CN103224996A

CN103224996A - 一种荧光定量rt-pcr检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法

Info

Publication number: CN103224996A
Application number: CN2013101234011A
Authority: CN
Inventors: 张以芳; 马志亮; 范斌; 柴俊; 孙亭亭; 邹丰才; 刘岳; 柳桐; 杨洁
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2013-04-10
Filing date: 2013-04-10
Publication date: 2013-07-31

Abstract

本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法, 属疫苗质量监测技术领域。本发明方法包括特异性引物及Taqman荧光探针的设计、RNA提取、cDNA制备、标准质粒构建、Taqman荧光定量PCR检测标准曲线的建立、有效性验证和结果判定。设计合成了两对引物，均能特异性扩增猪瘟兔化弱毒病毒的cDNA，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2扩增产物大小为197bp，用于构建标准浓度的质粒，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4扩增产物大小为143bp，包含于前述扩增产物197bp之内,加入荧光探针SEQ ID NO.5用于Taqman荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量。本发明方法检测灵敏度高，检测时间短，能同时进行大批量的样本分析，具有良好的敏感性、特异性、重复性，适用于各品牌猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的测定。

Description

一种荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法

技术领域：

本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法，属疫苗质量检测技术领域。

背景技术：

猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（Classicalswine fever virus, CSFV）引起的一种急性、发热性、高度接触性的病毒性传染病。是养猪业的一种毁灭性传染病，几乎遍及全世界，死亡率高达80%～90%，国际动物卫生组织将猪瘟列入A类法定传染病之一。

目前，疫苗接种仍然是预防和控制猪瘟的重要手段，在20世纪50年代中期，中国学者通过将猪瘟石门系强毒在兔体上连续传几百代后培育成功了一株猪瘟兔化弱毒疫苗。该疫苗是国际公认的最安全有效的弱毒疫苗，在我国乃至全球得到广泛应用，在 1976年在由联合国粮农组织和欧共体召开的专家会议上，专家一致认为中国创制的猪瘟兔化弱毒疫苗的应用对控制和消灭欧洲的猪瘟做出了重大贡献。经历了半个世纪的风雨洗礼，该疫苗的地位和价值至今无可动摇。国内使用猪瘟兔化弱毒疫苗，使猪瘟大规模流行得到了有效的控制，但猪瘟局部地区流行仍时有发生，防治猪瘟仍然是我国养猪业的重要任务。

疫苗病毒抗原含量的高低是疫苗质量的关键指标。传统的检验方法主要是通过疫苗注射后检测免疫动物血清来确定疫苗效价，如使用兔体定型热反应法、ELISA、免疫过氧化酶单层实验、血清中和实验等，但随着生物技术的快速发展，这些方法已经越来越凸显出其劣势：如免疫动物后才能确定疫苗的质量，需时长，操作过程繁琐、由于动物个体差异导致准确度低等，无法满足现有的需要。各疫苗厂家生产的猪瘟兔化弱毒疫苗的效果存在一定差异，因此，建立Taqman荧光定量RT-PCR技术来检测猪瘟兔化弱毒疫苗的病毒含量，具有极其重要的意义。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种省时、省力，特异性高、重复性好、敏感度高的荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法。

本发明的荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法的步骤如下：

1、通过生物学软件DNAstar比对GenBank数据库中登录的中国国内测序的6株猪瘟兔化弱毒的毒株全序列，最终选择登录号为AF091507的基因序列，并在其高度保守区5′端开放阅读框区域设计一对标准品引物（SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2）以及一对定量用引物（SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4）和一条探针（SEQ ID NO.5）。引物及探针详情如表1-1和表1-2。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2用于构建标准浓度的质粒；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4扩增包含于SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2扩增产物片段之内的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒cDNA； SEQ ID NO：5为Taqman荧光探针，在其5’端标记报告荧光基团FAM，3’标记猝灭荧光基团TAMRA，用于建立荧光定量PCR标准曲线及检测未知样品；

表 1-1 标准品引物相关参数

Tab1-1 Parameters of the Standard Primer

表 1-2定量引物和探针的相关参数

Tab1-2 Parameters of the Quantitive Primer and Probe

2.猪瘟兔化弱毒疫苗病毒RNA的提取

a.使用RNase Free水将疫苗稀释，每10头份分量加入2ml RNase Free水，充份混均。

b.吸取200μl RNase Free水稀释的疫苗，加入到含有1ml Trizol的离心管里，充分混匀，室温静置五分钟。

c.加入200μl 氯仿到离心管，充分混匀后于-20℃静置10分钟，取出立即于4℃低温离心10分钟，12000g/min。

d.小心吸取全部上清液体到新的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀后-20℃静置20min，取出后立即于4℃低温离心10分钟，12000g/min。

e.弃掉所有上清，并加入1ml 75%的冰乙醇，取出后立即于4℃低温离心5分钟，12000g/min。

f.弃掉管内全部液体，室温静置三分钟，待残余乙醇挥发完毕，立即加入33μl RNase Free水溶解核酸，即得到猪瘟兔化弱毒疫苗病毒RNA。

3.cDNA的制备

使用以下体系配制RNA反转录体系：

本体系全套采用宝生物工程(大连)有限公司产品，配制好以上体系后，于PCR仪内42℃反应 60min，完毕后置于-80℃超低温冰箱保存。

4.标准品质粒的构建

a.使用SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2引物扩增上述步骤得到的cDNA，所得产物经过凝胶电泳后纯化回收大小为197bp的目的片段，经宝生物工程(大连)有限公司测序，确认该片段为猪瘟兔化弱毒疫苗病毒基因目的片段。

b.使用宝生物工程（大连）有限公司的pMD19-T Vector载体试剂盒，按照其说明书操作，将上述胶回收纯化的DNA连接到pMD19-T质粒中，并转化到宝生物工程（大连）有限公司的大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

c.使用宝生物工程（大连）有限公司的pMD19-T Vector载体试剂盒，按照其说明经过纯化培养和蓝白斑筛选、PCR鉴定，确定了一株能稳定表达猪瘟兔化弱毒疫苗病毒基因目的片段的菌株，将该菌株进行增菌培养，并进行质粒纯化回收。

d.使用微量紫外分光光度计测定出质粒的浓度，并经过计算，确定其拷贝数。

e.将确定拷贝数的质粒浓溶液进行10倍体积的梯度稀释，从10^-1倍稀释至10^-12倍，依次命名为1号质粒标准品、2号质粒标准品、3号质粒标准品......12号质粒标准品。置于-20℃低温保存。

5.实时荧光定量RT-PCR检测标准曲线的建立

按以下体系（模板除外）进行预混，分装至荧光定量PCR专用反应管中，然后分别加入标准品质粒、阳性对照、阴性对照、空白对照，混匀后立即放入BIO-RAD公司的myiQ型荧光定量PCR仪内。

预先在荧光定量PCR仪设置好以下反应程序，并在每个循环的72℃结束时采集荧光，根据荧光强度变化由电脑自动制作标准曲线。

6.有效性验证和结果的判定

实验完毕后，若阳性对照的Ct值＜32，阴性对照的Ct值＞35，则实验成立。电脑绘制的标准曲线各点相关度大于95%，反应效率在80%～120%之间，则说明实验数据准确、有效。

本发明相对于传统方法检测相比具有以下优点：

1、特异性好：本发明所使用的引物是针对猪瘟病毒弱毒疫苗病毒毒株的特异性引物，具有高度特异性，能实时准确的测定出疫苗中病毒的含量。

2、灵敏度高：使用本发明所用的标准品质粒，经实验证明至少可检测出1.20×10⁴copy/ml的DNA含量。

3、重复性好：本发明所使用的检测模版是cDNA,性质稳定，结果准确，经过三次重复实验其误差低于2%。能够克服传统方法的缺点，并能快速对疫苗中病毒含量进行准确定量，淘汰不合格批次。

4、成本低：本实验所需的样品和所花费的试剂耗材极少，相较于传统方法大大节省了检测成本。

5、检测速度快，操作简便：不需后续处理，不用电泳、照胶、及显色处理，整个过程只需要3小时。

附图说明：

图1为本发明所使用的引物在猪瘟病毒弱毒疫苗毒株基因中的位置。

图2为本发明所使用的引物常规PCR扩增结果在电泳检测的图谱：其中1为SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2引物扩增产物，2 为SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4引物扩增产物，3为DL5000 Marker DNA对照。

图3为猪瘟病毒弱毒疫苗毒株实时荧光定量RT-PCR扩增图谱：1～5为标准品质粒曲线，其浓度分别为1.20×10¹⁰、1.20×10⁹、1.20×10⁸、1.20×10⁷、1.20×10⁶，6为阳性对照，7为阴性对照，8为猪瘟兔化弱毒疫苗毒株的cDNA。

图4为该疫苗及标准品质粒的对数关系图：1～5为标准品质粒，6为猪瘟兔化弱毒疫苗毒株的cDNA。

图5为标准品质粒敏感性实验的实时荧光定量RT-PCR扩增图谱：1号到7号曲线代表的质粒浓度依次是：1.20×10¹⁰copy/ml、1.20×10⁹copy/ml、1.20×10⁸copy/ml、1.20×10⁷copy/ml、1.20×10⁶copy/ml、1.20×10⁵copy/ml、1.20×10⁴copy/ml、8号为阴性对照。

图6为标准品质粒敏感性实验的对数关系图：1～７号为图5中所对应的各点。

图7为特异性检测的实时荧光定量RT-PCR扩增图谱：1号曲线为阳性对照、2号曲线为猪伪狂犬病活疫苗、3号曲线为猪蓝耳病弱毒疫苗、4号曲线为猪乙型脑炎活疫苗、5号曲线为仔猪副伤寒活疫苗。

具体实例方式：

下面结合附图和具体实例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

1.准备材料

1.1 主要实验仪器

伯乐公司myiQ荧光定量PCR仪、超低温冰箱、紫外分光光度计、高速冷冻离心机、超净操作台、电泳仪、紫外凝胶成像系统等。

1.2实验材料

猪瘟兔化弱毒疫苗毒株特异性引物SEQ ID NO.1 (CTCCCTGGGTGGTCTAAGTCC)、SEQ ID NO.2(AGCCTAATAGTGGGCCTCTGC)、SEQ ID NO.3（CAGGACAGTCGTCAGTAGTTCG）、SEQ ID NO.4（CTATCAGGTCGTACTCCCATCAC）、SEQ IDNO.5(CCCACCTCGAGATGCTACGTGGAC)均由宝生物工程（大连）有限公司合成；pMD19-T Vector载体试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、（大连）有限公司； Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)、M-MLV反转录酶等均购自宝生物工程。

猪瘟兔化弱毒疫苗、猪蓝耳弱毒疫苗、猪伪狂犬活疫苗、猪乙型脑炎活疫苗、仔猪副伤寒活疫苗，均购于云南省兽医防疫总站，所购疫苗均用4ml的RNase Free水稀释，然后分装于eppendorf管中，每管200μl，-80℃保存。

2.实验方法和结果

2.1标准品质粒的构建

提取猪瘟兔化弱毒疫苗中的RNA，反转录成cDNA，使用SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.2引物对cDNA进行PCR扩增，之后将产物进行凝胶电泳，并切胶做胶回收处理，将纯化回收的DNA，与载体质粒pMD19-T相连接，并转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，将转化成功的菌株进行纯化培养之后，使用细菌质粒小量提取试剂盒提取其中的质粒，并在微量紫外分光光度计进行浓度测定，确定其拷贝数浓度。将该质粒作10倍梯度稀释，作为标准品质粒，-20℃低温保存。

2.2 荧光定量PCR反应条件的优化

以猪瘟兔化弱毒疫苗的病毒cDNA为模板，对退火温度、引物浓度、进行优化，确定PCR反应的最佳条件。最终确定了一种25μl反应体系为最佳反应体系：模板DNA 2μl、 Premix Ex Taq™ (Probe qPCR) 12.5μl、上下游引物各0.5μl、荧光探针0.5μl、RNase Free水 9μl。最佳退火温度为53℃，反应程序为：95℃ 30秒，一个循环，95℃ 5秒、53℃ 15秒、72℃10秒，40个循环，并于每个循环的72℃结束时采集荧光信号，绘制出实时荧光定量扩增曲线图（图3）和疫苗与标准品质粒的对数关系图（图4）。

2.3荧光定量PCR反应的敏感性和特异性检测

利用步骤2.2中的最佳反应体系和反应程序，以七个稀释的标准品质粒为模板，浓度分别为1.20×10¹⁰copy/ml、1.20×10⁹copy/ml、1.20×10⁸copy/ml、1.20×10⁷copy/ml、1.20×10⁶copy/ml、1.20×10⁵copy/ml、1.20×10⁴copy/ml,并设置阴性对照，进行敏感性检测，结果如图5，结果表明，本实验至少可检测出浓度为1.20×10⁴copy/ml的未知样品。

分别提取猪伪狂犬活疫苗、仔猪副伤寒活疫苗的DNA,提取猪蓝耳病弱毒疫苗、猪乙型脑炎活疫苗的RNA，并将RNA反转录为cDNA作为模板，进行荧光定量PCR检测，其中1号曲线为阳性对照，其Ct值＜32，说明本次实验结果有效；2号～5号曲线的Ct值＞35，均为阴性，说明本实验方法结果可靠，对于猪伪狂犬病、猪蓝耳病、仔猪副伤寒、猪乙型脑炎具有良好的特异性，如图7。

序列表

<110> 云南农业大学

<120> 一种荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> hog cholera virus

<400> 1

ctccctgggt ggtctaagtc c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> hog cholera virus

<400> 2

agcctaatag tgggcctctg c 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> hog cholera virus

<400> 3

caggacagtc gtcagtagtt cg 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> hog cholera virus

<400> 4

ctatcaggtc gtactcccat cac 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> hog cholera virus

<400> 5

cccacctcga gatgctacgt ggac 24

Claims

1.一种荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法，包括用于实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟病弱毒疫苗病毒含量的特异性引物、标准质粒的制备及建立标准曲线、确定实验的成立标准、确定阳性或阴性的判定标准，其具体特征如下：

（1）引物特征：

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2能特异性扩增猪瘟兔化弱毒疫苗病毒的cDNA，扩增产物大小为197bp，用于构建标准浓度的质粒；

SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4能特异性扩增包含于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2扩增产物片段之内的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒cDNA，扩增产物大小为143bp，SEQ ID NO：5为Taqman荧光探针，在其5’端标记报告荧光基团FAM，3’标记猝灭荧光基团TAMRA，用于建立荧光定量PCR标准曲线及检测未知样品；

（2）标准曲线的建立方法：

提取猪瘟兔化弱毒疫苗的RNA，并反转录为cDNA，作为模板；以SEQID NO：1和SEQ ID NO：2为引物，进行PCR扩增；将扩增产物纯化回收，连接到pMD19-T载体上，转化到感受态细胞DH5α内，提取质粒DNA，获得猪瘟兔化弱毒疫苗检测用的标准浓度质粒；

将制备的标准质粒作10倍梯度稀释，以稀释液为模板，进行荧光定量PCR，采集荧光信号，使用Bio-Rad iQ5软件绘制出实时荧光定量标准曲线，并获得其产物Tm值；

（3）实验成立标准：

若阳性对照的Ct值＜32，阴性对照的Ct值＞35，电脑绘制的标准曲线各点相关度大于95%，反应效率在80%～120%之间，则说明实验数据准确、有效，实验成立；

（4）判定阳性或阴性的标准：

在实验成立的前提下，待测样品的Ct值＜35，判为阳性；待测样品的Ct值＞35则判为阴性。