CN103969450A - 检测猪流行性腹泻病毒抗体的elisa试剂盒 - Google Patents

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倪艳秀
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俞正玉
张雪寒
茅爱华
吕立新
胡屹屹
周俊明
王小敏
祝昊丹
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Abstract

本发明提供了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA试剂盒，属于生物技术领域。该试剂盒是以纯化的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白作为包被抗原的ELISA板条。RT-PCR方法扩增获得猪流行性腹泻病毒N基因，定向插入pET-28a载体构建pET-28a-N重组质粒，转化BL21（DE3）感受态细胞，获得原核表达菌pET-28a-N/BL21。经IPTG诱导表达、纯化，获得重组N蛋白。本发明试剂盒用于检测猪流行性腹泻病毒的抗体，经检验，该试剂盒特异性、敏感性、重复性均良好。该试剂盒检测准确、操作简便，适合于在临床应用中进行推广，为猪流行性腹泻病的快速检测提供了可靠手段。

Description

检测猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA试剂盒
技术领域
本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA试剂盒及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）引起的一种急性、高度接触性的传染病，常以急性肠炎和伴有脱水的水样腹泻为特征，各种年龄的猪均易感和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。2010年冬季至2011年春季全国各地猪场的猪群中先后发生严重的传染性腹泻疾病，发病突然，传播较快，流行范围广，流行时间长，应用各种抗生素防治无效，其发病率与死亡率很高，造成重大的经济损失。经研究表明，猪流行性腹泻病毒是此次疫情的元凶。此后该病在我国猪群中广泛流行。
目前对于PEDV的诊断主要是依靠RT-PCR方法，该方法对实验设备和条件要求较高，不适合临床上的大规模快速诊断。应用各种免疫血清学技术对疫病做出准确、迅速的诊断是预防和控制该病的重要措施之一。ELISA法具有简便、快速、特异性强等优点，而且ELISA检测抗体能够评价疫苗的免疫效果，但需要抗原纯度较高且免疫原性良好。PEDV N蛋白是由441个氨基酸组成、分子质量为55～58 ku、磷酸化的核衣壳蛋白，与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA合成过程中发挥着重要的作用，它能与细胞膜和磷脂结合，促进病毒的组装和RNA复制体的形成。并且N蛋白在PEDV的结构蛋白中所占的比例最大，在感染的细胞中能得到大量表达。猪在感染PEDV的早期体内就能产生抗N蛋白的高水平抗体。冠状病毒N 蛋白又十分保守, 所以利用N蛋白来建立PEDV分子生物学诊断技术具有很好的应用前景。
发明内容
技术问题
本发明基于上述猪流行性腹泻病毒的特点与研究结果，提供了一种检测PEDV抗体的ELISA试剂盒及其应用。该试剂盒成本低廉、操作简便，为PEDV的检测提供了一种快捷易用的血清学诊断方法，市场前景良好。
技术方案
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种猪流行性腹泻病毒PEDV重组N蛋白，其制备方法包括以下步骤：
（1）以猪流行性腹泻病毒RNA作为材料，通过RT-PCR方法扩增获得其N基因(登录号KC210145)，扩增片段大小为1326 bp，并以pET-28a质粒作为载体构建重组质粒pET-28a-N。N基因与pET-28a载体分别用BamH I与Sal I双酶切后，连接构建重组质粒pET-28a-N，双酶切鉴定重组质粒。
（2）将阳性重组表达质粒pET-28a-N转化BL21（DE3）感受态细胞，获得阳性质粒菌单克隆pET-28a-N/BL21。该单克隆于37℃培养，待A600值达到0.4~0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后5h的菌体，进行SDS-PAGE鉴定。取诱导表达后5h的菌体，超声破碎，离心后分别取上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定。根据电泳结果，取上清表达液进行Western blot鉴定。大量诱导表达N蛋白，超声破碎，取上清表达液，使用Ni-TED柱进行纯化，收集上清滤过液、LEW洗涤Ni-TED柱所得洗涤液、1xElution Buffer洗脱所得纯化蛋白。
所述PEDV重组N蛋白用于制备检测猪流行性腹泻病抗体的ELISA试剂盒，包括以下组分：
（1）ELISA板条：以所述猪流行性腹泻病毒PEDV重组N蛋白作为包被抗原，ELISA板条经5%（M/V）脱脂乳封闭，以包装袋密封包装于4℃保存。
（2）洗涤液：含0.05%吐温-20的pH7.4 磷酸盐缓冲液（PBS-T）；
（3）血清稀释液：5%（M/V）脱脂乳；
（4）底物显色液：已加入H2O2的TMB溶液；
（5）羊抗猪酶标二抗：已用血清稀释液稀释至工作浓度1:10000的羊抗猪酶标二抗；
（6）终止液：2M H2SO4溶液；
（7）PEDV阳性血清
（8）PEDV阴性血清
所述ELISA试剂盒在检测猪流行性腹泻病时，主要操作步骤如下：
（1）加入血清样品：
用血清稀释液5%（M/V）脱脂乳将待检血清做1:50稀释后，每孔加入100μL，每一血清样品添加两孔，同时设立PEDV阴、阳性血清作为对照，各添加两孔；室温下作用60分钟，弃去反应孔中的液体：每个孔用200μL洗涤液充分清洗3次，每次5分钟，每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，充分除去残留的液体；
（2）加入羊抗猪酶标二抗：
每孔加入100μL羊抗猪酶标二抗，室温作用30分钟，如步骤（1）中方法洗涤；
（3）加入底物显色液：
每孔加入100μL已加入H2O2的TMB溶液，室温下避光作用15分钟；
（4）终止反应：
每孔加入100μL 2M H2SO4终止液，终止显色反应；
（5）用酶标仪测定OD值：
使用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光光度（OD）值；
（6）结果判定：
计算各份血清OD450与标准阳性血清OD450的比值S/P，当样品S/P值≥ 0.26时为阳性，＜ 0.26时为阴性。
有益效果
本发明ELISA试剂盒，使用猪流行性腹泻病病毒（PEDV）重组N蛋白作为包被抗原，该蛋白为PEDV N基因重组pET-28a-N表达载体的原核表达产物，易于制备与纯化，免疫反应性良好。该蛋白纯化后作为包被抗原，其浓度易于确定与控制，有利于该试剂盒的大量生产与成本控制。
本发明试剂盒用于检测猪流行性腹泻病毒的抗体，经检验，该试剂盒特异性、敏感性、重复性均良好。该试剂盒检测准确、操作简便，适合于在临床应用中进行推广，为猪流行性腹泻病的快速检测提供了可靠手段。
附图说明
图1 pET-28a-N/BL21表达菌阳性单克隆鉴定。M：DS 10000 Marker；1：阴性pET-28a-N/BL21菌单克隆；2：阳性pET-28a-N/BL21菌单克隆；3：阳性pET-28a-N/BL21菌单克隆。
图2 PEDV N蛋白的诱导表达。M：Prestained Peotein Ruler；P：诱导后pET-28a空载体菌；
0：未诱导pET-28a-N/BL21菌；1：诱导后1h pET-28a-N/BL21菌液样品；2：诱导后2h pET-28a-N/BL21菌液样品；3：诱导后3h pET-28a-N/BL21菌液样品；4：诱导后4h pET-28a-N/BL21菌液样品；5：诱导后5h pET-28a-N/BL21菌液样品；6：诱导后6h pET-28a-N/BL21菌液样。
图3 Western Blot鉴定。M：BlueRay Prestained Peotein ladder；1：诱导后5h pET-28a-N/BL21菌液样品。
图4 N蛋白可溶性表达鉴定。M：BlueRay Prestained Peotein ladder；1：超声破碎后包涵体样品；2：超声破碎后上清液样品。
图5 N蛋白的纯化。M：BlueRay Prestained Peotein ladder；0：未诱导pET-28a-N/BL21菌
+：诱导后未纯化pET-28a-N/BL21全菌；A：蛋白纯化A液；B：蛋白纯化B液；1：第1mL洗脱液；2：第2mL洗脱液；3：第3mL洗脱液；4：第4mL洗脱液；5：第5mL洗脱液
通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例尽是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
具体实施方式
1.PEDV N蛋白表达载体的构建
提取猪流行性腹泻病毒感染病猪(江苏省洪泽鑫象猪场)肠道病料RNA，扩增获得其N基因（登录号KC210145）。N基因连接pMD18-T载体（TaKaRa），16℃连接过夜。连接产物转化Trans5α感受态细胞（TaKaRa），并涂布至氨苄青霉素抗性（100mg/ml）的LB平板，37℃培养过夜。挑取单克隆，于氨苄青霉素抗性的LB培养基中振荡培养10h后，提取质粒，酶切鉴定。将初步鉴定为阳性的菌液进行测序。选取测序正确的pMD18-T-N质粒，与pET-28a空质粒（Novagen），分别使用BamH I与Sal I双酶切。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，分别切取N基因目的条带与pET-28a载体条带，切胶回收。回收产物16℃连接过夜。连接产物转化Trans5a感受态细胞，常规化选取阳性克隆，提取菌体质粒酶切鉴定。获得pET-28a-N重组质粒。
2.重组表达质粒的诱导表达
重组pET-28a-N质粒转化BL21(DE3)感受态细胞（TaKaRa），常规化选取阳性克隆，提取菌体质粒酶切鉴定，命名为pET-28a-N/BL21。pET-28a-N/BL21表达菌活化培养，至A600 = 0.6，取1ml菌液保存，加入0.1%IPTG进行诱导。诱导后每隔1h取1ml菌液，至诱导后6h。将收集到的菌液4℃、12000 r/min离心5 min收集沉淀。每管沉淀用40微升的PBS悬起后加入10微升SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10 min，用SDS-PAGE电泳分析。电泳结果参照分子质量标准，可见诱导表达获得蛋白大小约为65 kDa，与预测的N蛋白加his-tag（gehealthcare）大小一致，证明该重组质粒在大肠杆菌中得到了表达。
取1ml诱导5h的菌液，8000rpm离心2min，用300μL PBS重悬菌体。冻融3次，超声破碎，离心分离上清液与包涵体。用300μl PBS重悬包涵体沉淀。各取40μL上清液与包涵体重悬液，加入10微升SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10 min，进行SDS-PAGE电泳。电泳结果可见N蛋白在上清液中表达。
3.重组PEDV N蛋白Western Blot实验
取诱导后5h菌液进行SDS-PAGE电泳。将电泳好的SDS-PAGE凝胶，不经染色，直接用转印装置将蛋白以20V电转印到硝酸纤维素滤膜（NC膜）上，转印1.5h。取出NC膜，在TBST中漂洗一下，加入封闭液（含2% 脱脂奶粉的TBST），平放于摇床上缓缓摇动1 h。把NC膜放入用封闭液稀释的一抗(PEDV抗体阳性血清)中，平放于摇床上室温作用1 h。温育好之后取出NC膜，用TBST洗5遍，每次5 min。把NC膜放入用封闭液稀释的二抗（1:5000稀释酶标抗猪IgG二抗），平放于摇床上室温作用0.5 h。温育好之后取出NC膜，用TBST洗5遍，每次5 min。把NC膜放入10 mL底物液中，避光显色1 min~15 min，一旦出现条带，立即取出浸入ddH2O中漂洗以终止反应并拍照。
4.重组蛋白的纯化
pET-28a-N/BL21表达菌加入5ml LB培养基，活化培养过夜。取2ml菌液加入200ml LB培养基中，培养至A600=0.6，加入0.1%IPTG后，诱导培养5h。收集菌液8000rpm离心10min，弃上清，菌体称重。每克沉淀加10ml LEW溶液重悬，再次8000rpm离心10min，弃上清。
每克沉淀加5ml LEW溶液重悬，超声破碎。10000rpm离心10min，收集上清液，使用0,45μm滤器过滤后，加入到Protino Ni-TED柱进行纯化，收集1ml滤过液。使用8ml LEW洗涤Ni-TED柱，收集1ml洗涤液。用9ml Elution buffer洗脱，每次1ml，洗9次，收集各洗脱液。SDS-PAGE检验，可见纯化效果良好，该N蛋白易于制备与纯化。
5.样品稀释液、洗涤液、终止液的配制
洗涤液为含0.05%吐温-20的0.01M pH7.4 磷酸盐缓冲液：KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8g，定容至1000mL，加入0.5mL吐温-20；样品稀释液为含1%（M/V）BSA的洗涤液：1g BSA加入100mL 洗涤液中；终止液为2M硫酸溶液：111.2mL 浓硫酸，稀释定容至1000mL。
6.抗原最适包被浓度和血清最适稀释度的确定
采用方正滴定法确定抗原最适包被浓度和血清最适稀释度。
将纯化的重组蛋白用包被液依次做1:25、1:50、1:100、1:200、1:400稀释，以100 μL/孔的量滴加到96孔聚苯乙烯微量反应板中，组成方阵，4℃包被过夜；弃去抗原液，用洗涤液充分洗涤三次，200 μl/孔，5 min/次，使用5%的脱脂乳封闭，200 μL/孔，4℃过夜；弃去封闭液，用上述的操作方法洗涤，将PEDV阳、阴性血清依次做 l:25、l:50、l:100、l:200稀释后，以每孔100 μL的量分别加入到聚苯乙烯微量反应板中，在37℃的条件下作用45 min；弃去血清，用上述的操作方法洗涤，加入1:10000稀释的酶标二抗，100 μl/孔，在37℃的条件下作用30 min；弃去酶标二抗，用上述操作方法洗涤，尽量弃去孔内液体，加入底物显色液100μL/孔，37℃避光显色8 min，最后加入终止液终止反应；用酶标仪在450 nm波长下测定OD值。比较阴阳性血清的0D450值，即选择阳性与阴性OD比值最大时的包被抗原的最大稀释度为抗原包被最佳浓度，对应的阴阳性血清的稀释度为最佳血清稀释度，一般阳性OD450值为1.0左右且阴性OD450值较低。
方正滴定结果显示，当重组N蛋白稀释1:200(0.8μg/mL)包被酶标板，血清稀释1:50时，阳性血清OD值接近1，阴性血清OD值小于0.2，且P/N值为9.09较大。因此确定重组N蛋白的包被最佳浓度为0.8μg/mL，血清最佳稀释度为1:50。
表1 ELISA方正滴定结果
7.包被条件的选择
最佳抗原浓度包被酶标板，分别在4℃反应过夜、37℃反应1h加4℃反应过夜、37℃反应2h，进行包被。用已知的阴、阳性血清进行ELISA检测，测定OD450并分析P/N变化情况，评价其包被效果。最终确定最佳包被条件为4℃反应过夜。
8.封闭液的选择
最佳抗原浓度包被酶标板，包被结束后洗涤，分别用2%脱脂奶粉、5%脱脂奶粉、0.5%BSA、1%BSA、1.5%BSA作为封闭液，封闭1h。在其他条件相同的情况下，用已知的阴、阳性血清进行ELISA检测，测定OD450并分析P/N变化情况，评价其封闭效果。最终确定最佳封闭液为5%脱脂乳。
9.封闭条件的确定
在其他条件固定的情况下，用选定的封闭液分别在37℃封闭30、60、90min，用已知的阴、阳性血清进行ELISA检测，测定OD450并分析P/N变化情况，评价其封闭效果。最终确定最佳封闭条件为37℃反应90min。
10.最适抗原抗体反应时间的确定
最佳封闭液封闭，加入最佳稀释度的血清后，37℃分别孵育30、45、60、75min。在其他条件不变的情况下进行ELISA检测，测定OD450值并分析P/N变化情况，评价其效果。最终确定最适抗原抗体反应时间为60min。
11.最适二抗工作浓度的确定
将酶标二抗稀释成1：5 000、1：7 500、1：10 000、1：15 000、1:20000后，在其他条件不变的情况下进行ELISA检测，根据OD450值和P/N值变化情况，评价其效果。最终确定最适二抗工作浓度为1:10000。
12.最适显色时间的确定
加入TMB后于室温分别作用3、4、5、6、8、10、12、15min，在其他条件为上述所优化的最佳条件，根据OD450值和P/N值变化情况，确定最佳显色时间。结果可见最佳显色时间为15min。
表2 最适显色时间的确定
显色时间 3min 4min 5min 6min 8min 10min 12min 15min
P 0.600 0.648 0.738 0.789 1.007 1.200 1.403 1.613
N 0.078 0.079 0.089 0.097 0.112 0.150 0.153 0.157
空白 0.064 0.063 0.064 0.064 0.069 0.070 0.081 0.0815
P/N 7.69 8.2 8.29 8.13 8.99 8 9.17 10.27
13.阴阳性临界值的确定
取经中和试验和间接免疫荧光检测猪流行性腹泻病毒抗体为阴性的28份猪血清，按以确定的条件进行间接ELISA，用酶标仪仪在450nm波长下测定OD值，计算OD450的平均值X及标准方差SD，阴阳性临界值= X十3SD。
为消除每次间接ELISA检测时，实验环境及操作的影响，每次检测时加入标准阳性血清，通过计算各份血清OD450与标准阳性血清OD450的比值S/P，来进行阴阳性判断。取142份来自江苏省多地未发病未免疫猪场的仔猪血清，经中和试验和间接免疫荧光检测为猪流行性腹泻病毒抗体阴性，按已确定的条件进行间接ELISA，用酶标仪仪在450nm波长下测定OD值，计算各份血清OD450与标准阳性血清OD450的比值S/P，计算S/P值的平均值X及标准方差SD，阴阳性临界值= X十3SD。
经计算，142份血清的S/P平均值X=0.137，SD=0.041，因此ELISA阴阳性临界值=0.137+3*0.041=026。因此，当样品S/P值≥ 0.26时为阳性，＜ 0.26时为阴性。
14.ELISA操作程序的确定
按以上各项所确定的最佳操作条件，确定ELISA操作程序为：取出已包被并封闭好的ELISA板条，用血清稀释液将待检血清做1:100稀释，加入酶标板各孔，每孔100μL，每份待检血清与PED阴性、阳性血清各加2孔，37℃反应60分钟；弃去孔内液体，每孔用200μL洗涤液洗涤3次，每次5分钟，最后一次洗涤完后，在吸水纸上拍打，弃尽孔内液体；每孔加入100μL酶标二抗，37℃反应30分钟；弃去孔内液体，每孔用200μL洗涤液洗涤3次，每次5分钟，最后一次洗涤完后，在吸水纸上拍打，弃尽孔内液体；每孔加入100μL TMB底物反应液后，室温避光显色15分钟后，加入100μL终止液；用酶标仪在450nm波长读取各孔OD值，计算平均值、S/P值并判定结果。
实施例：
实施例1：特异性实验
按已建立的间接ELISA方法操作，分别检测已知的PEDV、CSFV、PRRSV、PRV、TGEV、FMDV、PCV2阳性血清（IDEXX试剂盒提供），每份血清做3个平行重复。用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值，确定该间接ELISA方法的特异性。
结果表明，只有PEDV阳性血清的S/P值平均为1.267＞0.26，其他各份血清S/P值均在0.051-0.187之间，远小于0.26。说明该间接ELISA方法检测结果特异性良好。
实施例2：重复性实验
1.批内重复实验：
使用同批诱导纯化制备的PEDV N蛋白，按最佳抗原包被浓度包被酶标板，用已建立的ELISA操作方法，在不同时间分别检测8份随机选择的PED抗体水平不同的血清与标准血清，用酶标仪仪在450nm波长下测定OD值。计算各份血清S/P值，以及S/P值的平均值X，标准差SD，变异系数CV。
结果可见8份血清S/P值的变异系数在1.00%-8.00%之间，同批蛋白抗原在不同时间操作检测结果重复性良好。
表3 批内重复性实验结果
2.批间重复实验：
使用不同批次诱导纯化制备的PEDV N蛋白，按最佳抗原包被浓度包被酶标板，用已建立的ELISA操作方法，同时检测8份随机选择的PED抗体水平不同的血清，用酶标仪仪在450nm波长下测定OD值。计算各份血清S/P值，以及S/P值的平均值X，标准差SD，变异系数CV。
结果可见8份血清OD450的变异系数在1.25-5.55%之间，不同批次抗原检测结果重复性良好。
表4 批间重复性实验结果

Claims (3)

1. 猪流行性腹泻病毒PEDV重组N蛋白，其制备方法包括以下步骤：
（1）以猪流行性腹泻病毒PEDV的RNA作为材料，通过RT-PCR方法扩增获得其N基因，基因登录号KC210145，扩增片段大小为1326bp，并以pET-28a质粒作为载体构建重组质粒pET-28a-N，N基因与pET-28a载体分别用BamH I与Sal I双酶切后，连接构建重组质粒pET-28a-N，双酶切鉴定重组质粒；
将阳性重组表达质粒pET-28a-N转化BL21（DE3）感受态细胞，获得阳性质粒菌单克隆pET-28a-N/BL21；该单克隆于37℃培养，待A600值达到0.4~0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后5h的菌体，进行SDS-PAGE鉴定，取诱导表达后5h的菌体，超声破碎，离心后分别取上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定，根据电泳结果，取上清表达液进行Western blot鉴定，大量诱导表达N蛋白，超声破碎，取上清表达液，使用Ni-TED柱进行纯化，收集上清滤过液、LEW洗涤Ni-TED柱所得洗涤液、1xElution Buffer洗脱所得纯化蛋白。
2.用权利要求1所述PEDV重组N蛋白制备的猪流行性腹泻病毒抗体检测ELISA试剂盒，包括以下组分：
（1）ELISA板条：以权利要求1所述PEDV重组N蛋白作为包被抗原，ELISA板条经5%（M/V）脱脂乳封闭，以包装袋密封包装于4℃保存；
（2）洗涤液：含0.05%吐温-20的pH7.4 磷酸盐缓冲液PBS-T；
（3）血清稀释液：5%（M/V）脱脂乳；
（4）底物显色液：已加入H2O2的TMB溶液；
（5）羊抗猪酶标二抗：已用血清稀释液稀释至工作浓度1:10000的羊抗猪酶标二抗；
（6）终止液：2M H2SO4溶液；
（7）PEDV阳性血清；
（8）PEDV阴性血清。
3.根据权利要求2所述ELISA试剂盒，其在检测猪流行性腹泻病毒抗体时，主要操作步骤如下：
（1）加入血清样品：
用血清稀释液5%（M/V）脱脂乳将待检血清做1:50稀释后，每孔加入100μL，每一血清样品添加两孔，同时设立PED阴、阳性血清作为对照，各添加两孔；室温下作用60分钟，弃去反应孔中的液体：每个孔用200μL洗涤液充分清洗3次，每次5分钟，每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，充分除去残留的液体；
加入羊抗猪酶标二抗：
每孔加入100μL羊抗猪酶标二抗，室温作用30分钟，如步骤（1）中方法洗涤；
加入底物显色液：
每孔加入100μL已加入H2O2的TMB溶液，室温下避光作用15分钟；
终止反应：
每孔加入100μL 2M H2SO4终止液，终止显色反应；
用酶标仪测定OD值：
使用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光光度（OD）值；
结果判定：
间接ELISA检测时加入标准阳性血清，用酶标仪在450nm波长下测定OD值，计算各份血清OD450与标准阳性血清OD450的比值S/P，当样品S/P值≥ 0.26时为阳性，＜0.26时为阴性。
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