方面提供的组合物或第二方面提供的试剂盒对样本核酸进行扩增；
获得并分析结果。
其中，所述的扩增包括反转录扩增及以反转录产物为模板进行PCR扩增或荧光定量PCR扩增，根据本发明实施例，反转录扩增所需的试剂和荧光定量PCR扩增所需试剂同时加入同一反应管中，即两种反应在同一反应管中进行，两种反应之间无纯化步骤从而简化了实验操作，降低了污染风险，能够快速、高效、准确的检出目的基因，且检测方法具有良好的稳定性、灵敏度和特异度。所述的目的基因为新型冠状病毒的ORF1ab基因和/或N基因。
根据本发明实施例，所述荧光定量PCR的反应条件为：逆转录，温度为50℃，时间10-20分钟，1次循环；预变性，温度为95℃，时间5-12分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为10-20秒，退火，温度为58℃，时间为20-40秒，采集信号，40-45次循环。其中，每一次荧光信号采集各采集两种不同的荧光信号，根据信号绘制扩增曲线。利用本发明提供的方法，阳性样品的判断标准为：两条扩增曲线的Ct值≤38或一条扩增曲线Ct值≤38，另一条扩增曲线无Ct值，若重复检测结果显示一致，则为阳性；疑似样品判断。
实施例1试剂盒的制备
以下示例试剂盒的制备方法。
试剂盒包含管1，管1为引物混合物，用于扩增新型冠状病毒(SARS-CoV-2)ORF1ab和N基因，该引物混合物由4种引物序列组成，具体引物序列见表1所示。在一种情况下，管1还包含探针混合物，该探针混合物分别为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)ORF1ab和N基因保守区的探针，分别标记不同的荧光分子，在本实施例中，ORF1ab基因的探针标记FAM，N基因标记HEX。探针的具体序列见表1所示。管1的每种引物和每种探针的使用浓度范围为8-15uM，优先10uM。利用包含管1的试剂盒可有效扩增新型冠状病毒(SARS-CoV-2)ORF1ab和N基因，并通过荧光定量PCR检测新型冠状病毒的拷贝数量。
在制备管1时，每种引物序列和探针序列都是由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，然后用去RNase Free H2O(去核酸水)配置成大于使用浓度的溶液。在一种情况下，试剂盒中的每种引物和每种探针分别保存，使用时混合；在另一种情况下，试剂盒中引物和探针混合后保存，混和后的浓度不低于使用浓度。
表1
Figure BDA0002603359990000041
Figure BDA0002603359990000051
其中，FAM、HEX为荧光基团，BHQ1为荧光猝灭基团.
在一些情况中，试剂盒还包含管2和管3，分别为阳性对照和阴性对照。在本实施例中，管3的阴性对照为去核酸H2O。管2的阳性为ORF1ab阳性质粒和N阳性质粒的混合物，该质粒由金斯瑞生物科技股份有限公司提供ORF1ab阳性质粒菌液和N阳性质粒菌液来培养提取获得。管2中阳性质粒制备过程及检测过程如下：
1.阳性质粒提取
推荐使用天根快速质粒小提试剂盒(货号：DP105)，提取步骤：
(1)取1～2ml过夜培养的菌液，根据体积加入到1.5ml或2ml离心管中，12，000rpm(～13,400xg)离心1min,去除上清；
(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入150μL混合好的P1溶液(含RNase A和TIANRed)，涡旋振荡，使沉淀菌体重新悬浮，混匀后溶液呈浑浊紫红色；
(3)向离心管中加入150μL溶液P2，手动反转6-8次使菌体充分裂解，混匀后溶液变至澄清的紫色；
(4)向离心管中加入350μL溶液P5，立刻快速上下颠倒混匀12-20次，此时溶液中出现大量絮状沉淀，12，000rpm(～13,400xg)离心2min；
(5)移液器收集离心后的上清液转移到吸附柱CP3中，小心避免吸入沉淀，12，000rpm(～13,400xg)离心30sec,丢弃过滤液，将吸附柱放回收集管；
(6)向吸附柱CP3中加入300μL漂洗液PWT(加过无水乙醇)，12，000rpm(～13,400xg)离心30s,丢弃过滤液，将吸附柱放回收集管；
(7)将吸附柱放回离心机，12，000rpm(～13,400xg)离心1min,去除残余漂洗液；
(8)将吸附柱放置到干净的离心管中，向吸附膜上加入20-100μL洗脱缓冲液TB，12，000rpm(～13,400xg)离心30s，收集质粒回溶液放置冰盒上，进行下一步质控。
2.阳性质粒检测
(1)质量浓度检测
使用Qubit BR dsDNAAssay Kit,检测提取的两种阳性质粒原液的质量浓(ng/μL)；然后根据下面公式换算至拷贝数浓度(拷贝/μL)；
Figure BDA0002603359990000061
Figure BDA0002603359990000062
(2)荧光定量PCR检测
阳性质粒定量后经过梯度稀释和荧光定量PCR检测的过程如下：阳性质粒稀释物，稀释梯度为10000copies，1000copies，100copies，10copies。并对阳性样本进行3次重复。同时使用去核酸水作为阴性对照，并设置4个重复，如表2所示：
表2
样品信息 重复例数
阳性质粒10000copies 3
阳性质粒1000copies 3
阳性质粒100copies 3
阳性质粒10copies 3
阴性对照 4
将各组分放于冰上解冻，在使用前请充分混匀并短暂离心，按所需反应管数进行反应液的配制。配制方法如表3如下：
表3
Figure BDA0002603359990000065
其中2×RT-qPCR缓冲液、及Enzyme Mix可选择上海翊圣生物科技有限公司提供的试剂盒(
Figure BDA0002603359990000063
V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit)中对应的试剂或南京诺唯赞生物科技有限公司提供的反转录试剂盒中对应的试剂。
Enzyme Mix是反转录酶和DNA扩增酶的混合物，其中反转录酶选用耐热的反转录酶进行逆转录，可高效的合成第一链cDNA，DNA扩增酶选择Hotstart Taq Polymerase。两种酶可通过市售产品获得。
反应程序如表4所示：
表4
Figure BDA0002603359990000064
Figure BDA0002603359990000071
判断标准：当待检测物Ct值小于35即认定为阳性，且阴性对照无Ct值或者Ct值大于35。判断为疑似样品的标准为：当一个通道显示S型扩增曲线，并且Ct值≤38，另一个通道显示无Ct值。如果复测结果显示一致，则为阳性。(2)至少一个通道显示38<Ct值<40。如果复测结果显示，一个通道呈S型曲线且38<Ct值<40，另一通道呈S型曲线且Ct值≤38，则为阳性。若都为38<Ct值<40，则为疑似样本。
实验结果：阳性质粒按梯度有序检出，阴性样品无Ct值。扩增结果为双通道阳性，Ct≤30，扩增曲线有明显的指数增长期。
反应结束后，所得到的结果参数需达到以下要求：
Figure BDA0002603359990000072
样本孔的Ct值需小于阴性对照，相近或高于阴性对照，不合格；
Figure BDA0002603359990000073
样本孔溶解曲线出峰单一，且出峰位置一致；
Figure BDA0002603359990000074
绘制出的标准曲线R2≥0.99
Figure BDA0002603359990000075
标准曲线的斜率位于-3.1～-3.6之间，代表扩增效率在90～110％。
其中阳性质粒Ct值如表5所示：
表5
Figure BDA0002603359990000076
在一些情况中，试剂盒还包含管4和管5，例如包含酶混合物(Enzyme Mix)的管4装，包含反应缓冲液的管5。其中管4中的酶混合物由反转录酶和DNA扩增酶组成，用于RNA反转录及cDNA扩增。其中反应缓冲液、及Enzyme Mix可选择上海翊圣生物科技有限公司提供的试剂盒(
Figure BDA0002603359990000077
V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit)中对应的试剂或南京诺唯赞生物科技有限公司提供的反转录试剂盒中对应的试剂。
利用此试剂盒进行检测时，RNA反转录及cDNA扩增在同一反应体系中同时进行，简化了实验操作，降低了污染风险，能够快速、高效、准确的检出目的基因。
实施例2特异性检测
以与甲型流感病毒H1N1(pdm09)、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒Victoria、乙型流感病毒(Yamagata)、丙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、人博卡病毒、人副流感病毒、人偏肺病毒、轮状病毒/肠病毒、腺病毒、人冠状病毒(HKU1、OC43、229E和NL63)、中东呼吸综合症冠状病毒等病毒核酸作为模板，利用上述试剂盒进行荧光定量PCR检测，进行检测时的反应体系参照表3配置，反应流程参照表4设置。检测结果显示上述病毒检测结果都为阴性。
实施例3试剂盒的应用
实施例1制备的试剂盒用于含有新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的ORF1ab和/或N基因扩增和非诊断目的的检测，例如，质粒中是否含有ORF1ab和/或N基因、纯病毒样本浓度的检测、假病毒额检测等。
检测过程中，据待检测的样本数，计算总反应数(N)，确保包括阴性对照(1个反应)、阳性对照(1个反应)和每个样本。根据反应数(N)，按表6配制PCR反应体系。
表6
Figure BDA0002603359990000081
本实施例中采用2019-nCOV假病毒作为检测样本，假病毒购买于上海翊圣生物科技有限公司，货号位11900ES03，2019-nCOV假病毒是将COVID-19病毒的部分基因与逆转录病毒载体整合，在293T细胞内进行假病毒的制备而获得。并于56摄氏度条件下灭活30min。可最大程度上模拟nCOV的病毒结构，RNA提取按照说明书中操作步骤进行。
本实施例是将本发明实施例1中制备的试剂盒与国家疾病控制中心公开的检测引物和探针(见表7所示)进行对比检测，对比检测结果图见图1-4，图1为采用国家疾病控制中心公开的检测引物和探针进行荧光定量PCR扩增的扩增曲线；图2采用国家疾病控制中心公开的检测引物和探针进行荧光定量PCR扩增的标准曲线；图3为采用本发明组合物进行荧光定量PCR扩增的扩增曲线；图4采用本发明组合物进行荧光定量PCR扩增的标准曲线。
检测的结果显示利用本发明组合物进行荧光定量PCR扩增检测假病毒拷贝数分别为105，104，103，102，检测线性好，100拷贝双基因稳定检出，稳定性及检测灵敏度波动小；国家疾病控制中心公开的检测引物和探针进行荧光定量PCR扩增检测的假病毒拷贝数分别为106，105，104，103，102，检测线性不好，100拷贝只有单基因检出，稳定性及检测灵敏度波动较大。
表7
Figure BDA0002603359990000091
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 深圳市真迈生物科技有限公司
<120> 检测冠状病毒的组合物、试剂盒和方法
<130> PI2020009
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 引物序列
<400> 1
gccgttgcca catagatca 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 引物序列
<400> 2
taagacgggc tgcacttaca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 引物序列
<400> 3
gttcctcatc acgtagtcgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 引物序列
<400> 4
gttgttggcc tttaccagac 20
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 第一位核苷酸修饰6-FAM
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 第28位核苷酸修饰BHQ-1
<400> 5
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 第一位核苷酸修饰6-HEX
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> 第20位核苷酸修饰BHQ-2
<400> 6
ttgctgctgc ttgacagatt 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 引物序列
<400> 7
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 引物序列
<400> 8
acgattgtgc atcagctga 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> 引物序列
<400> 9
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> 引物序列
<400> 10
cagacatttt gctctcaagc tg 22

Claims (10)

1.一种检测冠状病毒的组合物，其特征在于，所述组合物包括：
Seq ID:1和Seq ID:2所示序列组成的第一对引物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括：
Seq ID:3和Seq ID:4所示序列组成的第二对引物。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括：
Seq ID:5所示序列的探针。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括：
Seq ID:5和Seq ID:6所示序列的两种探针；
其中，所述两种探针标记不同的荧光报告基团。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述报告基团选自FAM、HEX。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-5任一所述的组合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含阳性对照。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有目的检测片段的质粒，其中所述目的片段为ORF1ab基因或/和N基因片段。
9.一种用于非诊断目的的检测冠状病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
获取待测样本的核酸；
使用权利要求1-5任一所述的组合物或权利要求6-8任一所述的试剂盒对样本核酸扩增；
获得并分析结果。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述扩增包括反转录扩增和荧光定量PCR扩增；
优选地，所述荧光定量PCR扩增的反应条件为：
逆转录，温度为50℃，时间10-20分钟，1次循环；预变性，温度为95℃，时间5-12分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为10-20秒，退火，温度为58℃，时间为20-40秒，采集信号，40-45次循环。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2022225851A1 (en) * 2021-04-19 2022-10-27 Yale University Colorimetric covid-19 rapid-test and methods of using same

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