CN104330559A - 检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性抗体IgG的方法。方法步骤为：1）猪流行性腹泻病毒抗原的制备和96孔聚苯乙烯反应板包被；2）采集待测猪只的血液，处理后获得血清一抗；3）将血清一抗稀释后，按编号加入抗原包被的反应板上，37℃饱和湿度反应1小时，洗涤；4）将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体稀释后，按顺序加入到反应板上，37℃饱和湿度避光反应2小时，洗涤；5）将TMB显色剂，按顺序加入到反应板上，避光反应25分钟，加入终止液；6）放入酶标仪中，读取OD650数据，判定结果。本发明适用于猪群大面积的猪流行性腹泻IgG抗体调查。

Description

检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法背景技术。
背景技术
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)引起的猪的一种急性肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征。其病理特征表现为肠管扩张，内容物稀薄，呈黄色、泡沫状，肠壁弛缓，缺乏弹性，变薄有透明感，肠粘膜绒毛严重萎缩，胃底粘膜潮红充血或斑点状出血，胃内容物呈鲜黄色并混有大量乳白色凝乳块（或絮状小片），对养猪业危害极大。
猪流行性腹泻病毒经口和鼻感染后进入小肠，可在猪群中持续存在，各种年龄的猪都易感。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100％，尤其以哺乳仔猪最为严重且预后不良，多数不能耐过而死亡。育肥猪尽管发病率较高，但死亡率较低。母猪的发病率在15％～90％。本病主要在冬季多发，夏季也可发生。该病具有传染性强，发病迅速、仔猪死亡率高等特点。1973年首次在我国上海发生。2006先后多次在我国多地爆发流行，给养猪业造成了重大经济损失。
猪流行性腹泻，仅凭临床症状难以做出诊断，波及所有年龄猪（包括哺乳仔猪）的急性PED在临诊上不能与TGE相区分。实验室内通过直接显示PEDV或其抗原或抗体的检测可做出病原学诊断。直接IF和免疫组化技术用于哺乳仔猪小肠切片中PEDV的检测，但仅适于急性腹泻初期，尤其是发病3天内捕杀的患病仔猪小肠切片检测。对于自然死亡的仔猪由于其小肠绒毛严重萎缩，故对其检测结果不可靠。对腹泻仔猪粪便进行直接电镜观察可见PEDV粒子，但若病毒纤突丧失或不清晰，直接电镜检查较为困难。ELISA方法用于检测血样中的特异性抗体，既敏感、有可靠，且可检测大量样本，同时也适于母猪奶中免疫球蛋白的检测。
目前，疫苗免疫依然是我国猪流行性腹泻防控的最主要手段。采集免疫后猪血液样本，分离血清，并检测特异性的血清抗体，也是目前监控猪流行性腹泻主要的手段，对猪流行性腹泻疫苗免疫效果评价、免疫程序制定、流行状态监测均具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法。
一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法，包括如下步骤：
1）猪流行性腹泻病毒抗原的制备和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板；
2）将待测动物保定，从其前腔静脉处取血，将采集到的血液处理后获得血清一抗，保存备用；
3）将血清一抗，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:50稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，37℃饱和湿度反应1小时，以PBST洗涤备用；
4）将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:10000稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，37℃饱和湿度反应2小时，以PBST洗涤备用；
5）将TMB显色剂按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，避光反应25分钟，随后每个反应孔加入100ul 1M浓硫酸，终止反应；
6）放入酶标仪中，读取OD650数据，判定结果。
所述的步骤1）为：以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪流行性腹泻病毒纯化抗原至106 TCID50/ml，以100ul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，并以质量百分比浓度5%的脱脂奶粉的PBST溶液封闭，获得ELISA反应的抗原基质，置于4℃备用。
所述的步骤3）为：以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将待测猪血清中所含猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体1:50稀释后，按编号以100ul/孔的浓度加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37℃饱和湿度反应1小时，以PBST洗涤备用；
所述的步骤4）为：以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体1:10000稀释后，按顺序以100ul/孔的浓度加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37℃饱和湿度反应2小时，以PBST洗涤备用；
所述的步骤6）为：将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的OD650数值，并根据以下公式判定结果：已知阴性样品的OD值≤0.4，而且已知阳性样品的OD值≥1.0；在上述条件成立的情况下，如果待检血清或初乳样品与已知阳性样品OD值的比值S/P≥0.5，则判为阳性；否则判为阴性。
本发明提供的猪流行性腹泻病毒血液IgG抗体采集和检测方法，相对于传统的猪流行性腹泻病毒检测方法，具有以下优点：1）可以对整个猪群实行大面积采样，避免猪群的屠宰采样；2）血液样品对温度、环境、污染物的抵抗力更强，运输和保存更方便；3）猪流行性腹泻病毒血液IgG抗体检测比抗原检测更快速、敏感、可靠；4）量化猪群的猪流行性腹泻免疫水平，所得数据更准确客观全面；5）可监控猪群的猪流行性腹泻免疫动态，预知猪群的免疫动向及管理。
附图说明
图1是检测猪血液中猪流行性腹泻病毒IgG特异性抗体的方法的过程示意图。
具体实施方式
检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法包括如下步骤：
1）猪流行性腹泻病毒抗原的制备和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板；
2）将待测动物保定，从其前腔静脉处取血，将采集到的血液处理后获得血清一抗，保存备用；
3）将血清一抗，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:50稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，37℃饱和湿度反应1小时，以PBST洗涤备用；
4）将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:10000稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，37℃饱和湿度反应2小时，以PBST洗涤备用；
5）将TMB显色剂按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，避光反应25分钟，随后每个反应孔加入100ul 1M浓硫酸，终止反应；
6）放入酶标仪中，读取OD650数据，判定结果。
所述的步骤1）为：以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪流行性腹泻病毒纯化抗原至106 TCID50/ml，以100ul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，并以质量百分比浓度5%的脱脂奶粉的PBST溶液封闭，获得ELISA反应的抗原基质，置于4℃备用。
所述的步骤3）为：以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将待测猪血清中所含猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体1:50稀释后，按编号以100ul/孔的浓度加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37℃饱和湿度反应1小时，以PBST洗涤备用；
所述的步骤4）为：以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体1:10000稀释后，按顺序以100ul/孔的浓度加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37℃饱和湿度反应2小时，以PBST洗涤备用；
所述的步骤6）为：将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的OD650数值，并根据以下公式判定结果：已知阴性样品的OD值≤0.4，而且已知阳性样品的OD值≥1.0；在上述条件成立的情况下，如果待检血清样品与已知阳性样品OD值的比值S/P≥0.5，则判为阳性；否则判为阴性。
实施例
1）以商品化的猪流行性腹泻病毒，107 TCID50/ml（半数细胞感染量/毫升）浓度，感染Vero细胞，培养72小时后，收集病毒液，4000g离心10min，取上清；35000g离心1h，获得纯化病毒，并滴定TCID50。将抗原以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释至106 TCID50/ml，以100ul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，饱和湿度下，4℃孵育16h。随后弃去包被液，拍干ELISA板，加入以PBST (pH7.3 PBS，0.05% tween-20) 稀释的5%脱脂奶粉溶液（PBST溶）200ul/孔，于22-28℃封闭1h。弃去封闭液，拍干ELISA板，每孔加入350 ul洗液（PBST），洗涤1 min×3次，拍干ELISA板，置于4℃备用，见图1。
2）将猪进行保定，先用75%酒精棉球对前腔静脉入针处进行局部消毒，再用干棉球擦干，用大拇指自始至终压住前腔静脉近心端，然后用消毒过的针头急刺远心端的前腔静脉，血液流出第一、二滴弃去后，接血，使血液沿着瓶壁流入，采到7毫升血液后，松开大拇指，血液即停止流出，用5%碘酊棉球压一下针孔即达到消毒止血。给采得血液注明号码，立即静置使其凝固，然后带到实验室，冬季于温暖处，夏季置于冷暗处，使血清析出。经10-12小时，将析出的血清倒入另一只消毒空瓶中。将血清编码，用于初步保存和运输（常温下、6小时内，或4℃下、72小时内运至实验室）。将血清以3000g离心5min，取上清，获得血清一抗，并与4℃（<7d）或-20℃（<60d）保存备用。
3）将处理备用的血清一抗，以3%脱脂奶粉溶液（PBST溶）1:50稀释后，按编号加入抗原包被的反应板上，100ul/孔，每个样品3个重复，同时设置阴性和血清阳性抗体对照各2孔。饱和湿度下，22-28℃孵育1h。随后弃去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 350 ul洗液（PBST），洗涤1 min×4次，拍干ELISA板，备用，见图1。
4）将辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以3%脱脂奶粉溶液（PBST溶）为稀释液，作1:10000倍稀释后，按100ul/孔加入到上述一抗包被的反应孔中，22-28℃/饱和湿度反应2h，随后弃去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 350 ul洗液（PBST），洗涤1 min×5次，拍干ELISA板，备用，见图1。
5）将TMB显色液按100ul/孔加入到上述反应孔中，室温避光反应25min，随后加入100ul/孔终止液（1M浓硫酸），终止反应，见图1。
6）将终止后的反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的OD650数值，并根据以下公式判定结果：已知阴性样品的OD值≤0.4，而且已知阳性样品的OD值≥1.0；在上述条件成立的情况下，如果待检血清样品与已知阳性样品OD值的比值S/P≥0.5，则判为阳性；否则判为阴性。

Claims (5)

1.一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）猪流行性腹泻病毒抗原的制备和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板；
2）将待测动物保定，从其前腔静脉处取血，将采集到的血液处理后获得血清一抗，保存备用；
3）将血清一抗，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:50稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，37℃饱和湿度反应1小时，以PBST洗涤备用；
4）将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:10000稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，37℃饱和湿度避光反应2小时，以PBST洗涤备用；
5）将TMB显色剂按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，避光反应25分钟，随后每个反应孔加入100ul 1M浓硫酸，终止反应；
6）放入酶标仪中，读取OD650数据，判定结果。
2.根据权利要求1所述的一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法，其特征在于，所述的步骤1）为：以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪流行性腹泻病毒纯化抗原至106 TCID50/ml，以100ul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，并以质量百分比浓度5%的脱脂奶粉的PBST溶液封闭，获得ELISA反应的抗原基质，置于4℃备用。
3.根据权利要求1所述的一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法，其特征在于，所述的步骤3）为：以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将待测猪血清中所含猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体1:50稀释后，按编号以100ul/孔的浓度加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37℃饱和湿度反应1小时，以PBST洗涤备用。
4.根据权利要求1所述的一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法，其特征在于，所述的步骤4）为：以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体1:10000稀释后，按顺序以100ul/孔的浓度加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37℃饱和湿度反应2小时，以PBST洗涤备用。
5.根据权利要求1所述的一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法，其特征在于，所述的步骤6）为：将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的OD650数值，并根据以下公式判定结果：已知阴性样品的OD值≤0.4，而且已知阳性样品的OD值≥1.0；在上述条件成立的情况下，如果待检血清样品与已知阳性样品OD值的比值S/P≥0.5，则判为阳性；否则判为阴性。
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