CN103667531A - 一种猪流行性腹泻病毒的fq-pcr检测方法及其引物对 - Google Patents

Abstract

本发明公开了以猪流行性腹泻病毒(PEDV)的ORF3保守基因序列为参考，设计、优化出一对特异的PCR引物，建立一种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的SYBRGreenI实时荧光PCR方法。该方法检测灵敏度比RT-PCR高100倍，并且避免了常规PCR电泳检测所带来的高污染率。因此，该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点，该方法可用于猪场PEDV快速检测。

Description

一种猪流行性腹泻病毒的FQ-PCR检测方法及其引物对

技术领域

    本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的实时荧光定量PCR检测方法及其引物对。

背景技术

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的猪的一种急性、高度传播性的肠道疾病。PEDV病毒为不分节段的线性单股正链RNA，目前仅见有１个血清型，PEDV基因组靠近3′端5kb区域内有5个主要的开发阅读框，编码有典型的冠状病毒结构蛋白N蛋白、M蛋白、sM蛋白和S蛋白，其中ORF3位于sM蛋白和S蛋白之间编码功能未知的多肽性片段。

从2010年10月起至今，PED在我国许多省份的猪场中流行，新生仔猪出生后2~3天发病，表现为水样腹泻、脱水和部分仔猪呕吐，发病率可达60%~100%，死亡率高达100%，给我国的养猪业造成了很大经济损失。因此建立一种准确、简便的PEDV病原检测方法对促进我国的养猪业健康发展具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于通过大量试验研究并探索，提供一种猪流行性腹泻病毒的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测方法及其引物对。本发明应用实时荧光定量PCR技术对PEDV病原进行快速定量检测，不但灵敏度比普通PCR高，而且还避免了普通PCR的高污染率的缺点。

本发明的目的是这样实现的：

一种用于猪流行性腹泻病毒FQ-PCR检测的引物对，其序列为：

上游引物：5′-CGCAATTATATTATGTTGG-3′，该序列如序列表中的SEQ ID NO: 1所示；

下游引物：5′-AGAAAGTGTCGTAGTATT-3′，该序列如序列表中的SEQ ID NO: 2所示。

一种猪流行性腹泻病毒的FQ-PCR检测方法,其特征在于该方法包括如下步骤：

（1）筛选出猪流行性腹泻病毒基因组靠近3′端5kb区域，并根据其序列设计扩增引物对如下：

上游引物：5′-CGCAATTATATTATGTTGG-3′，该序列如序列表中的SEQ ID NO: 1所示；

下游引物：5′-AGAAAGTGTCGTAGTATT-3′，该序列如序列表中的SEQ ID NO: 2所示；

（2）对样品进行FQ-PCR检测，FQ-PCR反应体系如下：待测样品的模版2μL，2×All-in-One Qpcr Mix 10μL，1μM上游引物和1μM下游引物各2μL，50× Rox Reference Dye 0.4μL，灭菌双蒸水加至20μL；反应条件为：95℃ 2min；95℃ 10s，60℃ 20s，45个循环；反应结束后检测荧光；

（3）通过FQ-PCR仪自带软件自动分析读取FQ-PCR检测结果，按如下标准判断样品是否含猪流行性腹泻病毒：若出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含猪流行性腹泻病毒；若未出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中不含猪流行性腹泻病毒。

本发明在比较PEDV有关序列的基础上设计了一对引物，采用SYBR Green I荧光染料法，经过引物筛选和反应条件的优化，建立了PEDV的快速定量检测方法,该方法检测灵敏度为10²拷贝/μL,定量线性范围为1.0×10²-1.0×10⁷拷贝/μL,具有很好的重复性。试验结果显示该方法检测灵敏度比常规PCR高100倍。在临床样品的检测中,对疫苗毒株、仔猪小肠样品的检测结果显示该方法具有很好适应性。总之,本发明的猪流行性腹泻病毒快速实时荧光定量PCR检测方法具有特异性强、重复性好、操作简单快速、成本低等特点,整个过程可在4h内完成，该方法为目前较为理想的PEDV检测方法。

附图说明

图1为质粒PCR扩增结果的电泳图，其中1：PCR产物；M：DL 2000marker。

图2为PEDV荧光定量PCR反应的动力学曲线图，曲线按照荧光上升的顺序排列，从左到右依次为：1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹拷贝/μL。

图3为PEDV荧光定量PCR反应的标准曲线图。

图4为实时荧光定量PCR特异性检测结果图，其中1：PEDV阳性样品；2：猪瘟病毒；3:猪蓝耳病毒；4：猪乙型脑炎病毒；5：猪圆环病毒；6：牛病毒性腹泻病毒。

图5为荧光定量PCR检测方法的重复性检测结果图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

1.      材料与方法

1.1   毒株、细胞和样品

猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病毒（PRRSV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪圆环病毒（PCV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞）、DH5α感受态细胞为本实验室保存，仔猪腹泻样品采集于湖北省武汉市地区。

1.2  试剂

   DMEM培养液、新生牛血清为GIBCO公司产品；RNA提取试剂盒和质粒小提试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；Qpcr Mix为GeneCopoeia公司产品；pGEM-T Easy质粒载体为Promega公司产品；T4 DNA连接酶为Promega公司产品；EX Taq DNA聚合酶为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.3  阳性模板DNA的制备

1.3.1  引物

以PEDV的ORF3高度保守的5^，端非编码区作为扩增靶区，设计并合成了一对引物，具体序列如下：

上游引物（F）：5′-CGCAATTATATTATGTTGG-3′

下游引物（R）：5′-AGAAAGTGTCGTAGTATT-3′

1.3.2  病毒培养

Vero细胞经含10%小牛血清和双抗(青霉素100μg/mL、链霉素100μg/mL)的DMEM培养液培养，待细胞长成70%单层时，接种病毒液，37℃吸附1h，其间不时摇动使液面均匀地铺在细胞上，然后加含2%小牛血清和双抗的DMEM维持液，37℃继续培养，在细胞病变达80%以上时收获。

1.3.3  常规PCR

通过对PCR反应条件与试剂的优化，确定如下反应方案：反应总体积为20μL，其中10×buffer 2μL，10mmol/L dNTPs 2μL，引物F1、F2各0.5μL (10μmol/L)，cDNA 模板 2μL，Taq DNA聚合酶 0.5μL，加灭菌双蒸水至20μL。PCR反应条件为：94℃预变性，5min，94℃变性1min、45℃退火30s，扩增35个循环；最后72℃延伸10 min。

1.3.4  标准阳性模板的构建

用上述引物进行常规PCR反应扩增PEDV阳性模板cDNA，PCR产物回收纯化后克隆到pGEM-T Easy载体中，构建重组质粒，将重组质粒转化入DH5α感受态细胞内，进行白斑筛选，保存菌液，将菌液送上海生物工程有限公司进行测序。将测序结果与报道序列进行比对，从测序正确的菌液中大量提取质粒，质粒浓度用紫外分光光度计测定OD₂₆₀值，根据阿弗加德罗常数将浓度转换为拷贝数,-20℃保存，用前稀释。 

1.4  荧光定量PCR(FQ-PCR)

FQ-PCR 反应总体积20μL，反应体系为：10倍系列稀释的标准品或待测样品的模版 2μL，2× All-in-One Qpcr Mix（Hot-start DNA聚合酶、Buffer、dNTP和SYBR Green） 10μL，F1、F2各2μL（1μmol/L），50× Rox Reference Dye（50×solution dissolved in 10 mM Tris buffer pH 8.5 with 0.005 % Tween 20） 0.4μL，灭菌双蒸水加至20μL体系。反应条件为：95℃ 2min；95℃ 10s，60℃ 20s，45个循环后检测荧光。

1.5  PEDV荧光定量PCR反应标准曲线的建立

分别以经梯度浓度稀释的质粒为模板进行荧光定量PCR扩增，并利用随机软件进行分析，得到动力学曲线及标准曲线。

1.6  PEDV荧光定量PCR检测方法的评价

1.6.1  敏感性

标准阳性模板经10¹-10⁸倍梯度稀释，进行荧光定量PCR检测，并与普通PCR比较。

1.6.2  特异性 

对PEDV标准阳性模板、CSFV、PRRSV、JEV、PCV、BVDV进行荧光定量PCR检测。试验结果经溶解曲线分析，验证其特异性。

1.6.3  重复性 

取4份不同滴度水平的PEDV样品进行组间重复性荧光定量PCR检测，反应重复2次，验证PEDV荧光定量PCR方法的稳定性。

1.7  临床样本检测

取湖北武汉、黄冈等地猪场疑似PEDV的病料，进行常规PCR、FQ-PCR检测，以比较常规PCR和荧光定量PCR这两种方法的灵敏度。

2        结果与分析

2.1  BVDV特异性片段的扩增结果

经2%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物大小约为191bp,与预期结果相符(图1)。菌液送上海生物工程有限公司测序结果正确。

2.2 标准曲线及FQ-PCR灵敏度

以10倍系列稀释的标准品(10¹ -10⁷copies/μL)为定量检测模板，在RotorGene 定量仪上检测，得到动力学曲线图2和标准曲线图3。

在标准曲线的制作过程中,模板的起始数越低则Ct值越大（Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数）。一般认为当Ct值在35以上时,定量结果即被认为是不准确的。图2显示,当标准质粒浓度≥10²拷贝/μL时,动力学曲线呈上升趋势,因此,该方法检测灵敏度为10²拷贝/μL (该检测灵敏度为被检样品的质粒模板浓度,如换算为被检样品浓度应该是2.46×10⁶拷贝/mL,为了统一起见,以下检测结果均为质粒浓度).图3显示该方法定量检测的线性范围为1.0×10²-1.0×10⁷拷贝/μL,相关系数R=0.997。

2.3  特异性

如图4显示，对标准阳性模板有荧光显示；猪瘟疫苗毒株、对未接病毒的MDBK细胞、双蒸水无明显荧光反应，表明实时荧光定量PCR检测方法具有良好特异性。

2.4  重复性

图5显示扩增结果曲线形态基本吻合,证明该检测体系具有很好的重复性。

2.5  实时荧光定量PCR与常规PCR比较

把标准阳性模板分别作10倍梯度稀释，并进行实时荧光定量PCR和常规PCR检查，得到表1结果显示：实时荧光定量PCR的检查灵敏度高出常规PCR 100倍。

表1实时荧光定量PCR与常规PCR检测结果

样品稀释度	常规PCR	实时荧光定量PCR
			0	+	17.28
10-1	+	20.86
			10-2	+	23.79
10-3	+	26.58
			10-4	—	30.14
10-5	—	32.15
			10-6	—	—
10-7	—	—
			10-8	—	—

表1中：“+”表示检查结果为阳性；“—”表示检测结果为阴性；

2.6   临床样品的检测

对2013年采自湖北武汉、沙洋、通城等地猪场小肠样品，进行常规PCR、实时荧光定量PCR检测。结果显示在检测的32份样品中，实时荧光定量PCR检测阳性21份，阳性检出率为83.2％(26/32)；常规PCR检测阳性21份，阳性检出率为67.2％（21/32），说明实时荧光定量PCR比常规PCR灵敏度高。

3. 讨论

本发明在比较PEDV有关序列的基础上设计了2对引物。采用SYBR Green I荧光染料法，经过引物筛选和反应条件的优化，建立了PEDV的快速定量检测方法,该方法检测灵敏度为10²拷贝/μL,定量线性范围为1.0×10²-1.0×10⁷拷贝/μL,具有很好的重复性。试验结果显示该方法检测灵敏度比常规PCR高100倍。在临床样品的检测中,对疫苗毒株、仔猪小肠样品的检测结果显示该方法具有很好适应性。

总之, 猪流行性腹泻病毒快速实时荧光定量PCR检测方法具有特异性强、重复性好、操作简单快速、成本低等特点,整个过程可在4h内完成，该方法为目前较为理想的PEDV检测方法。

序列表

SEQUENCE LISTING

 

<110>  湖北省农业科学研究院畜牧兽医研究所

<120>  一种猪流行性腹泻病毒的FQ-PCR检测方法及其引物对

<160>  2   

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

cgcaattata ttatgttgg                                                     19

      

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

agaaagtgtc gtagtatt                                                      18

Claims (2)

1.一种用于猪流行性腹泻病毒FQ-PCR检测的引物对，其序列为：

上游引物：5′-CGCAATTATATTATGTTGG-3′，该序列如序列表中的SEQ ID NO: 1所示；

下游引物：5′-AGAAAGTGTCGTAGTATT-3′，该序列如序列表中的SEQ ID NO: 2所示。

2.一种猪流行性腹泻病毒的FQ-PCR检测方法,其特征在于该方法包括如下步骤：

（1）筛选出猪流行性腹泻病毒基因组靠近3′端5kb区域，并根据其序列设计扩增引物对如下：

上游引物：5′-CGCAATTATATTATGTTGG-3′，该序列如序列表中的SEQ ID NO: 1所示；

下游引物：5′-AGAAAGTGTCGTAGTATT-3′，该序列如序列表中的SEQ ID NO: 2所示；

（2）对样品进行FQ-PCR检测，FQ-PCR反应体系如下：待测样品的模版2μL，2×All-in-One Qpcr Mix 10μL，1μM上游引物和1μM下游引物各2μL，50× Rox Reference Dye 0.4μL，灭菌双蒸水加至20μL；反应条件为：95℃ 2min；95℃ 10s，60℃ 20s，45个循环；反应结束后检测荧光；

（3）通过FQ-PCR仪自带软件自动分析读取FQ-PCR检测结果，按如下标准判断样品是否含猪流行性腹泻病毒：若出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含猪流行性腹泻病毒；若未出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中不含猪流行性腹泻病毒。

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